112 Patienten wurden im Rahmen von 2 prospektiven multizentrischen Phase-II Studien mit einer isolierten Extremitätenperfusion mit Tumornekrosefaktor (TNF) und Melphalan behandelt. Hiervon waren 49 Patienten an einem lokoregionär metastasierten Melanom und 63 Patienten an einem lokal fortgeschrittenen Weichgewebssarkom erkrankt. Bei Patienten mit regionären Metastasen eines Melanoms fand sich in 46 % eine komplette und in 20 % eine partielle Remission. Die mittlere lokoregionäre progressionsfreie Zeit war 32,3 Monate (Median 15,6 Monate). Sie war signifikant länger bei Patienten mit einer kompletten Remission (46,0 Monate, Median 30,2 Monate) im Vergleich zu Patienten mit einer partiellen Remission (15,2 Monate, Median 16,1 Monate) oder Patienten mit unverändertem Befund (7,2 Monate, Median 6,0 Monate). Die Gesamt-Überlebenszeit der Patienten mit Melanom betrug im Mittel 42,6 Monate (Median 24,4 Monate) und die 5-Jahres-Überlebensrate 42 %. Die klinische Ansprechrate der Patienten mit Weichgewebssarkomen betrug 44,5 %. Bei kombinierter Analyse der klinischen und histologischen Remission betrug die Gesamtansprechrate in der Gruppe der Patienten mit Weichgewebssarkomen 60 % (21 % CR). Insgesamt war bei 86 % der Patienten mit Sarkomen (54/63 Patienten) ein extremitätenerhaltendes Vorgehen möglich. Die mittlere lokale progressionsfreie Zeit betrug für alle 63 Patienten mit Weichgewebssarkom 63,7 Monate und die 5-Jahres-Progessionsfreiheit 72 %. Die mittlere Überlebenszeit der Patienten mit Sarkomen betrug 61,9 Monate und die 5-Jahres-Überlebenszeit 64 %. Wichtigste Einflussfaktoren auf die Überlebenszeit waren das Tumorgrading (p=0,016) und die Tumorgrösse (p=0,046). 94 der 112 behandelten Patienten hatten nach der Extremitätenperfusion im Bereich der Extremität eine regionale Toxizität Grad I-II nach Wieberdink und bei 18 Patienten kam es zu einer höhergradigen Gewebeschädigung (Grad III-IV). Die postoperativen Serumkonzentrationen von Creatinkinase (CK) und Myoglobin zeigten eine signifikante Korrelation zur regionalen Toxizität (p=0,007 bzw. 0,003). An systemischen Nebenwirkungen der isolierten Extremitätenperfusion mit TNF und Melphalan fiel vor allem eine Erhöhung der Leberwerte auf, mit Anstieg der Transaminasen und des Bilirubins bis zu WHO-Schweregrad III und IV. Einschränkungen der Lebersyntheseleistungen wurden nicht beobachtet. Alle Veränderungen waren spontan rückläufig. Leuko- und Thrombopenien Grad III/IV betrafen häufig Patienten mit einer systemischen Leckrate von > 5 % (29 % bzw. 21 %). Eine Überlegenheit der isolierten Extremitätenperfusion mit TNF und Melphalan beim Melanom gegenüber der Perfusion mit Melphalan alleine kann aus den vorliegenden Daten nicht abgeleitet werden. Die von uns festgestellte klinische Remissionsrate von 66 % ist nicht höher als in der Literatur angegeben. Durch die isolierte Extremitätenperfusion mit TNF und Melphalan kann bei ca. 80 % der behandelten Patienten mit lokal fortgeschrittenen und primär nicht resektablen Weichgewebssarkomen ein Extremitätenerhalt erreicht werden. Die hohe Rate auch histologisch belegter Remissionen bei diesen Patienten untermauert den Stellenwert dieser Therapie eindrucksvoll. / 112 patients were treated by isolated limb perfusion with tumor necrosis factor (TNF) and melphalan for locoregional metastases of melanoma (49 patients) or locally advanced soft tissue sarcoma (63 patients). Patients were treated in 2 prospective multicentric phase-II trials. For patients with intransit metastases from melanoma, complete response could be reached in 46 % and partial response in 20 %. Mean time to locoregional progression was 32.3 months (median 15.6 months). This was significantly longer for patients with complete response (46.0 months, median 30.2 months) when compared to patients with a partial response (15.2 months, median 16.1 months) or patients with no change (7.2 months, median 6.0 months). The mean overall survival time for