Zunächst wurden mit Hilfe eines neuen Injektionssystems die Vorteile der Bolusgabe und der kontinuierlichen Applikation d-galaktosehaltiger Ultraschallsignalverstärker kombiniert und an einem klein- (Æ 0,86mm) und einem großlumigen (Æ 16 mm) Gefäßmodell die optimale Basis- und Bolusflußratenkombination für die Powerdopplersonographie evaluiert. Der Powerdopplersignalintensitätsverlauf verschiedener Infusionsprotokolle wurde subjektiv von drei Beobachtern einer sechsstufigen Skala zugeordnet. Objektive Intensitätsmeßdaten wurden mit einer CW-Dopplersonde und einem Computersystem gewonnen. Die 1 ml/min.-Basisinfusionsrate kam dem Optimalzustand am nächsten (Großlumenmodell: 70 %, Kleinlumenmodell: 100 % Grad-4-Plateau trotz geringer Standardabweichung der mittleren Spektraldopplerverstärkungsmeßwerte im Plateaubereich). Sie ermöglichte eine annähernd optimale Gefäßdarstellung mit ausreichendem Spielraum für mehrfache, optisch gut wahrnehmbare Bolusgaben (Optimalbolus: 300mg/ml, 2 ml/s, 1 s Injektionsdauer). Diese Ergebnisse lassen eine medizinische und ökonomische Optimierung des Signalverstärkereinsatzes in der Powerdopplersonographie erwarten. Anhand von tierexperimentellen Untersuchungen wurde die Zuverlässigkeit der nativen und der signalverstärkten Farbdopplersonographie bei der Visualisierung der intratumorösen Angioneogenese im Vergleich zur histologischen Vaskularisationsquantifizierung evaluiert. Zu diesem Zweck wurden Melanomzellen des Typs B16-F1 Mäusen intra- bzw. subkutan imjiziert und nach einer Wachstumsperiode in 54 Fällen sonographisch im B-Modus bezüglich Größe, Homogenität, Echogenität und Grenzechoschärfe und in der Farbdopplersonographie bezüglich intratumorös erkennbarer Gefäßzahl, Gefäßarchtektur und Gefäßanteil an der Tumorquerschnittsfläche (= percentage vessel area, PVA) analysiert. Die anschließende histologische Aufarbeitung erbrachte Vergleichsdaten hinsichtlich Größe, Nekrotisierung und Vaskularisation der Tumoren. Es fand sich eine signifikante Korrelation (p < 0,01) zwischen den makroskopisch und den sonographisch ermittelten Tumordurchmessern, jedoch zwischen Histologie und Sonographie bezüglich sonographisch erkannter Nekrosen nur, wenn diese mehr als 40 % des Tumors erfaßten. Nach Signalverstärkerapplikation stiegen die sonographisch erkennbare Tumorgefäßzahl, -architektur und die PVA signifikant an (p < 0,01), letztere bei den intrakutanen Tumoren um 483 % und bei den subkutanen um 373 %. Der histologische Vaskularisationsgrad korrelierte am stärksten (r = 0,686) von allen Farbdopplerparametern mit der signalverstärkten PVA (p < 0,01). Somit trug die Signalverstärkergabe zur Verbesserung der Korrelation der Ergebnisse der sonographischen und histologischen Vaskularisations- und Angioneogenesebeurteilung bei. Im klinisch-experimentellen Teil wurde prospektiv bei 83 malignitätssuspekten, kutan oder subkutan lokalisierten Raumforderungen unterschiedlichen, meist epithelialen Ursprungsgewebes mittels nativer und signalverstärkter Farbduplexsonographie eine Dignitätseinschätzung vorgenommen. Als Einstufungskriterien wurden diverse B-Modus- und Farbdopplerkriterien, u.a. intratumorös erkennbare Gefäßzahl und PVA, verwendet. Die Diagnosesicherung erfolgte durch Histologie oder Verlaufskontrolle. Während weder die B-Modus-Kriterien noch die Dopplerspektralanalyse für die Dignitätseinschätzung geeignet erschienen, trugen die Farbdopplerparameter und besonders die PVA nach Signalverstärkergabe zur Dignitätsbestimmung bei, wobei die erkennbare Gefäßzahl nach Signalverstärkergabe signifikant (p < 0,01) zunahm. Als ungeeignet erwiesen sich diese Kriterien jedoch bei entzündlichen und angiomatösen Raumforderungen und epithelialen Rezidivtumoren. Insgesamt liefert die signalverstärkte Farbdopplersonographie wesentliche zusätzliche Informationen bezüglich Angioneogenese und Dignität von Raumforderungen der Haut und ihrer Anhangsgebilde, insbesondere die signalverstärkte semiquantitative Vaskularisationsanalyse. Sie ist der B-Modus-Sonographie und der Spektraldoppleranalyse überlegen. Die Signalverstärkergabe führt zu einer deutlichen Sensitivitätserhöhung. / A new injection system combines the advantages of bolus and of continuous application of ultrasound contrast agents. This study evaluated the optimal combination of basic and bolus flow rates in power Doppler sonography using two different types of vitro vessel models. The flow of an in vitro circulation model consisting of a wide or small lumen vessels was visualized by power Doppler ultrasound. The intensity of colour Doppler signal was assessed subjectively by three observers using a six step scale (optimal: degree 5). The objective signal intensity was measured by a CW-Doppler probe and a computed sytem. Using a basic flow rate of 1 ml/min., approximately optimal results were reached. This basic flow rate enabled an almost optimal visualization of the vessel lumen with sufficient free range for repeated, well visible bolus injections. Thus, the use of the new injection system combining bolus and continous injection of contrast agent improves medical and economic use of signal enhancing agents in power Doppler sonography. The aim of the next study was to evaluate the reliability of plain and enhanced colour Doppler sonography in visualization of intratumoral vascularization as a sign of malignant angioneogenesis. Therefore, malignant melanomas of the histological type B16-F1 which had been implanted in mice were examined by sonography. The majority of these tumours was localized intracutaneously, the minority subcutaneously. Various B-mode aspects, colour Doppler criteria, and spectral Doppler parameter were evaluated before and after i.v.