2,3-Dipalmitoyl-S-Glycerylcystein (Pam2Cys), ein Toll-like-Rezeptor 2 (TLR2)-Ligand, aktiviert dendritische Zellen und erhöht die Expression von HLA-DR auf deren Zelloberfläche. Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) können über die Ausschüttung von Zytokinen das erworbene Immunsystem stimulieren. Zudem weist die Entdeckung von HLA-DR auf NK-Zellen, besonders auf CD56bright-NK-Zellen, auf eine Verbindung zwischen angeborenem und erworbenem Immunsystem hin. Gekoppelt an ein immundominantes Peptidepitop aus dem Glykoprotein D des Herpes-Simplex-Virus (HSV) Typ 2, wurde Pam2Cys in dieser Arbeit als potentieller lipopeptidbasierter HSV-Impfstoff eingesetzt, um die Effekte dieser Vakzine auf NK-Zellen zu untersuchen. Die Einflüsse der Vakzine wurden anhand der CD69-, HLA-DR- und TLR2-Expression auf und in NK-Zellen nach Inkubation mit Pam2Cys untersucht. Die Analyse der Gesamt-NK-Zellpopulation ließ nur mit Hilfe der quantitativen Real-Time-PCR einen signifikanten Anstieg der TLR2-Expression erkennen, jedoch nicht durchflusszytometrisch. Inkubierte NK-Zellen zeigten deutlich mehr HLA-DR auf der Zelloberfläche, als unstimulierte NK-Zellen. Die Untersuchung der zwei großen NK-Zellsubpopulationen, CD56bright und CD56dim, ergab, dass stimulierte CD56bright-Zellen wesentlich mehr HLA-DR und TLR2 aufwiesen, als stimulierte CD56dim-Zellen. Die Expression des Aktivierungsmarkers CD69 stieg in der Gesamtpopulation der NK-Zellen nicht in signifikantem Maße an, zeigte jedoch eine Zunahme nach Inkubation mit den Pam2Cys-Molekülen. Die Aufnahme der Lipopeptide in NK-Zellen wurde mit der konfokalen Mikroskopie bestätigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die hier verwendete HSV-Vakzine von NK-Zellen aufgenommen wird und sie die Ausbildung von Oberflächenrezeptoren auf diesen Zellen moduliert. Insbesondere die Expressionssteigerung von HLA-DR auf CD56bright-NK-Zellen deutet auf die Fähigkeit dieser Zellen hin, Antigene zu präsentieren und stellt einen weiteren Mechanismus vor, der eine impfstoffbezogene Immunantwort unterstützen kann. Die vorliegende Arbeit bildet eine Basis für weiterführende Studien an NK-Zellen hinsichtlich der Antigenpräsentation im Allgemeinen und der Antigenpräsentation nach Stimulation durch eine Vakzine im Besonderen. / The Toll-like receptor 2 (TLR2) ligand 2,3-Dipalmitoyl-S-Glycerylcystein (Pam2Cys) enhances the surface expression of HLA-DR on dendritic cells and activates them. Natural killer cells (NK cells) may stimulate the adaptive immune system via the production of cytokines. Furthermore the detection of HLA-DR on NK cells, especially on CD56bright NK cells, hints at a connection between innate and adaptive immunity. In this study Pam2Cys was used as a potential lipopeptide-based HSV vaccine attached to an immunodominant epitope in herpes simplex virus (HSV) type 2 glycoprotein D. The effects of this vaccine on NK cells were analysed here. Examination of the influence of this vaccine was performed by measuring the expression of CD69, HLA-DR and TLR2 on and in NK cells after incubating them with Pam2Cys. Using quantitative real-time PCR, a significant increase of TLR2-mRNA in the entire NK cell population was detectable; however flow cytometry was not able to confirm these results. Incubated NK cells showed considerably more HLA-DR than unstimulated NK cells. Analysis of the two big NK cell subpopulations, CD56bright and CD56dim, revealed essentially more HLA-DR and TLR2 on stimulated CD56bright cells, compared to stimulated CD56dim cells. Expression of the activation marker CD69 after incubation was not triggered significantly on NK cells altogether; nevertheless an increase could be measured. Confocal microscopy confirmed an uptake of lipopeptides into NK cells. These data demonstrate the surface receptor modulation on NK cells by a potential HSV vaccine and the ability of NK cells to endocytose Pam2Cys. Particularly, the increase of HLA-DR on CD56bright NK cells points at the ability of these cells to present antigens, introducing a new mechanism able to support a potent immune response to a vaccination. This study provides a basis for further work on NK cells in terms of antigen presentation in general and antigen presentation after stimulation by a vaccine in particular.