patients with melanoma was 42.6 months (median 24.4 months) and the 5-year survival rate 42 %. The clinical response rate for sarcoma patients was 44.5 %, but on combined analysis of clinical and histologically confirmed response the overall response rate was 60 % (21 % CR). Limb salvage was possible in 86 % of the sarcoma patients (54/63 patients). The mean time to local progression was 63.7 months and the 5-year progression-free rate was 72 %. Mean overall survival time in this group was 61.9 months with a 5-year survival rate of 64 %. Grading (p=0,016) and tumor size (p=0,046) were the most important factors influencing survival. Regional toxicity after isolated limb perfusion was mild (Wieberdink grade I-II) in 94 of the 112 patients, and 18 patients had a more severe reaction (grade III-IV). Postoperative serum concentrations of creatinekinase (CK) and myoglobin were significantly correlated to regional toxicity (p=0.007 and 0.003). Elevated liver enzymes and bilirubin with levels up to WHO III and IV were the most profound systemic side effect of isolated limb perfusion with TNF and melphalan. All changes resolved completely. Leucopenia and thrombopenia grade III/IV were mainly observed in patients with a systemic leakage rate greater than 5 % (29 % resp. 21 %). In melanoma patients, the observed overall response rate of 66 % after isolated limb perfusion with TNF and melphalan is not superior to literature results for limb perfusion with melphalan alone. Thus, the superiority of this treatment cannot be confirmed for this indication. In contrast, limb salvage became possible in approx. 80 % of the patients with locally advanced and unresectable sarcoma. In addition, the high rate of histologically confirmed response in these patients underlines the value of this treatment modality.

Die vorliegende publikationsbasierte Dissertationsschrift erörtert auf der Basis experimenteller Untersuchungen im Tiermodell die Auswirkungen von Stress auf die Zytokinproduktion und depressionsähnliches Verhalten. Außerdem wird getestet, ob die Blockade des Zytokins Tumornekrosefaktor-α (TNF‑α) eine Möglichkeit zur antidepressiven Intervention darstellt. Einleitend werden die Zusammenhänge von Stress, Zytokinen und Depression referiert sowie das hypothetische Modell erläutert, das den publizierten Untersuchungen zugrunde liegt. Es wird hypothetisiert, dass Stress zur Erhöhung der Produktion proinflammatorischer Zytokine führt und dass die vermehrte Zytokinproduktion depressive Verhaltensweisen hervorruft. Aus dieser Annahme leitet sich die Möglichkeit ab, durch Blockade der Wirkung des proinflammatorischen Zytokins TNF‑α antidepressive Effekte zu erzielen. In den beiden Arbeiten „The impact of social isolation on immunological parameters in rats“ (Archives of Toxicology) und „Stress-induced cytokine changes in rats“ (European Cytokine Network) wurde der Einfluss von sozialer Isolation, chronischem, milden und akutem Stress auf die Zytokinproduktion untersucht. In diesen Untersuchungen führten die verschiedenen Stressarten zu einer Modulation der Produktion proinflammatorischer Zytokine. Die dritte Publikation „Antidepressant effects of TNF‑α blockade in an animal model of depression“ (Journal of Psychiatric Research) berichtet von einem Experiment, in dem untersucht wurde, ob der TNF‑α-Inhibitor Etanercept antidepressive Effekte aufweist. Tatsächlich zeigte sich unter Etanercept ein Rückgang des depressionsähnlichen Verhaltens im forced swim test (FST) analog zu Verhaltensänderungen durch das in Tierversuchen als Standard-Antidepressivum geltende Imipramin. Die Autoren schlussfolgern, dass das Zytokinsystem durch Stress moduliert wird und so in die pathophysiologische Entwicklung einer Depression involviert sein könnte. Zytokininhibitoren könnten eine neue Klasse der Antidepressiva bei Therapieresistenz werden, wenn sich die Ergebnisse dieser Tierversuche in Studien an Probanden und an Patienten replizieren lassen.