-application of an ultrasound signal enhancer. After sonographic examination, all tumors were analyzed histologically with semiquantitative grading of tumoral vascularization. Despite the higher mean volume of the subcutaneous tumours, the percentage of tumors with visible intratumoral vessels was not higher than in intracutaneous tumors on plain images. Enhanced, the sonographical vascularization of subcutaneous tumors seemed to be superior to this of the intracutaneous. The signal enhanced mode was definitely superior to plain Doppler in showing the intratumoral vessels as a sign of angioneogenesis. The intratumoral vascular structure could be sufficiently analyzed the minority of all tumors by plain Doppler, but in more than 90 % after application of the signal enhancing agent. Intracutaneous tumors had a more compact vascular structure than subcutaneous. Despite the missing direct correlation between the sonographically and the histologically determined degree of tumour vascularization the correlation was improved after application of the signal enhancer. Only the enhanced colour Doppler sonography provides valuable noninvasive information about angioneogenetic hypervascularization in experimental melanomas. The third study evaluated colour Doppler criteria to differentiate between malignant and benign skin tumors determining the extent of the intratumorous vascularization. The B-mode sonomorphology and the extent of the vascularization in color Doppler of clinically potentially malignant tumours of the cutaneous and subcutaneous structures were analyzed and quantified by different methods. After application of the signal enhancing agent, counting the intratumoral vessels visible on one ultrasound slice led to the highest sensitivity of all used criteria but the specificity was poor. The highest specificity and diagnostic accuracy of all used criteria were obtained using the criterion "percentage vessel area > 5,0 %" after excluding all inflamed lesions by clinical aspects. Plain colour Doppler increased the specificity but the sensitivity decreased to a not acceptable level. The analysis of the B-mode morphology and spectral Doppler parameter of intratumoral vessels did not contribute to differential diagnosis. Signal enhanced colour Doppler sonography is a valuable tool in pretherapeutic assessment of cutaneous lesions. This method can be relevant for therapy and prognosis. The application of the signal enhancing agent increases significantly (p < 0.01) the sensitivity. This method is not useful in assessing benignity or malignancy of inflamed lesions and angiomas.

Hinsichtlich einer effizienten Nachsorge von Melanompatienten existieren entsprechende Empfehlungen, aber auch widersprüchliche Stellungnahmen hinsichtlich Intervalllänge und Umfang der Nachsorge. Das Melanom ist einer der malignen Tumoren mit den am schnellsten steigenden Inzidenzraten, was auch eine Steigerung der Mortalität bedingt. In der vorliegenden Arbeit werden neue diagnostische Strategien geprüft und in ein vorbestehendes Melanomnachsorgeschema aufgenommen, um Patientenbetreuung, die frühe Entdeckung von Metastasen, aber auch die Raten an rezidivfreiem - und Gesamtüberleben zu verbessern. In einer großen prospektiven Studie von 4 Jahren Dauer konnte der Ultraschall von Lymphknoten, Weichteilgewebe und in transit Strecken eher als die rein klinische Untersuchung Metastasen entdecken und führte auf diese Weise zu einer Verbesserung des rezidivfreien- und des Gesamtüberlebens. Die Feinnadelaspirationszytologie (FNAC) wurde in einer weltweit, zahlenmäßig führenden Studie durchgeführt um die verdächtigten Läsionen tatsächlich zu diagnostizieren. Dies geschah hierbei nahezu nicht-invasiv. Hohe Zahlen an Sensitivität und Spezifität dieser Methode konnten erreicht werden und eine Diagnose konnte auch in sehr kleinen Läsionen oder solchen in einer schwierigen Position etabliert werden. Bei letzteren Läsionen erwies sich auch die Hinzunahme einer ultraschallgesteuerten Drahtmarkierung als nützliches Procedere. Auf diese Weise konnte die Exzision dieser Läsionen in komplizierter Lage vereinfacht werden. Eine weitere Studie untersuchte die begleitende Anwendung der Untersuchung einer seriellen reverse Transskriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) zum Nachweis von Tyrosinase aus peripherem Blut von Hochrisikomelanompatienten. Patienten, die im Blut mindestens einmal positiv getestet wurden, zeigten ein signifikant höheres Risiko, krankheitsspezifisch am Melanom zu versterben, als Patienten, die stets ein negatives Resultat aufwiesen. Die Tyrosinase RT-PCR Untersuchungen konnten auch an geringen Mengen Material wie Feinnadelaspiraten oder dem Feinnadelpunktaten des Sentinel Node erfolgreich durchgeführt werden. Alle aufgezeigten Methoden erwiesen sich als effektiv und wurden deswegen in das bestehende Nachsorgeprogramm der Melanompatienten an der Charité, Berlin aufgenommen. / There exist recommendations but also controversies about the necessity and effectiveness of a distinctive melanoma follow-up programme. Melanoma is one of the fastest increasing malignant tumours with increasing rates of incidence and mortality. In this work new strategies are implemented in a pre-existing melanoma follow-up schedule in order to ameliorate the care for patients, the detection of metastases and the relapse-free and overall survival rates. In a large prospective study taking four years the ultrasound of lymph nodes, soft tissues and in transit distances was shown to earlier detect recurrences than the clinical examination thus significantly enhancing recurrence-free and overall survival. Fine needle aspiration cytology (FNAC) has been performed in a large, worldwide leading study to verify the suspected lesions in a nearly non-invasive way. High percentages in sensitivity and specificity could be achieved also in small lesions or lesions in an unfavourable localization. The latter lesions have been shown to be better detectable by a marking procedure. An anchor wire has been sonographically placed within such a lesion to improve the successful excision. A further study examined the value of serial RT-PCR testing from peripheral blood in melanoma patients. Patients, who have been tested at least once positive, had a higher risk ratio to die disease-specifically from melanoma. This result has been highly significant. RT-PCR examinations could also be applied in small amounts of material such as fine needle aspirations or material of FNA C of the sentinel node. All modalities could be proven to be effective and therefore are included in the melanoma follow-up programme of the Charité, Humboldt University of Berlin.