In the last decades, both the incidence and the severity of asthma have steadily increased. Furthermore, available therapies only treat the symptoms but do not cure the disease. Immune modulation induced by TLR agonists may be a promising novel approach to effectively treat asthma as it targets the underlying immunopathology directly rather than one mediator alone. The aim of this thesis was to investigate if the immunostimulatory properties of Toll-like receptor (TLR) agonists can be utilized to develop novel therapeutic intervention strategies for the treatment of asthma using murine models of allergic inflammation. For this purpose five different TLR agonists were tested in preclinical mouse models of acute and chronic asthma, both in preventive and therapeutic settings. Firstly, TLR-2, 3, 4, 7/8 and 9 agonists were delivered intratracheally at different doses before pulmonary allergen exposure in the asthma model of acute inflammation. TLR9 agonist CpG-containing oligodeoxynucleotides (CpG) > TLR7 agonist Resiquimod (R848) > TLR3 agonists poly(I:C) strongly reduced allergen induced airway eosinophilia and IL-4 levels in a dose-dependent manner. All TLR agonists increased neutrophil numbers, TLR4 agonist lipopolysaccharide (LPS) > TLR2 agonist lipoteichonic acid (LTA) > poly(I:C) > CpG > R848 and, with the exception of R848, the amount of pro-inflammatory cytokines in the airways. Suppressive effects were not dependent upon IFN-γ and IL-10 or associated with increased numbers of regulatory T cells in the airways. All TLR agonists, except LTA, similarly reduced airway eosinophilia and IL-4 levels when applied therapeutically after allergen challenge. These results show that the TLR agonists have different suppressive effects on TH2 responses in the airways which further depend on the dose and the experimental setup in which they were tested. Interestingly, all agonists induced airway neutrophilia, albeit to different degrees, raising the question if TLR ligands are safe for human use when applied directly into the lung. Different TLR agonists are also being developed for human use as adjuvants combined with allergen in specific immunotherapy. Recent clinical data suggest that this may be achieved by induction of allergen-specific TH1 responses. For this reason, the ability of different TLR agonists to induce allergen-specific TH1 and suppress allergen-specific TH2 responses in a preclinical setting was investigated in this thesis. Different doses of the TLR agonists were applied together with allergen, then mice were exposed to allergen aerosol. CpG > LPS >LTA dose-dependently strongly suppressed the development of airway eosinophilia with poly(I:C) and R848 having no effect. The decrease in eosinophilic numbers was associated withincreased neutrophils present in the airways. IL-4 and IL-5 levels in the bronchoalveolar lavage fluid were also decreased when poly(I:C), LPS, and CpG were used. All TLR agonists increased allergen-specific IgG2a, and with the exception of poly(I:C), reduced allergen-specific IgE levels in the serum. Cutaneous anaphylaxis to allergen was completely prevented when LPS or CpG were given as adjuvant. The strongest TH1 responses were induced by CpG and poly(I:C), characterized by the presence of IFN-γ in the bronchoalveolar lavage and the highest allergen-specific IgG2a levels in the serum. This data supports approaches to use TLR9 or TLR4 agonists for human therapy as adjuvant in combination with allergen in novel specific immunotherapy formulations. In the last part of the thesis, it was investigated if TLR activation can also affect the pathology of severe chronic asthma. Therapeutic administration of R848 or CpG reduced features of inflammation and remodeling. Both agonists showed superior effects to dexamethasone, with CpG being more efficient than R848. This result again supports a TLR9-based therapy as a viable option for the treatment of severe chronic asthma which may present a potential alternative for anti-inflammatory therapy with steroids. Taken together, the results of this thesis support the use of TLR agonists to treat asthma. The most favorable efficacy/safety ratio is to be expected from TLR-based therapies combining TLR4 or TLR9 agonists with allergen in specific immunotherapy. In regard to TLR agonist monotherapy, R848 and CpG showed the most promising profiles, CpG particularly in a model of severe chronic asthma. However, since all TLR agonists used in this study also showed pro-inflammatory potential, the safety aspect of such an approach needs to be taken into account. / In den letzten Jahrzehnten wurde für Asthma ein Anstieg der Neuerkrankungen und der schweren Krankheitsverläufe verzeichnet. Des Weitern kontrollieren angewandte Therapien zwar Symptome, bieten aber keine Heilung. Ein vielversprechender Ansatz, mit dem Ziel den ursächlichen Krankheitsmechanismus zu inhibieren, ist die TLR Agonisten induzierte Immunmodulation. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Eignung von immunstimulatorischen Toll-like Rezeptor (TLR) Agonisten für neue Therapieansätze in allergischen Entzündungsmodellen zu untersuchen. Hierfür wurden fünf verschiedene TLR Agonisten in murinen Modellen von akutem oder chronischem Asthma, sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch verabreicht. Als erstes wurden in einem Modell mit akuter Entzündungsreaktion verschiedene Konzentrationen der Agonisten für TLR 2, 3, 4, 7 und 9, vor der pulmonalen Allergenexposition intratracheal appliziert. Hier verminderten TLR9 Agonist CpG-Oligodesoxynukleotide (CpG) > TLR7 Agonist Resiquimod (R848) > TLR3 Agonist poly(I:C) konzentrationsabhängig die allergen-induzierte Eosinophilie in den Atemwegen. Alle TLR Agonisten erhöhten die Anzahl an Neutrophilen, am stärksten TLR4 Agonist Lipopolysaccharid (LPS) > TLR2 Agonist Lipoteichon Säure (LTA) > poly(I:C) > CpG > R848. Weiterhin erhöhten, bis auf R848, alle TLR Agonisten die Menge an pro-inflammatorischen Zytokinen in den Atemwegen. Die hierbei beobachteten suppressiven Effekte waren weder IFN-γ noch IL-10 abhängig und korrelierten auch nicht mit einer Erhöhung der pulmonalen regulatorischen T Zellen. Die therapeutische Gabe von TLR Agonisten nach Allergenexposition reduzierte ebenfalls die Eosinophilie sowie IL-4 in den Atemwegen. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich die TLR Agonisten in ihrer suppressiven Wirkung stark unterscheiden, und dass ihre Wirkung zum einen von der verabreichten Konzentration und zum anderen von dem experimentellen Aufbau abhängig ist. Auffällig war, dass alle Agonisten, wenngleich in unterschiedlicher Ausprägung, eine Neutrophilie in den Atemwegen induzierten. Dies wirft die Frage auf, ob eine wiederholte pulmonale Gabe für den Menschen verträglich wäre. Ein anderer Ansatz verwendet TLR Agonisten als Adjuvanzien für die Kombination mit Allergenen in der spezifischen Immuntherapie. Aktuelle klinische Ergebnisse deuten darauf hin, dass die TLR vermittelte Erhöhung der allergen-spezifischen TH1Antwort die Effektivität der Therapie steigern kann. Deswegen wurden in der vorliegenden Arbeit die verschieden TLR Agonisten auf ihre Fähigkeit hin untersucht allergen-spezifische TH1 Antworten auszulösen und allergen-spezifische TH2 Antworten zu unterdrücken. Hierfür wurde Allergen zusammen mit verschiedenen Konzentrationen der TLR Agonisten appliziert und anschließend die Mäuse Allergen-Aerosol ausgesetzt. Hier konnte eine starke, konzentrationsabhängige Unterdrückung der Atemwegseosinophilie, begleitet von einer Neutrophilie, bei CpG > LPS >LTA beobachten werden. Poly(I:C) und R848 zeigten keine Effekte. Auch wurde die Menge von IL-4 und IL-5 in der bronchoalveolaren Lavage durch poly(I:C), LPS, und CpG erniedrigt. Weiterhin reduzierten alle TLR Agonisten, mit der Ausnahme von poly(I:C), die Menge an allergen-spezifischem IgE im Serum. Die kutane anaphylaktische Reaktion gegen das Allergen wurde durch CpG- oder LPS-Adjuvans komplett verhindert. Die stärkste TH1 Antwort, charakterisiert durch erhöhtes IFN-γ in der Lavage und die größte Menge an allergen-spezifischem IgG2a, wurde durch CpG und poly(I:C) ausgelöst. Diese Resultate unterstützen den klinischen Ansatz CpG als erfolgsversprechenden Adjuvants-Kandidaten für die Kombinationstherapie mit Allergen in der spezifischen Immuntherapie einzusetzen. Im letzten Teil der vorliegenden Arbeit wurde untersucht ob die Aktivierung von TLRs auch den Krankheitsverlauf von schwerem chronischem Asthma beeinflussen kann. Die beiden TLR Agonisten CpG und R848 reduzierten Faktoren des Atemwegumbaus und der Entzündung effektiver als das Steroid Dexamethasone, wobei CpG die höchste Effektivität aufwies. Dieses Ergebnis unterstützt ebenfalls eine auf TLR9 Agonisten basierende Therapie als einen vielverspechenden