There is increasing evidence that chronic inflammation is tightly linked to diseases associated with endothelial dysfunction, including the induction of aberrant angiogenesis. While leukocytes have been described as mediators of inflammation-associated angiogenesis, the effects of direct chronic endothelial activation have not been addressed in this context. Using an uncleavable mutant of the transmembrane form of tumor necrosis factor-α (TNF-α), we have established models of stable TNF-α expression in endothelial cells in vitro and in transgenic mice in vivo. In the in vitro model, continuous endothelial activation leads to increased leukocyte cellular adhesion molecule expression and intracellular reactive oxygen species, hallmarks of a proinflammatory and dysfunctional endothelium. In addition, stable expression of TNF-α in endothelial cells increased angiogenic sprout formation in the presence but also in the absence of angiogenic growth factors. The partial neutralization of this effect by TNF-α antibodies and the inability of conditioned media from stable TNF-α-expressing endothelial cells to induce angiogenic activities in control endothelial cells suggest that this effect does not require expression of additional autocrine factors, but is an autonomous effect of the transmembrane TNF on the endothelial cells. Furthermore, using the Matrigel plug assay in vivo, increased angiogenesis was observed in endothelial TNF-α-expressing transgenic versus control mice. In conclusion, chronic inflammatory changes mediated by TNF-α can induce angiogenesis in vitro and in vivo, suggesting endothelial cell activation as a direct link between inflammation and angiogenesis. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Die vorliegende publikationsbasierte Dissertationsschrift erörtert auf der Basis experimenteller Untersuchungen im Tiermodell die Auswirkungen von Stress auf die Zytokinproduktion und depressionsähnliches Verhalten. Außerdem wird getestet, ob die Blockade des Zytokins Tumornekrosefaktor-α (TNF‑α) eine Möglichkeit zur antidepressiven Intervention darstellt. Einleitend werden die Zusammenhänge von Stress, Zytokinen und Depression referiert sowie das hypothetische Modell erläutert, das den publizierten Untersuchungen zugrunde liegt. Es wird hypothetisiert, dass Stress zur Erhöhung der Produktion proinflammatorischer Zytokine führt und dass die vermehrte Zytokinproduktion depressive Verhaltensweisen hervorruft. Aus dieser Annahme leitet sich die Möglichkeit ab, durch Blockade der Wirkung des proinflammatorischen Zytokins TNF‑α antidepressive Effekte zu erzielen. In den beiden Arbeiten „The impact of social isolation on immunological parameters in rats“ (Archives of Toxicology) und „Stress-induced cytokine changes in rats“ (European Cytokine Network) wurde der Einfluss von sozialer Isolation, chronischem, milden und akutem Stress auf die Zytokinproduktion untersucht. In diesen Untersuchungen führten die verschiedenen Stressarten zu einer Modulation der Produktion proinflammatorischer Zytokine. Die dritte Publikation „Antidepressant effects of TNF‑α blockade in an animal model of depression“ (Journal of Psychiatric Research) berichtet von einem Experiment, in dem untersucht wurde, ob der TNF‑α-Inhibitor Etanercept antidepressive Effekte aufweist. Tatsächlich zeigte sich unter Etanercept ein Rückgang des depressionsähnlichen Verhaltens im forced swim test (FST) analog zu Verhaltensänderungen durch das in Tierversuchen als Standard-Antidepressivum geltende Imipramin. Die Autoren schlussfolgern, dass das Zytokinsystem durch Stress moduliert wird und so in die pathophysiologische Entwicklung einer Depression involviert sein könnte. Zytokininhibitoren könnten eine neue Klasse der Antidepressiva bei Therapieresistenz werden, wenn sich die Ergebnisse dieser Tierversuche in Studien an Probanden und an Patienten replizieren lassen.:Abkürzungsverzeichnis 5 1. Einführung 6 1.1. Zytokine 6 1.1.1. Tumornekrosefaktor-α 7 1.1.2. Interleukin‑1β 9 1.1.3. Interleukin‑2 9 1.1.4. Interleukin‑4 10 1.1.5. Interleukin‑6 10 1.1.6. Interleukin‑10 10 1.1.7. Interleukin‑17 11 1.1.8. Interleukin‑22 11 1.1.9. Interferon‑γ 12 1.2. Stress 12 1.2.1. Sympathikus und Zytokine 12 1.2.2. Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse und Zytokine 12 1.3. Stress und Immunsystem 13 1.4. Stressarten und ihre Paradigmen im Tierversuch 14 1.4.1. Stress durch Isolation bei Ratten 14 1.4.2. Forced Swim Test: Paradigma zur Messung depressionsähnlichen Verhaltens und Modell für akuten Stress 15 1.4.3. Restraint Stress 16 1.5. Depression und Stress 16 1.6. Depression und Entzündung 17 1.7. Neue Therapieansätze gegen Depression 18 1.8. Theoretisches Modell und Fragestellung 19 1.9. Bibliografie zur Einführung 20 2. Originalarbeiten 34 „The impact of social isolation on immunological parameters in rats“ 35 „Stress-induced cytokine changes in rats“ 38 „Antidepressant effects of TNF-α blockade in an animal model of depression“ 45 3. Zusammenfassung 51 4. Anhang 55 Erklärung über die selbständige Abfassung der Arbeit 55 Lebenslauf 56 Publikationen 57 Danksagung 58