Zielsetzung dieser Arbeit war es, das Verhalten der in modernen Sonnenschutzmitteln eingesetzten Titandioxid-Mikropartikel mit quantitativen Methoden zu bestimmen, um Aussagen über ihre Eignung zu erhalten. Dabei stand die Frage nach der Verteilung der Substanz innerhalb des Stratum corneum im Mittelpunkt der Untersuchungen. Insbesondere war wegen der bekannten photokatalytischen Aktivität von Titandioxid zu klären, ob ein Kontakt mit den lebenden Bereichen der Haut ausgeschlossen werden kann. Für die Messungen wurden zwei kommerziell genutzte, unterschiedlich beschichtete Titandioxid-Mikropartikel eingesetzt. Eine wesentliche Voraussetzung für diese Untersuchungen war die Anwendung der Abrissmethode (Tape stripping) in Kombination mit der spektroskopischen Bestimmung der Extinktion im sichtbaren Bereich zur Berechnung des Hornschichtprofils. Die Konzentration der Titandioxid-Partikel wurde mit Hilfe von Röntgenfluoreszenz-Messungen bestimmt. So war es erstmals möglich, in vivo standardisierte und reproduzierbare Untersuchungen zum Penetrationsverhalten von beschichteten Titandioxid-Mikropartikeln in die Hornschicht der menschlichen Haut durchzuführen. Durch Langzeitapplikation der Substanzen und die Beobachtung der Titandioxid-konzentrationen in der Hornschicht über mehrere Tage konnten auch Aussagen zum Penetrationsverhalten der applizierten Mikropartikel gemacht werden. Es wurde eindeutig gezeigt, dass die untersuchten Substanzen unabhängig von ihrer Struktur, von ihrer Beschichtung und vom Probanden hauptsächlich in den obersten Schichten des Stratum corneum lokalisiert sind. Nach Klärung dieser grundsätzlichen Fragen war es notwendig, die Ursache für das Auftreten extrem geringer Titandioxid-Konzentrationen auf Abrissen zu bestimmen, die aus tieferen Schichten des Stratum corneum entnommen wurden. Durch die Kombination der Abrissmethode mit einem speziellen Färbeverfahren und der Laser-Scan-Mikroskopie ergaben sich deutliche Hinweise auf die Bedeutung der Follikelkanäle für das beobachtete Phänomen. Röntgenspektroskopische Untersuchungen an Biopsien zeigten, dass diese Mikropartikel in die Haarfollikel eindringen und damit Bereiche unterhalb des Stratum corneum erreichen. Hierbei wurden die Mikropartikel in dieser Region nur in Follikelkanälen, nicht aber im Bereich der lebenden Zellen nachgewiesen. Diese Ergebnisse belegen, dass Titandioxid nur in einzelne Follikelkanäle penetriert, eine Aussage, die im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen erstmals beschrieben wurde. In Übereinstimmung mit der Zielsetzung der Arbeit konnte unter Einsatz unterschiedlicher Untersuchungsmethoden gezeigt werden, dass die beschichteten Titandioxid-Mikropartikel im oberen Bereich der Hornschicht lokalisiert sind und damit als hocheffiziente Lichtschutzfilter den Schutz der darunter liegenden lebenden Bereiche der Haut garantieren. Der sichere Nachweis der Titandioxid-Mikropartikel innerhalb einzelner Follikelkanäle besitzt grundsätzliche Bedeutung für das Verständnis von Penetrationswegen. / The objective of this work was to determine the behaviour of titanium dioxide microparticles, used in modern sunscreen agents, with quantitative methods in order to receive statements about their suitability. The focal point of the investigations was the question on the distribution of the substance within the stratum corneum. Because of the well-known photocatalytic activity of titanium dioxide, our aim was to clarify whether a contact with the living cells of the skin could be excluded. For these measurements, two commercial titanium dioxide micro particles were used, covered with different coating materials. The calculation of the stratum corneum profile was a substantial prerequisite for these investigations. This was done by application of the tape stripping method in combination with the spectroscopic determination of the absorption in the visible range. The concentration of the titanium dioxide particles on the tape strips was determined by X-ray fluorescence measurements. In this manner it was possible for the first time, to perform standardized and reproducible in vivo measurements to investigate the penetration behaviour of coated titanium dioxide micro particles into the horny layer of the human skin. Predications could be made about the penetration behaviour of the applied micro particles by observation of the titanium dioxide concentrations in the stratum corneum during several days after long-term application of the substances. It could be shown that the examined substances were localized mainly in the upper layers of the stratum corneum, independently of their structure, coating and the volunteers. After clarifying these basic questions, it was necessary to explain the occurrence of extremely small concentrations of titanium-dioxide on tape strips, which were taken from deeper layers of the stratum corneum. This observed phenomenon was investigated by combining tape stripping with a selective staining of the tapes and with laser scanning microscopy. Investigations of a biopsy with x ray fluorescence measurements showed that the micro particles penetrate into the hair follicles, and in this manner reached areas below the stratum corneum. In this region, the micro particles were found only in follicle channels, but not within the area of the living cells. These results prove that titanium dioxide micro particles only penetrate into single follicle channels, a statement, which has been described here for the first time. In agreement with the objective of this thesis, it was shown, that the coated titanium dioxide micro particles were localized within the upper area of the horny layer and as high efficient sunscreen filters consequently guarantee, the protection of the living areas of the skin below. The proof of the titanium dioxide micro particles within individual follicle channels has basic importance for the understanding of the penetration pathways.