Ansatz für die Behandlung von schwerem chronischem Asthma auch als eine potentielle Alternative zur antiinflammatorischen Therapie mit Steroiden. Zusammenfassend unterstützen die Resultate die Verwendung von TLR Agonisten für die Behandlung von Asthma. Die höchste Effektivität und Verträglichkeit ist für eine TLR Allergen Kombinationstherapie mit TLR4 oder TLR9 Agonisten in der spezifischen Immuntherapie zu erwarten. Für eine mögliche TLR Monotherapie zeigten R848 und CpG die besten Wirkungsprofile, für schwereres chronisches Asthma bevorzugt CpG. Hierbei muss jedoch stets berücksichtigt werden, dass TLR Agonisten auch selbst entzündliche Reaktionen hervorrufen können.

Die Infektion mit Schistosoma mansoni resultiert in einer Th2-Immunantwort mit Eosinophilie und erhöhtem IgE-Titer, wobei der wasserlösliche Extrakt der S. mansoni Eier (SEA) ausreicht um diese Reaktion auszulösen. In der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert werden, dass sich IL-4-produzierende CD4+ T-Lymphozyten in Zellkulturen mit SEA-konditionierten Dendritischen Zellen (DCs) trotz gleichzeitig vorkommenden IFN-gamma entwickeln und SEA die Expression von Faktoren in DCs, die üblicherweise mit einer Th1-Antwort einhergehen, auf Transkriptions- und Proteinebene selektiv hemmt. Um den Faktor aus S. mansoni Eiern zu isolieren, der zur Expression von IL-4 in CD4+ Zellen und zur Inhibition von IL-12 in DCs führt, wurde eine Gelfiltrationschromatographie der exkretorisch/sekretorischen Ei-antigene (ES) durchgeführt und die Fraktionen in vitro getestet. Darin wurde gezeigt, dass Fraktionen mit einer Proteinbande von 30 kD die Expression von IL-4 in CD4+ Zellen induzieren. Dieses ES-Protein wurde durch N-terminale Sequenzierung als hepatotoxische Ribonuclease Omega-1 identifiziert, welches ebenfalls die Expression von IL-12 in DCs inhibiert und die Produktion von IL-4 in CD4+ Zellen bei einer 10-fach geringeren Proteinkonzentration als mit dem Kontrollansatz SEA induziert. Zudem sollte untersucht werden, inwieweit Toll-like Rezeptoren in der Generierung einer Th2 Antwort gegen schistosomale Antigene involviert sind. Dazu wurden TLR2-, TLR3-, TLR4- und MyD88-defiziente Mäuse mit S. mansoni infiziert und immunologische und pathologische Daten in der akuten und chronischen Phase der Infektion analysiert. Demnach sind TLR2, TLR3, TLR4 und MyD88-abhängige Signaltransduktionswege nicht für eine-Th2 Antwort notwendig, jedoch ist letzteres Molekül in der Ausprägung der typischen Leberfibrose involviert. / Infection with Schistosoma mansoni results in the induction of a Th2 immune response, eosinophilia and increased levels of IgE. The water-soluble extract of S. mansoni eggs (SEA) is sufficient to promote TH2 polarization in a dendritic cell-dependent manner. In this thesis, it was demonstrated that IL-4+ CD4+ cells emerge in cultures with SEA-conditioned dendritic cells (DCs) in the presence of IFN-gamma and that SEA inhibits selectively the expression of IL-12 and co-stimulatory markers in DCs on the transcriptional and protein level. To identify the putative protein in S. mansoni eggs mediating a Th2 induction, a gel filtration chromatography of the excretory/secretory egg antigens (ES) was conducted and the fractions tested in vitro. Fractions containing a single band of 30 kD were sufficient to promote IL-4 induction in naïve CD4+ cells. Using N-terminal sequencing this ES-protein was identified as the hepatotoxic S. mansoni ribonuclease omega-1 which displayed both biological functions observed with SEA: inhibition of IL-12 in LPS-stimulated DCs and induction of IL-4+ CD4 cells at a 10 fold lower protein concentration than SEA. In order to understand, if the innate immune receptors TLR2, TLR3, TLR4 or the TLR adaptor molecule MyD88 are involved in the generation of the Th2 response against schistosomal antigens, the respective knock out mice were infected and immunological and pathological parameters were analyzed during acute and chronic phase of infection. This study showed that during S. mansoni infection TLR2, TLR3, TLR4 and TLR activation through the MyD88-dependent pathway are neither required for the induction (priming and polarization) nor for the down-regulation of Th2 responses, however, the fibrotic response against S. mansoni eggs was significantly reduced in MyD88-deficient mice suggesting a detrimental role of this pathway in liver pathology.