There is increasing evidence that chronic inflammation is tightly linked to diseases associated with endothelial dysfunction, including the induction of aberrant angiogenesis. While leukocytes have been described as mediators of inflammation-associated angiogenesis, the effects of direct chronic endothelial activation have not been addressed in this context. Using an uncleavable mutant of the transmembrane form of tumor necrosis factor-α (TNF-α), we have established models of stable TNF-α expression in endothelial cells in vitro and in transgenic mice in vivo. In the in vitro model, continuous endothelial activation leads to increased leukocyte cellular adhesion molecule expression and intracellular reactive oxygen species, hallmarks of a proinflammatory and dysfunctional endothelium. In addition, stable expression of TNF-α in endothelial cells increased angiogenic sprout formation in the presence but also in the absence of angiogenic growth factors. The partial neutralization of this effect by TNF-α antibodies and the inability of conditioned media from stable TNF-α-expressing endothelial cells to induce angiogenic activities in control endothelial cells suggest that this effect does not require expression of additional autocrine factors, but is an autonomous effect of the transmembrane TNF on the endothelial cells. Furthermore, using the Matrigel plug assay in vivo, increased angiogenesis was observed in endothelial TNF-α-expressing transgenic versus control mice. In conclusion, chronic inflammatory changes mediated by TNF-α can induce angiogenesis in vitro and in vivo, suggesting endothelial cell activation as a direct link between inflammation and angiogenesis. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Die Störung der intestinalen Mikrozirkulation gilt als ein kardinaler Mechanismus für die Entwicklung des Multiorganversagens bei Sepsis. Da das Intestinum für mikrozirkulatorische Studien klinisch kaum zugänglich ist, wurden die Auswirkungen einer Therapie mit den antioxidativen Substanzen Oxypurinol und U-74389G (Lazaroid) bzw. den vasoaktiven Substanzen Iloprost (Prostacyclin-Analogon) und Dopexamin auf die intestinale Mikrozirkulation und die systemische Mediatorfreisetzung in einem Tiermodell mit moderater und hoher Endotoxin-Belastung untersucht. Die intravitalmikroskopische Untersuchung der Kapillarperfusion in der Muskularisschicht bei Endotoxinämie erbrachte eine Verbesserung durch Oxypurinol- und Dopexamingabe. Die Perfusion der Mukosa konnte vor allem durch eine Iloprostapplikation gesteigert werden. Die Endotoxin-induzierte, intestinale Leukozytenadhärenz wurde insbesondere durch die Behandlung mit den antioxidativen Substanzen vermindert. Beide therapeutischen Optionen bewirkten eine ca. 60 %ige Reduktion der initialen Tumornekrosefaktor-alpha-Freisetzung in der Versuchsreihe mit der niedrigeren Endotoxin-Dosis. Parallel dazu konnte anhand von Malondialdehyd-Analysen gezeigt werden, dass Oxypurinol und U-74389G wirksam die intestinale, Radikal-induzierte Lipidperoxidation verringerten. Der intestinale mikrovaskuläre Blutfluss konnte durch beide vasoaktiven Substanzen - sowohl bei moderater als auch bei erhöhter Endotoxin-Dosierung - signifikant gesteigert werden. Die Ergebnisse beider Teilstudien bestätigten, dass sowohl reaktive Sauerstoffspezies als auch eine inadäquate Perfusion in der Mikrozirkulation wesentliche pathogenetische Faktoren bei Endotoxinämie bzw. Sepsis darstellen und entsprechende Therapieformen indiziert und effektiv sind. Eine kombinierte Gabe beider Substanzklassen erscheint daher sinnvoll und sollte in weiteren tierexperimentellen und klinischen Studien evaluiert werden. / The disturbance of the intestinal microcirculation is regarded as a pivotal mechanism in the development of multiorgan failure related to sepsis. Since the intestine is clinically not accessible for microcirculatory studies, the effects of a therapy with the antioxidants oxypurinol and U-74389G (lazaroid) as well as the vasoactive substances iloprost (a prostacyclin analogue) and dopexamine on the intestinal microcirculation and the systemic mediator release was studied in an animal model with moderate and high endotoxin challenge. The intravital microscopic examination of the capillary perfusion in the muscularis layer of the intestine during endotoxemia revealed an improvement by administration of oxypurinol and dopexamine. The perfusion of the mucosa could be increased by iloprost administration. The amount of the endotoxin induced, intestinal leukocyte adherence was especially decreased by the treatment with the antioxidants. Both therapeutic options caused a 60 % reduction in the initial tumor necrosis factor-alpha-release in the experiments with the lower endotoxin dose. Malondialdehyde analyses showed that oxypurinol and U-74389G reduced effectively the intestinal, radical-induced lipid peroxidation. The intestinal microvascular blood flow could be significantly increased by both vasoactive substances - as well as with moderately than also with elevated endotoxin-dosage. The results of the study confirmed that both reactive oxygen-species as well as an inadequate perfusion in the microcirculation represent essential pathogenetic factors during endotoxemia as well as sepsis and index corresponding therapy-forms and participates effective. A combined offering both substance-classes appears therefore meaningfully and should be evaluated in further experimental and clinical studies.