Seit Anfang der 90-iger Jahre ist bekannt, dass nichtsteroidale Antirheumatika die Inzidenz des kolorektalen Karzinoms vermindern können. Diese antitumoröse Aktivität wird wahrscheinlich über die Cyclooxygenase-2 (COX-2) vermittelt, welche die Biosynthese von Prostaglandin H2, einer Vorstufe der Prostanoide, katalysiert. Eine Überexpression der COX-2 wurde für verschiedene Karzinome beschreiben. In dieser Studie wurde die Expression und tumorbiologische Relevanz der COX-2 im malignen Melanom, als Vertreter nichtepithelialer Tumoren, untersucht. Im Western blot wurde COX-2 Protein in den sechs untersuchten Melanomzelllinien nachgewiesen. Mittels eines spezifischen ELISAs wurde PGE2 im Überstand der Zelllinien nachgewiesen. Die PGE2-Biosynthese wurde durch den COX-2-spezifischen Inhibitor NS 398 konzentrationsabhängig inhibiert. Die IC50 der COX-2 für NS 398 wurde mit etwa 6 microM bestimmt. NS 398 inhibierte die Matrigelinvasion aller sechs Melanomzelllinien, ohne Einfluss auf die Proliferation zu haben. Die Invasionshemmung war PGE2-unabhängig, weil i) exogenes PGE2 die Invasionshemmung nicht wieder aufhob, ii) die erforderliche Konzentration von NS 398 zur Invasionshemmung im 8-fachen Bereich der IC50 der COX-2 lag. Die COX-2 ist Melanomzellen konstitutiv exprimiert und synthetisiert PGE2. NS 398 hemmt die Invasion von Melanomzellen in PGE2-unabhängiger Weise und könnte somit über ein sog. Non-COX-target wirken. / Accumulating evidence indicates that nonsteroidal anti-inflammatory drugs can reduce the incidence of colorectal cancers in humans. This antineoplastic activity is largely related to the inhibition of the inducible cyclooxygenase-2 (COX-2), which catalizes the biosynthesis of prostaglandin H2 the precursor of prostanoids. Elevated expression of COX-2 has been described in several types of epithelial tumors. In this study we evaluate the expression and function of COX-2 in malignant melanoma as a model of a non-epithelial tumor. With Western blot COX-2 protein was detected in all of six malignant melanoma cell lines. These cell lines produced prostaglandinE2 (PGE2) which was measured by a specific ELISA. PGE2 biosynthesis was blocked in a concentration dependent manner by the COX-2-specific inhibitor NS 398. The COX-2 IC50 for NS 398 was determined with 6 microM. In all six cell lines treatment with NS 398 reduced the invasion through a matrigel coated membrane while cell proliferation was not influenced. The inhibition of invasion was not mediated by PGE2, because i) exogenous PGE2 did not restore invasion, ii) the concentration needed for inhibitory effects on invasion was 8-fold higher than the IC50 of the COX-2. COX-2 is constitively expressed in malignant melanoma cells and is capable to produce PGE2. NS 398 reduces melanoma cell invsaion in a PGE2-independent manner, thus it likely further acts via a non-COX-target.

112 Patienten wurden im Rahmen von 2 prospektiven multizentrischen Phase-II Studien mit einer isolierten Extremitätenperfusion mit Tumornekrosefaktor (TNF) und Melphalan behandelt. Hiervon waren 49 Patienten an einem lokoregionär metastasierten Melanom und 63 Patienten an einem lokal fortgeschrittenen Weichgewebssarkom erkrankt. Bei Patienten mit regionären Metastasen eines Melanoms fand sich in 46 % eine komplette und in 20 % eine partielle Remission. Die mittlere lokoregionäre progressionsfreie Zeit war 32,3 Monate (Median 15,6 Monate). Sie war signifikant länger bei Patienten mit einer kompletten Remission (46,0 Monate, Median 30,2 Monate) im Vergleich zu Patienten mit einer partiellen Remission (15,2 Monate, Median 16,1 Monate) oder Patienten mit unverändertem Befund (7,2 Monate, Median 6,0 Monate). Die Gesamt-Überlebenszeit der Patienten mit Melanom betrug im Mittel 42,6 Monate (Median 24,4 Monate) und die 5-Jahres-Überlebensrate 42 %. Die klinische Ansprechrate der Patienten mit Weichgewebssarkomen betrug 44,5 %. Bei kombinierter Analyse der klinischen und histologischen Remission betrug die Gesamtansprechrate in der Gruppe der Patienten mit Weichgewebssarkomen 60 % (21 % CR). Insgesamt war bei 86 % der Patienten mit Sarkomen (54/63 Patienten) ein extremitätenerhaltendes Vorgehen möglich. Die mittlere lokale progressionsfreie Zeit betrug für alle 63 Patienten mit Weichgewebssarkom 63,7 Monate und die 5-Jahres-Progessionsfreiheit 72 %. Die mittlere Überlebenszeit der Patienten mit Sarkomen betrug 61,9 Monate und die 5-Jahres-Überlebenszeit 64 %. Wichtigste Einflussfaktoren auf die Überlebenszeit waren das Tumorgrading (p=0,016) und die Tumorgrösse (p=0,046). 