Die Gliazellen des enterischen Nervensystems galten lange Zeit lediglich als Packmaterial der Neuronen. Erst in den letzten Jahren rückte dieser Zelltyp in das Interesse der Forschung, weil mehrere Studien eine Schlüsselrolle bei der Erhaltung der Darmwandintegrität postulierten. Da bisher wenig über die immunphysiologischen Eigenschaften der enterischen Gliazellen bekannt war, wurde in dieser Arbeit deren Bedeutung bei der angeborenen intestinalen Immunantwort untersucht. Hierfür wurden Primärkulturen von enterischen Gliazellen eingesetzt, welche aus dem Plexus myentericus adulter Ratten stammten. Es wurde erstmalig nachgewiesen, dass enterische Gliazellen über Toll like und NOD-Rezeptoren (TLR 2, TLR 4, TLR 6, TLR 7, TLR 9, NOD 1, NOD 2) pathogene bakterielle Muster (PAMPs) erkennen. Dabei zeigte sich, dass eine enge Vernetzung zwischen den Toll-like-Rezeptoren besteht. Einerseits findet eine Liganden-spezifische Regulierung der Toll-like-Rezeptoren statt, anderseits beeinflussen TLR spezifische Liganden die mRNA-Expression weiterer Toll-like-Rezeptoren. In der Analyse der intrazellulären Signalweiterleitung konnte die Existenz verschiedener Adaptor- und Interaktionsmoleküle wie RICK und Myd88 sowie der IKK / NF κB Signalweg mit Degradierung von IκB α nach Aktivierung durch LPS belegt werden. Aktivierte enterische Gliazellen sind eine Quelle für pro- und anti-inflammatorische Interleukine (IL-1α, IL 1β, IL 6, IL-10, IL-12), TNF α und Chemokine (Ccl-2, Cxcl-9, Cxcl-10). Sie können somit weitere immunkompetente Zellen rekrutieren und agieren vermutlich als Schnittstelle zwischen der angeborenen und erworbenen Immunantwort. Die Ergebnisse dieser Arbeit implizieren, dass es sich bei enterischen Gliazellen um einen zusätzlichen immunregulatorischen Zelltyp im Darm handelt, welcher aktiv bei der angeborenen Immunabwehr mitwirkt. Neben pro inflammatorischen Eigenschaften tragen enterische Gliazellen auch zur Darmprotektion während Entzündungsprozessen bei. Daraus ergibt sich eine komplexe Funktionalität der enterischen Gliazellen bei der immunologischen Homöostase im Darm.

