Der adoptive Transfer von T-Zell-Rezeptor (TZR) modifizierten T-Zellen gegen krebsspezifische Antigene ist ein vielversprechender Ansatz in der Immuntherapie. Geeignete Zielmoleküle für diese Therapie sollten wichtig für das Überleben von Krebszellen sein und zudem in ausreichenden Mengen auf der Zelloberfläche exprimiert werden, um von T-Zellen erkannt zu werden. Die Identifizierung dieser Zielmoleküle ist jedoch eine Herausforderung und erfordert eine intensive Charakterisierung, um eine ausreichende Prozessierung und Präsentation auf den Tumorzellen zu validieren. Ziel dieser Arbeit war, HLA-A2-spezifische Neoepitope als Zielmoleküle für adoptive T-Zell-Therapie zu validieren. Dafür wurden erfolgreich Immunantworten in einem humanen transgenen Mausmodell nach Peptidimmunisierung induziert und TZRs mit hoher Affinität isoliert. Trotz einer hohen funktionellen Avidität von H3.3K27M-spezifischen T-Zellen wurde keine Erkennung von Tumorzellen erreicht. Zweitens wurden TZR-transduzierte T-Zellen gegen die häufige Melanommutation Rac1P29S isoliert, welche zytotoxisch gegen Melanomzelllinien waren. Letztlich wurde beobachtetet, dass TZRs mit hoher Affinität gegen gespleißte Kras und Rac2 Epitope, welche durch Proteasom-katalysiertes Peptidspleißen erzeugt wurden, keine Immunantwort gegen endogen exprimierte Mutationen hervorrufen konnten. Daraus lässt sich schließen, dass gespleißte Epitope wahrscheinlich seltener vorkommen als zuvor angenommen und daher möglicherweise irrelevant für die adoptive T-Zelltherapie sind. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Auswahl von Zielmolekülen für die adoptive T-Zell-Therapie mit Hilfe reverser Immunologie auf der Grundlage von Bindungsalgorithmen und der Häufigkeit von Mutationen allein nicht ausreicht. Daher sind vor der Isolierung und Charakterisierung von TZRs zusätzliche Strategien wie z.B. die Analyse des MHC-Immunopeptidoms erforderlich, um die Auswahl geeigneter Zielmoleküle für die T-Zelltherapie zu verbessern. / Adoptive transfer of T cell receptor (TCR)-engineered T cells against tumour-specific neoantigens is a promising approach in cancer immunotherapy. Ideally, targeted antigens are crucial for cancer cell survival and are generated in sufficient amounts to be recognised by T cells. However, the identification of ideal targets remains challenging and requires intensive characterisation to validate sufficient antigen processing and presentation by the tumour cells. This thesis focused on the validation of HLA-A2 binding neoepitopes carrying the recurrent cancer mutations H3.3K27M, Rac1P29S, Rac2P29L or KrasG12V as targets for adoptive T cell therapy. After peptide immunisation, immune responses in a human transgenic mouse model were elicited and high-affinity TCRs successfully isolated. Although H3.3K27M-specific T cells showed high functional avidity, no recognition of cells endogenously expressing mutant H3.3 was achieved. Furthermore, a mechanism to target the common melanoma mutation Rac1P29S with a TCR raised against a heterologous mutation with higher peptide-MHC affinity was described. TCR-transduced T cells induced cytotoxicity against Rac1P29S expressing melanoma cell lines. Lastly, high-affinity TCRs specific for mutant Kras and Rac2 spliced epitopes generated by proteasome-catalysed peptide splicing were successfully isolated, however, TCR-transduced T cells did not induce an immune response against endogenously expressed mutant transgenes. The results indicate that spliced epitopes are probably less abundant than previously estimated and therefore may play a minor role in the generation of targets for adoptive T cell therapy. These data suggest that target selection using a reverse immunology approach based on binding algorithms and frequency of mutations alone is not sufficient. Thus, additional strategies to improve the selection of suitable targets such as the analysis of the MHC immunopeptidome are required prior to TCR isolation and characterisation.