94 der 112 behandelten Patienten hatten nach der Extremitätenperfusion im Bereich der Extremität eine regionale Toxizität Grad I-II nach Wieberdink und bei 18 Patienten kam es zu einer höhergradigen Gewebeschädigung (Grad III-IV). Die postoperativen Serumkonzentrationen von Creatinkinase (CK) und Myoglobin zeigten eine signifikante Korrelation zur regionalen Toxizität (p=0,007 bzw. 0,003). An systemischen Nebenwirkungen der isolierten Extremitätenperfusion mit TNF und Melphalan fiel vor allem eine Erhöhung der Leberwerte auf, mit Anstieg der Transaminasen und des Bilirubins bis zu WHO-Schweregrad III und IV. Einschränkungen der Lebersyntheseleistungen wurden nicht beobachtet. Alle Veränderungen waren spontan rückläufig. Leuko- und Thrombopenien Grad III/IV betrafen häufig Patienten mit einer systemischen Leckrate von > 5 % (29 % bzw. 21 %). Eine Überlegenheit der isolierten Extremitätenperfusion mit TNF und Melphalan beim Melanom gegenüber der Perfusion mit Melphalan alleine kann aus den vorliegenden Daten nicht abgeleitet werden. Die von uns festgestellte klinische Remissionsrate von 66 % ist nicht höher als in der Literatur angegeben. Durch die isolierte Extremitätenperfusion mit TNF und Melphalan kann bei ca. 80 % der behandelten Patienten mit lokal fortgeschrittenen und primär nicht resektablen Weichgewebssarkomen ein Extremitätenerhalt erreicht werden. Die hohe Rate auch histologisch belegter Remissionen bei diesen Patienten untermauert den Stellenwert dieser Therapie eindrucksvoll. / 112 patients were treated by isolated limb perfusion with tumor necrosis factor (TNF) and melphalan for locoregional metastases of melanoma (49 patients) or locally advanced soft tissue sarcoma (63 patients). Patients were treated in 2 prospective multicentric phase-II trials. For patients with intransit metastases from melanoma, complete response could be reached in 46 % and partial response in 20 %. Mean time to locoregional progression was 32.3 months (median 15.6 months). This was significantly longer for patients with complete response (46.0 months, median 30.2 months) when compared to patients with a partial response (15.2 months, median 16.1 months) or patients with no change (7.2 months, median 6.0 months). The mean overall survival time for patients with melanoma was 42.6 months (median 24.4 months) and the 5-year survival rate 42 %. The clinical response rate for sarcoma patients was 44.5 %, but on combined analysis of clinical and histologically confirmed response the overall response rate was 60 % (21 % CR). Limb salvage was possible in 86 % of the sarcoma patients (54/63 patients). The mean time to local progression was 63.7 months and the 5-year progression-free rate was 72 %. Mean overall survival time in this group was 61.9 months with a 5-year survival rate of 64 %. Grading (p=0,016) and tumor size (p=0,046) were the most important factors influencing survival. Regional toxicity after isolated limb perfusion was mild (Wieberdink grade I-II) in 94 of the 112 patients, and 18 patients had a more severe reaction (grade III-IV). Postoperative serum concentrations of creatinekinase (CK) and myoglobin were significantly correlated to regional toxicity (p=0.007 and 0.003). Elevated liver enzymes and bilirubin with levels up to WHO III and IV were the most profound systemic side effect of isolated limb perfusion with TNF and melphalan. All changes resolved completely. Leucopenia and thrombopenia grade III/IV were mainly observed in patients with a systemic leakage rate greater than 5 % (29 % resp. 21 %). In melanoma patients, the observed overall response rate of 66 % after isolated limb perfusion with TNF and melphalan is not superior to literature results for limb perfusion with melphalan alone. Thus, the superiority of this treatment cannot be confirmed for this indication. In contrast, limb salvage became possible in approx. 80 % of the patients with locally advanced and unresectable sarcoma. In addition, the high rate of histologically confirmed response in these patients underlines the value of this treatment modality.