Die Gliazellen des enterischen Nervensystems galten lange Zeit lediglich als Packmaterial der Neuronen. Erst in den letzten Jahren rückte dieser Zelltyp in das Interesse der Forschung, weil mehrere Studien eine Schlüsselrolle bei der Erhaltung der Darmwandintegrität postulierten. Da bisher wenig über die immunphysiologischen Eigenschaften der enterischen Gliazellen bekannt war, wurde in dieser Arbeit deren Bedeutung bei der angeborenen intestinalen Immunantwort untersucht. Hierfür wurden Primärkulturen von enterischen Gliazellen eingesetzt, welche aus dem Plexus myentericus adulter Ratten stammten. Es wurde erstmalig nachgewiesen, dass enterische Gliazellen über Toll like und NOD-Rezeptoren (TLR 2, TLR 4, TLR 6, TLR 7, TLR 9, NOD 1, NOD 2) pathogene bakterielle Muster (PAMPs) erkennen. Dabei zeigte sich, dass eine enge Vernetzung zwischen den Toll-like-Rezeptoren besteht. Einerseits findet eine Liganden-spezifische Regulierung der Toll-like-Rezeptoren statt, anderseits beeinflussen TLR spezifische Liganden die mRNA-Expression weiterer Toll-like-Rezeptoren. In der Analyse der intrazellulären Signalweiterleitung konnte die Existenz verschiedener Adaptor- und Interaktionsmoleküle wie RICK und Myd88 sowie der IKK / NF κB Signalweg mit Degradierung von IκB α nach Aktivierung durch LPS belegt werden. Aktivierte enterische Gliazellen sind eine Quelle für pro- und anti-inflammatorische Interleukine (IL-1α, IL 1β, IL 6, IL-10, IL-12), TNF α und Chemokine (Ccl-2, Cxcl-9, Cxcl-10). Sie können somit weitere immunkompetente Zellen rekrutieren und agieren vermutlich als Schnittstelle zwischen der angeborenen und erworbenen Immunantwort. Die Ergebnisse dieser Arbeit implizieren, dass es sich bei enterischen Gliazellen um einen zusätzlichen immunregulatorischen Zelltyp im Darm handelt, welcher aktiv bei der angeborenen Immunabwehr mitwirkt. Neben pro inflammatorischen Eigenschaften tragen enterische Gliazellen auch zur Darmprotektion während Entzündungsprozessen bei. Daraus ergibt sich eine komplexe Funktionalität der enterischen Gliazellen bei der immunologischen Homöostase im Darm.

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Die rheumatoide Arthritis (RA) ist die häufigste entzündliche Gelenkerkrankung der Welt. Sie verläuft meist chronisch-progressiv und kann schließlich zu Gelenkdestruktion und Invalidität führen. Trotz intensiver Forschungen bleibt die Pathogenese der RA weiterhin unklar. Neuere Untersuchungen weisen auf die wichtige Rolle des angeborenen Immunsystems hin, insbesondere der Toll-like-Rezeptoren (TLRs) TLR2 und TLR9. Genetische Polymorphismen in TLR2 und TLR9 könnten daher zur Erkrankung einer RA prädisponieren, davor schützen oder den Verlauf der RA beeinflussen. Zielsetzung dieser Arbeit war es, die Assoziation zwischen RA-Erkrankung, dem Rheumafaktor (RF)-Serostatus und der Höhe des RF im Serum und genetischen Polymorphismen im TLR2- und TLR9-Gen zu analysieren. Zur Untersuchung der TLR9-Polymorphismen T-1237C und T-1486C wurde ein real-time-PCR-basiertes Verfahren am LightCycler (LC) etabliert, das den schnellen Nachweis beider Polymorphismen in einer Reaktion mittels fluoreszenzmarkierter Hybridisierungssonden ermöglicht. Desweiteren wurde ein neues Puffersystem verwendet, das die LC-PCR unter Verwendung einer konventionellen Taq-Polymerase zu erheblich günstigeren Kosten ermöglicht. Die Genotypisierung der DNA von 118 RA-Patienten (89 weiblich, 29 männlich, Durchschnittsalter 56,2 Jahre) und einer geschlechtsgematchten Kontrollgruppe von 118 Personen (Durchschnittsalter 44,1 Jahre) zeigte, dass die TLR9-Polymorphismen T-1486C und T-1237C sowie der TLR2-Polymorphismus G2408A nicht für das Auftreten von RA prädisponieren. Träger des seltenen C-Allels sind signifikant häufiger RF-positiv (p=0,049) und ihre RF-Antikörperspiegel sind höher als bei Patienten, die das C-Allel nicht aufweisen (p=0,023). Der TLR9-Polymorphismus T-1486C könnte daher die Krankheitsausprägung beeinflussen. / Rheumatoid arthritis (RA) is the most common inflammatory joint disease worldwide. It is a chronic progressive disease which can eventually lead to joint destruction and disability. The pathogenesis of RA remains uncertain in spite of the intensive research in this field. Recent data indicate the important role of the innate immune system, especially of the toll like receptors (TLRs) TLR2 and TLR9 in the pathogenesis of RA. Genetic polymorphisms in the TLR2 and TLR9 gene could therefore predispose to RA, protect against it or influence its course. The aim of this work was to analyse the association of RA, the serostatus of rheumatoid factor (RF) and its levels with genetic polymorphisms in the TLR2 and TLR9 gene. A new real time PCR based method was developed on the LightCycler (LC) in order to analyse the TLR9 polymorphisms T-1237C and T-1486C. This method permits the fast detection of both polymorphisms in a single reaction using fluorescence labelled hybridization probes. Furthermore, a new reaction mix was developed which allows the use of a conventional Taq polymerase for the LC-PCR at much lower costs. The genotyping of 118 RA patients (89 female, 29 male; average age 56.2 years) and a control group of 118 healthy individuals (average age 44.1 years) showed that the TLR9 polymorphisms T-1237C and T-1486C and the TLR2 polymorphism G2408A do not predispose to RA disease. The TLR9 polymorphism T-1486C might influence the course of the disease as individuals with the rare C-allele are significantly more frequent RF-positive (p=0.049) and their RF-antibody levels are higher than in patients who do not bear the C-allele (p=0.023).