MicroRNAs (miRNAs) sind endogenene kurze RNA-Moleküle, die zentrale Aufgaben bei der Regulation der eukaryotischen Zellhomöostase erfüllen. MiRNAs wurden bereits als potente Immunregulatoren beschrieben. Trotz dieser Erkenntnisse blieb die Rolle dieser kurzen RNA Moleküle in Infektionen mit Mycobacterium tuberculosis weitgehend unerforscht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein miRNA-Expressionsprofil von Makrophagen generiert, die mit Mycobacterium tuberculosis infiziert waren. Dies ermöglichte die Identifizierung von miRNAs, welche bei der Infektion differenziell reguliert waren. Anhand eines ex-vivo-Modells von Todesrezeptor-induzierter Apoptose konnte gezeigt werden, dass miRNA-133b apoptoseresitente Zellen empfindlich gegen Tumornekrosefaktor-alpha (TNFalpha), TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) oder CD95 ligand (Fas/APO1 ligand) induzierte Zytotoxizität machte. Eine umfassende Studie führte zur Identifizierung der anti-apoptotischen Proteine Fas apoptosis inhibitory molecule (FAIM) und glutathione-S-transferase pi (GSTP1) als direkte Zielgene für miRNA-133b. Desweiteren zeigte sich die Expression von Osteoprotegerin (OPG) und Fettsäuresynthase (FASN), als miRNA-133b abhängig. Dies unterstrich die pleiotrope Art der pro-apoptotischen Aktivität dieser miRNA. Die Expression von miRNA-133b wurde durch Mitglieder der Toll-like Rezeptor (TLR)-Familie aktiviert. MiRNA-133b Transfektion führte zu einer verstärkten Aktivierung des Transkriptionsfaktors nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-kappaB). Diese resultierte in erhöhten Mengen an Interleukinen 6 und 8 (IL6/8). Diese Ergebnisse stellen die erste detaillierte Charakterisierung von miRNA-133b im Zusammenhang der Todesrezeptor-vermittelten Apoptose und der angeborenen Immunität dar. Die erforschten molekularen Wechselwirkungen ergänzen und bereichern das Verständnis über die regulatorischen molekularen Mechanismen, die mit der Tumorentstehung und Entzündung verbunden sind. / MicroRNAs (miRNAs) are endogenous short RNA molecules which perform essential tasks in the regulation of eukaryotic cell homeostasis. During the past few years miRNAs have emerged as very potent immune regulators. Despite the consequences of this discovery for our understanding of immune response regulation hitherto virtually nothing is known about miRNA function during innate immunity to Mycobacterium tuberculosis. Herein, a miRNA expression profile of human macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis was generated. This led to the identification of miRNAs being differentially regulated during infection. By using an experimental ex-vivo model of death receptor (DR)-induced apoptosis it could be demonstrated that miRNA-133b rendered apoptosis-resistant cells sensitive to tumor necrosis factor-alpha (TNFalpha)-, TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)- or CD95 ligand (Fas/APO1 ligand)-activated cytotoxicity. Comprehensive analysis led to the discovery of the anti-apoptotic proteins Fas apoptosis inhibitory molecule (FAIM) and glutathione-S-transferase pi (GSTP1) as direct miRNA-133b targets. Moreover, underlining the pleiotropic and synergistic nature of miRNA activity, the expression of osteoprotegerin (OPG) and fatty acid synthase (FASN) could be further proven as miRNA-133b dependent. Expression of miRNA-133b increased following innate immune activation by members of the Toll-like receptor (TLR) family. MiRNA-133b enhanced the activity of the transcription factor nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-kappaB). This translated into increased levels of the pro-inflammatory interleukins 6 and 8 (IL6/8). The results presented in this work represent the first detailed characterization of miRNA-133b in the context of DR-mediated apoptosis and innate immunity. The molecular interactions dissected herein improve the understanding of the regulatory processes associated with tumorigenesis and the immune response.