IL-10 und TGF-beta sind immunsupprimierende Zytokine, die in verschiedenen Tumoren, u.a. im Melanom, entdeckt wurden und als Hauptursache für das Versagen der Anti-Tumorimmunantwort angesehen werden. Allerdings wurden divergente Daten auch berichtet. Um diese Diskrepanz zu erklären, wurde die Expression dieser Zytokine mittels quantitativer RT-PCR im Melanom und in Haut gesunder Individuen verglichen. Weiterhin wurde die Induktion beider Zytokine in Kokulturexperimenten mit Dendritische Zellen und T-Zellen zusammen mit Tumorzellen sowie ihr Einfluß auf das Immunsystem untersucht. Beide Zytokine sowie deren Rezeptoren wurden im Melanom exprimiert, aber im Vergleich mit gesunder Haut auf signifikant geringerem Level. Dementsprechend waren die Expressionen von IL-10-induzierbare-SOCS-3 und auch TGF-beta-induzierbare-SMAD-7 im Tumor gering und in der gesunden Haut hoch. T-Zellen, die mit einer großen Zahl an Tumorzellen kokultiviert wurden, entwickelten einen anergischen Zustand, aber ohne mit dem IL-10 oder TGF-beta Level zu korrelieren. Dendritische Zellen, die zusammen mit Tumorzellen kokultiviert wurden, wiesen eine gemischte Population an vollständig und unvollständig differenzierten iDCs auf, produzierten hohe Level IL-10 und konnten die CD4 T Zellproliferation weniger effizient induzieren. Trotzdem konnten sie zur Reifung induziert werden, wobei die Blockierung von IL-10 nicht die Fähigkeit der resultierenden, reifen DCs veränderte, CD4 T-Zellproliferation zu induzieren. DCs, deren Reifung in der Gegenwart von Tumorzellen induziert wurde, produzierten erhöhte Level an IL-10, dagegen gleiche oder verminderte Level an TGF-beta und waren effizienter in der Induktion der CD4 T-Zellproliferation. Die fehlende Korrelation von IL-10 und TGF-beta mit den Immundefiziten in situ und in vitro legt den Schluß nahe, ihre Rolle bei Krebs neu zu überdenken. / IL-10 and TGF-beta are immunosuppressive cytokines expressed in tumors including melanoma and, therefore, deemed major cause for failing anti-tumor immune responses. To re-evaluate their role, their expression was compared by quantitative RT-PCR in melanoma and skin of healthy individuals, their induction in dendritic cells and T cells co-cultured with tumor cells, and their effects on the immune cells were tested. Both cytokines as well as their receptors were expressed in melanoma at significantly lower levels than in healthy skin. Consequently, the expressions of IL-10-responsive SOCS-3 and TGF-beta-responsive Smad-7 were low in tumors but high in healthy skin. T cells co-cultured with tumor cells developed an anergic state but without increased IL-10 or TGF-beta expression. In vitro tumor-associated iDCs produced high IL-10 levels and were less efficient in inducing T cell proliferation. Nonetheless, they could be induced to mature, and blocking IL-10 did not alter the capacity of the resulting mDCs to induce T cell proliferation. mDCs co-cultured with tumor cells produced increased IL-10 but similar or decreased TGF-beta level and were more efficient in inducing T cell proliferation. The lack of correlation of IL-10 and TGF-beta with immune deficits in situ and in vitro suggests a necessity of re-evaluating their roles in cancer.

In den letzen Jahren gab es durch epidemiologische und molekularbiologische Studien vermehrt Hinweise, dass kutane humane Papillomviren (HPV) ursächlich an der Entstehung nicht-melanozytärer Hauttumore (engl. NMSC) beteiligt sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung molekularer Mechanismen der viralen Proteine E6 und E7 kutaner HPV-Typen. Die E6 oder E7 Gene der verschiedenen HPV-Typen 1, 4, 5, 8, 20, 38 und RTRX7 wurden untersucht. Natürliche Wirtszellen dieser Viren, humane primäre Keratinozyten (HPK) der Haut, wurden mit rekombinanten, für E6 oder E7 kodierenden Retroviren infiziert. Die Analysen erfolgten in Monolayer-Kultur (undifferenzierte Keratinozyten) oder in organotypischen Hautmodellen (Induktion der Keratinozytendifferenzierung). Die Expression von E6 oder E7 führte in Monolayer-HPK zu einer Verlängerung der Lebensspanne und zu einer deutlich erhöhten Verdoppelungsrate. Eine Telomeraseaktivierung, die charakteristisch für immortale Zellen ist, wurde nur in HPV 8 E6 positiven HPK nachgewiesen. In organotypischen Hautmodellen induzierte das E7 Protein von HPV 1, 4 und 38 starke Veränderungen in der Differenzierung sowie eine Zunahme der Proliferation. Weiterhin wurde eine Aufhebung der normalen Zellzykluskontrolle in suprabasalen HPV 5 E7 oder HPV 8 E7 beobachtet. Hinweise auf ein starkes invasives Potential von E7-infizierten HPK wurden für HPV 8 E7 bestätigt und für HPV 4 E7, HPV 38 E7 und RTRX7 E7 erweitert. Molekulare Mechanismen der viralen Gene E6 und E7 kutaner HPV unterscheiden sich von mukosalen Typen. Das Mehrstufenmodell der Karzinogenese beinhaltet eine Reihe fundamentaler Zelltransformationen, die für eine Tumorgenese nötig sind. In dieser Arbeit beschriebene Mechanismen der Modulation der Zelldifferenzierung und Zellproliferation durch die kutanen HPV-Typen 4, 5, 8 und 38 können unter Umständen zur Induktion und Progression früher Stadien von Plattenepithelkarzinomen (SCC) beitragen. / In the last years epidemiologic and molecular biological studies accumulated increasing evidence that cutaneous human papillomaviruses are etiologically involved in the formation of non-melanoma skin cancer (NMSC). The presented work aims to identify the underlying molecular mechanisms of the viral proteins E6 and E7 of cutaneous HPV types. The E6 and E7 genes of the different HPV types 1, 4, 5, 8, 20, and RTRX7, which are in vivo associated with cutaneous benign or malignant lesions, were studied. Natural host cells of these viruses, human primary keratinocyts (HPK) of the skin, were infected with recombinant E6 and E7 encoding retroviruses. The following analyses were performed in monolayer culture (non-differentiated keratinocytes) or in organotypic skin culture (induction of keratinocyte differentiation). The expression of E6 and E7 elongated the life span of monolayer HPK and significantly increased the doubling rate. An activation of the telomerase, characteristic for immortalized cells, was only detected in HPV 8 E6 positive cells. In organotypic skin cultures E7 of HPV 1, 4 and 38 induced drastic changes in differentiation and proliferation. Additionally an impairment of the normal cell cycle control in suprabasale HPV 5 E7 and 8 E7 cultures was seen. Hints for a strong invasive potential of E7 infected HPK were proven for HPV 8 E7 and expanded to HPV 4 E7, HPV 38 E7 and RTRX E7. The viral E6 and E7 genes of cutaneous and mucosal HPV types exhibit different molecular mechanisms. The multistep model of carcinogenesis includes a series of fundamental cell transformations necessary for tumorigenesis. Mechanisms for the modulation of cell differentiation and proliferation by cutaneous HPV types 4, 5, 8 and 38 described in this work could potentially contribute to the induction and progression of early stages of squamous cell carcinoma.