CD1 Moleküle spielen eine wichtige Rolle in der Lipidpräsentation und T-Zell-Aktivierung. CD1d fungiert als Restriktionselement für NKT-Zellen, eine T-Zell-Untergruppe, die nach Erkennung von Glykosphingolipide (GSL), IFN-gamma und IL-4 produziert. NKT Zellen steuern folglich anschliessende Immunantworten. Den meisten infektiösen Mikroorganismen mangelt es jedoch an GSL-Antigenen zur Stimulation von NKT-Zellen. Der Wirtsorganismus hat daher einen Mechanismus entwickelt, der die Aktivierung der NKT-Zellen dennoch gewährleistet. NKT-Zellen erkennen auch endogene GSL, die in dendritischen Zellen (DZ) infolge von Toll-like-Rezeptor (TLR)-Stimulation durch Pathogene produziert werden. Bislang war unklar, wie genau TLR-Aktivierung zur Produktion von Selbst-GSL-Antigenen führt. Ziel dieser Arbeit war es die Verknüpfung der beiden Prozesse aufzudecken. Diese Dissertation zeigt, dass alpha-Galaktosidase A (a-Gal A) als lysosomales Schlüsselenzym für den konstitutiven Abbau von Selbst-GSL-Antigenen in DZ fungiert. NKT-Zellen antworteten auf CD1d-restringierte Antigene, die von DZ, denen a-Gal A-Aktivität fehlte, präsentiert wurden. Ferner expandierten NKT-Zellen nach adoptiven Transfer in a-Gal A-defiziente Mäuse in Abhängigkeit von CD1d-Expression im Wirtsorganismus. Diese Arbeit zeigte auch, wie GSL-Antigene dem Abbau durch a-Gal A entkommen und für die NKT-Zell-Aktivierung bei Infektionen verfügbar werden. Unter normalen Bedingungen wurden die GSL durch a-Gal A abgebaut. TLR-vermittelte Signale führten jedoch zu Inhibierung der a-Gal A-Aktivität in DZ und resultierten somit in einer GSL-Akkumulation in den Lysosomen. Wir identifizierten einen neuen Regulationsmechanismus der NKT-Zell-Aktivierung bei Infektionen, der auf der Induktion von lysosomalen GSL-Antigenen durch TLR-vermittelte Hemmung der a-Gal A-Aktivität beruht. Diese Dissertation beantwortet fundamentale Fragen der NKT-Zell-Biologie und ebnet den Weg dieses System für therapeutische Ansätze zu nutzen. / CD1 molecules are pivotal for lipid presentation to T lymphocytes. Notably, CD1d functions as a restriction element for NKT cells, a T-cell lineage that produces IFN-gamma and IL-4 following recognition of glycosphingolipids (GSL). Consequently, NKT cells exert decisive regulatory functions on downstream immune responses. Most microbes potentially causing infection of the host lack GSL antigens to stimulate NKT cells. However, facing this challenge, the host developed a mechanism to ensure NKT-cell activation. This pathway exploits the property of NKT cells to react with self GSLs produced in dendritic cells (DCs) stimulated by pathogens through Toll-like receptors (TLR). How TLR engagement leads to production of self GSL antigens remains elusive. The aim of this study was to provide a mechanistic link between these two processes. Here, we identified alpha-galactosidase A (a-Gal A) as a key lysosomal enzyme required for constitutive degradation of self GSL antigens in DCs. Accordingly, NKT cells exposed to DCs lacking a-Gal A activity were activated in the context of CD1d-presented antigens. In addition, NKT cells underwent robust expansion upon transfer to a-Gal A-deficient mice that required CD1d expression by the host. This study further addressed the critical question as to how GSL antigens escape degradation by a-Gal A, and thus become available for presentation to NKT cells in infection. Accordingly, we found that TLR signaling targeted a-Gal A activity for negative regulation in DCs. Consequently, GSLs degraded by a-Gal A in steady-state conditions were induced in lysosomes. Based on these findings, we propose a new pathway that warrants the activation of NKT cells in infection by self GSL antigens induced through TLR-mediated inhibition of a-Gal A activity. Overall, this dissertation answers fundamental questions in the NKT field, and paves the way toward exploring this antigen presentation axis for therapeutic use.