Chemotherapien verursachen DNA-Schäden in Krebszellen, was zur Apoptose der meisten Zellen führt. Die überlebenden Zellen können in eine Therapie-induzierte Seneszenz (TIS) eintreten, die zum Zellzyklusarrest führt. Zellen in TIS weisen einen Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP) auf – eine erhöhte Proteinproduktion, die proteotoxischen Stress bedingt. Verbliebene seneszente Zellen könnten jedoch wieder in den Zellzyklus eintreten und ihr SASP kann entzündungsfördernd wirken. Da seneszente Zellen besonders auf Proteinabbau angewiesen sind, um eine zu hohe Proteotoxizität zu vermeiden, zielten wir auf Proteindegradierungswege mit einer sekundären Therapie ab, um TIS Zellen zu eliminieren. Mittels Bcl2-überexprimierender Lymphome aus dem transgenen Eμ-myc Maus-Modell, die nach Chemotherapie in Seneszenz eintreten, und des Vergleichs mit Lymphomen, die aufgrund einer genetischen Läsion nicht seneszent werden können. identifizierten wir eine verringerte proteasomale Aktivität in TIS, die mit Kennzeichen von proteotoxischem Stress korrelierte. Dabei hängt die daraus folgende Empfindlichkeit von TIS Zellen für proteasomale Hemmung von NF-κB regulierter SASP Produktion ab. Die Kombination aus proteasomaler Hemmung durch Bortezomib und einem Autophagieblocker zeigte einen additiven Effekt auf den Zelltod von TIS Zellen. Diese Ergebnisse konnten in vivo anhand verbesserten Überlebens durch TIS-nachfolgende Sekundärtherapie von mit Lymphomen inokulierten Mäusen bestätigt werden. Schließlich konnte das Prinzip der Seneszenz-spezifischen Beseitigung von Tumorzellen unter Einsatz von Bortezomib in zwei humanen Lymphomzelllinien untermauert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass seneszente Zellen auf eine intakte Proteinabbau-Maschinerie angewiesen sind und auf Veränderungen in proteasomaler Aktivität empfindlich reagieren. Diese Angreifbarkeit könnte in einer neuartigen, synthetisch lethalen Strategie ausgenutzt werden, um maligne Zellen effektiv zu eliminieren. / Chemotherapy causes DNA damage in cancer cells, causing apoptosis in most, but not all cells. Surviving cells can undergo therapy-induced senescence (TIS), an emergency mechanism that arrests the cell cycle. Cells in TIS exhibit a senescence-associated secretory phenotype (SASP) - a massive increase in protein production leading to proteotoxic stress. Sustained senescent cells might reenter the cell cycle, and their SASP can stimulate dangerous inflammation. Aiming to eliminate remaining TIS cells, we reasoned that they need to reduce their excessive protein burden and avoid proteotoxicity and we therefore targeted protein degradation pathways with a secondary treatment. Using Bcl2-overexpressing lymphomas from the Eμ-myc mouse transgenic model, which become senescent after chemotherapy, and comparing them to lymphomas that do not become senescent due to a genetic impairment, we found reduced proteasomal activity in TIS, correlating to hallmarks of proteotoxic stress, such as accumulation of protein aggregates and oxidized proteins. The consequential sensitivity of TIS cells to proteasome inhibition was dependent on NF-κB governed SASP production. Very significantly, combining proteasome inhibition by bortezomib with autophagy inhibition had an additive effect on susceptibility to rapid death after TIS. These findings were confirmed by in vivo treatments improving survival of mice carrying lymphomas that had been treated into TIS. Lastly, the senescent-specific clearance of cells by bortezomib following TIS induction was confirmed using two human, lymphoid cell lines, supporting the proof-of-principle. This study suggests that senescent cells are highly dependent on protein disposal and are hypersensitive to changes in proteasome activity. This vulnerability might be exploited in a novel synthetic lethality strategy to fully eliminate malignant cells.