Für die Entstehung nicht-melanozytärer Hauttumore sind mehrere Risikofaktoren verantwortlich: UV-Exposition, Pigmentierung, Alter, Immunsuppression und möglicherweise Humane Papillomviren (HPV). Die molekularen Mechanismen der Tumorgenese des kutanen Plattenepithelkarzinoms (SCC) sowie der Präkanzerose Aktinische Keratose (AK) sind nur lückenhaft bekannt. Fokus dieser Arbeit ist die Untersuchung von SCC-Genexpressionsprofilen sowie der Einfluss kutaner HPV-Typen während der Karzinogenese bei immunkompetenten und immunsupprimierten, organtransplantierten Patienten. Durch Genexpressionsanalyse kutaner SCC, AK und normaler Haut konnten 118 differenziell exprimierte Gene in SCC mittels cDNA-Microarrays identifiziert werden. Bestätigt wurde die Expression von 11 aus 13 ausgewählten Genen (85%) mittels quantitativer real-time RT-PCR (qPCR), dabei konnte eine Korrelation der Genexpression mit der Progression der AK zum SCC für 3 Gene nachgewiesen werden. Dazu zählen das Gen Metalloproteinase-1, kodierend für ein Enzym, das in den Umbau von extrazellulärer Matrix involviert ist, das Protoonkogen RAB31 und das Tenascin-C (Tn-C) kodierende Gen Tn-C. Tn-C war im SCC-Gewebe an der Invasionsfront in Basalzellen sowie Keratinozyten im Stratum papillare und retikulare als Protein nachweisbar, nicht aber in normaler Haut. Die im Rahmen dieser Arbeit erstmalig nachgewiesene 2243 bp-Spleißvariante von Tn-C könnte aufgrund der primären Expression in SCC–Gewebe als diagnostischer Marker für SCC dienen. Diese Daten zeigen, dass simultane, multifaktorielle Dysregulationen von Genexpression und DNA-Reparatur, Zellzyklus und Proliferation, proteolytischen Enzymen und Adhäsionsmolekülen in SCC vorliegen. Ferner wurde die Expression von HPV in SCC und damit der kausale Zusammenhang einer HPV-Infektion mit der Hauttumorgenese untersucht. Das Infektionsmuster von SCC-Gewebe und normaler Haut mit spezifischen HPV-Typen erfolgte durch den Nachweis typenspezifischer HPV-DNA. Virale E6/E7-mRNA-Transkripte der kutanen HPV-Typen 8, 9 und 15 wurden in AK und SCC nachgewiesen. Dagegen konnten in HPV-DNA positiver, gesunder Haut oder Warzen keine HPV-Transkripte gefunden werden. Die Variantenanalyse des offenen Leserahmens von E6 identifizierte eine einzelne, bislang nicht beschriebene Punktmutation mit nicht bekannter Veränderung der Proteinstruktur. Die virale Aktivität der Onkogene E6 und E7 einiger kutaner Typen in AK und SCC weisen auf eine mögliche Rolle von HPV bei der kutanen Hautkarzinogenese hin. / During development of non-melanoma skin cancer, several risk factors are involved: UV-exposition, pigmentation, age, and potentially human papilloma virus (HPV). The molecular mechanisms underlying tumourgenesis in squamous cell carcinoma (SCC) and its pre-cancerosis actinic keratosis (AK) are not fully understood. In this study, the gene expression profile and HPV-infection status were analysed in SCC from immunocompetent and organ transplanted, immunocompromised patients.By global transcriptome analysis from cutaneous SCC, AK and healthy skin, 118 genes were identified differentially expressed in a cDNA-microarray. The expression of 11 out of 13 selected genes (85%) was investigated by real-time RT-PCR (qPCR) and the expression of three genes remarkably induced in SCC correlated with the progression to AK until SCC. These genes encoded for Metalloproteinase-1, which is involved in the remodelling of extracellular matrix, and the protooncogene RAB31 and Tenascin-C (Tn-C). Tn-C protein is expressed in SCC-tissue at the invasion front in basal cells and in keratinocytes in the Stratum papillare and retikulare, but not in healthy skin. This study, the 2243 bp Tn-C-specific splice-variant has for the first time detected in SCC, but not in normal skin. Thus it might serve as diagnostic marker of SCC progression. The data of the transcriptome analysis indicates that a simultaneous dysregulation of oncogene expression and DNA-repair, cell-cycle and proliferation, proteolysis and adhesion molecules exists in SCC. Additionally, the expression of HPV in SCC and thus the causal relationship between HPV-infection and tumourgenesis of SCC in immunocompromised patients was investigated. The HPV-infection pattern in SCC-tissue and normal skin was assessed by detection of DNA from cutaneous HPV-types. Viral E6/E7-mRNA-transcripts of the cutaneous HPV-types 8, 9, 15 were expressed selectively in AK and SCC. In contrast, no HPV-specific mRNA was present in HPV-DNA positive normal skin. The analysis of the open reading frame from the respective E6-protein genes unravelled one single pointmutation, which is not been characterized so far in terms of e.g. its impact on protein structure. The viral activity of the oncogenes E6 and E7 of cutaneous HPV-types indicates a potential function of HPV in the tumourgenesis of SCC in immunocompromised individuals.