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Tyrphostine stellen eine Klasse synthetischer Protein-Tyrosin-Kinase (PTK)-Hemmer, die sich strukturell vom Tyrosin ableiten und dazu dienen, spezifisch Substratphosphorylierungen zu verhindern. Tyrphostin AG126 zeigte entzündungshemmende Eigenschaften in zahlreichen Tiermodellen von Erkrankungen. Dies schließt den septischen Schock ein, der durch Lipopolysaccharid (LPS) Gram-negativer Bakterien induziert werden kann, sowie die durch Zellwandstrukturen Gram-positiver Bakterien ausgelöste bakterielle Meningitis. Wir zeigen nun positive AG126-Effekte in einer weiteren ZNS-Komplikation, der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) als einem Modell der Multiplen Sklerose, wo AG126-Behandlung die klinischen Symptome und Myelinschäden mildert. Auf zellulärer Ebene beeinflusst AG126 eine Vielzahl von Funktionen der Mikroglia, der ZNS-Makrophagen, die durch Aktivierung von Toll-like-Rezeptoren (TLR s) ausgelöst werden. Diese Rezeptoren der angeborenen Immunität erkennen mikrobielle Strukturen sowie Faktoren, die durch Gewebeverletzungen generiert werden. Mit dem Fokus auf Mikroglia untersuchte die vorliegende Arbeit erstmals molekulare Zielstrukturen und Mechanismen des AG126. AG126 beeinflusst besonders Geninduktionen, die vom Adaptorprotein MyD88, einem der zwei TLR-Signalwege, abhängen. Bruton s Tyrosin-Kinase (BTK), eine MyD88-assoziierte PTK, kann von AG126 in molekularen und zellbasierten Assays gehemmt werden. Diese Hemmung kann allerdings nicht das gesamte Spektrum der AG126-Effekte erklären. Daher müssen alternative, sogar PTK-unabhängige Mechanismen, in Betracht gezogen werden, basierend auf strukturellen und funktionellen Ähnlichkeiten zu Tyrosin-abgeleiteten und/oder mikrogliaaktiven Molekülen. Diese alternativen Mechanismen umfassen Prinzipien, die für Antioxidantien, adrenerge Agonisten, Glukokortikoide oder Entkoppler der oxidativen Phosphorylierung bekannt sind. Tatsächlich zeigen Analysen auf der Grundlage von Kernspinresonanzspektroskopie, dass AG126 in die Hauptprodukte 3-Hydroxy-4-Nitroben zaldehyd (BZ) und Malononitril (MN) zerfallen kann, von denen MN, aber nicht BZ, die AG126-Effekte in Mikroglia imitiert. Ein ähnliches Verhalten zeigen weitere Tyrphostine, die ebenfalls das kritische MN-Strukturmotiv aufweisen. Tierexperimente zeigen schließlich, dass nur AG126 als Ausgangstruktur, nicht aber MN oder BZ, das Gesamtspektrum protektiver Effekte in der EAE vermittelt. Die Identifizierung des eigentlichen von AG126 bzw. von MN beeinflussten Targets könnte somit einen wesentlichen Mechanismus für die Entwicklung von entzündungshemmenden Verbindungen offenlegen.