Fragestellung: Es wird untersucht, ob die isolierte hypertherme Extremitätenperfusion (ILP) mit TNF-alpha und Melphalan eine akute systemische inflammatorische Reaktion (SIRS) auslöst. Weiterhin soll der Einfluß von zwei verschiedenen total intravenösen Narkoseverfahren sowie der Zusammenhang der unabhängig voneinander bestimmten Meßgrößen Herzindex/Sauerstoffverbrauchsindex (HI/VO2I) und Sauerstoffverbrauchsindex/Sauerstoffangebotsindex (VO2I/DO2I) beim Entstehen eines SIRS analysiert werden. Methodik: 73 Patienten, die sich einer ILP mit TNF-alpha und Melphalan in Allgemeinanästhesie unterzogen, wurden in diese klinische, retrospektive Untersuchung eingeschlossen. Ein erweitertes kardiopulmonales Monitoring, bestehend aus kontinuierlicher Thermodilution, kontinuierlicher indirekter Kalorimetrie, invasiver Blutdruckmessung sowie arterieller und gemischtvenöser Blutgasanalysen ermöglichte die Analyse von hämodynamischen, metabolischen und gasanalytischen Parametern an 8 definierten Zeitpunkten im Verlauf der ILP mit TNF-alpha und Melphalan. 21 Patienten erhielten eine Narkose mit Etomidate/Midazolam/Sufentanil/Pancuroniumbromid (N1), und bei 52 Patienten wurde die Narkose mit Propofol/Remifentanil/Cis-Atracurium (N2) durchgeführt. Ergebnisse: Während der ILP mit TNF-alpha und Melphalan kam es bei folgenden Parametern zu signifikanten Veränderungen in der systemischen Reperfusionsphase gegenüber den Ausgangswerten vor der extrakorporalen Zirkulation: Herzfrequenz, Herzindex, Temperatur, Gesamtsauerstoffaufnahme, pulmonale Sauerstoffaufnahme, Sauerstoffangebot, systemischer Gefäßwiderstand, pulmonalarterieller Mitteldruck, kardiale Füllungsdrücke, gemischtvenöser Kohlendioxid- und Sauerstoffpartialdruck, arterieller Kohlendioxid- und Sauerstoffpartialdruck, gemischtvenöse Sauerstoffsättigung, arterieller und gemischtvenöser Sauerstoffgehalt sowie arterieller pH- und Laktatwert. Bezüglich der Narkoseverfahren zeigte die Narkose N2 versus N1 signifikant geringere Herzfrequenzen und Herzindices, sowie signifikant erhöhte pulmonalarterielle Mitteldrücke, pulmonale und systemische Gefäßwiderstände. Die Korrelationen von HI/VO2I und VO2I/DO2I sind in der prä-Bypass-Phase gering, nehmen im Verlauf der ILP zu und erreichen zum Zeitpunkt der systemischen Reperfusion jeweils ihren Maximalwert. Schlußfolgerungen: Die ILP mit TNF-alpha und Melphalan kann als dynamisches in-vivo Modell für das Entstehen einer SIRS-Reaktion aufgefaßt werden. Die inflammatorische Antwort ist in ihrem Ausmaß eher gering und erreicht nach Aufhebung der extrakorporalen Zirkulation mit systemischer Reperfusion der behandelten Extremität ihr Maximum. Die Überwachung der Teilkreisläufe, ein erweitertes hämodynamisches Monitoring sowie forcierte intravenöse Volumentherapie in der Reperfusionsphase lassen dieses Behandlungsverfahren für die Patienten in Allgemeinanästhesie sicher erscheinen. Beide beschriebenen Narkoseverfahren sind für diese operative Therapie geeignet. Der Zusammenhang von HI/VO2I sowie VO2I/DO2I ist im Verlauf der ILP gering, kann sich aber mit Zunahme der inflammatorischen Reaktion verstärken. / objective: To determine whether the isolated hyperthermic limb perfusion (ILP) with tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) and melphalan causes an acute systemic inflammatory response syndrome (SIRS)? Also analysed will be the influence of two total intravenous anaesthesias and the correlation of independent measured values cardiac index/oxygen consumption index (HI/VO2I) and oxygen consumption index/oxygen delivery index (VO2I/DO2I). design: Retrospective review of hemodynamic, metabolic and blood gas values from 73 patients, undervented isolated hyperthermic limb perfusion of leg with TNF-alpha and Melphalan in general anaesthesia. methods: Cardiopulmonary monitoring consisted of continuous thermodilution, continuous calorimetry, arterial pressure and arterial as well as admixed blood-gas analyses. Values were measured on 8 time points in the course of ILP. In 21 patients anaesthesia was carried out with drug-combination of Etomidate/Midazolam/Sufentanil/Pancuroniumbromid (N1), and 52 patients were given anaesthesia with Propofol/Remifentanil/Cis-atracurium (N2). results: The following values changed significantly after limb-reperfusion compared with the baseline: heart rate, cardiac index, temperature, oxygen consumption, pulmonary oxygen consumption, oxygen delivery, systemic vascular resistance, mean pulmonary arterial pressure, precardial pressures, admixed carbon dioxide pressure, admixed oxygen pressure, arterial carbon dioxide pressure, arterial oxygen pressure, admixed oxygen saturation, arterial and admixed oxygen content as well as arterial pH- and lactat. conclusions: The isolated hyperthermic limb perfusion with TNF-alpha and melphalan may be used as a dynamic in-vivo model for the development of an SIRS. The inflammatory response is slight and reached the maximum after reperfusion of treated limb. Monitoring of the two circulations, extended cardiopulmonary monitoring and intravenous volumetherapie in the reperfusion time makes this cancer treatment in general anaesthesia safe. Both anaesthesia are suitable. The correlations of HI/VO2I as well as VO2I/DO2I are low in the beginning and rise with the increase of the inflammatory response.