MHC-Klasse-I präsentierte Epitope werden überwiegend durch den proteasomalen Abbau von Poly-Ubiquitin markierten Proteinen und defekten ribosomalen Produkten (DRiPs) generiert. Die post-proteasomale Prozessierung durch zytosolische Exo- und Endopeptidasen führt jedoch hauptsächlich zur Epitop-Zerstörung und nur ein sehr geringer Anteil der Peptide entkommt der Degradation. Bisher ist noch unklar, wie die enzymatischen Aktivitäten des heterogenen Peptidase-Pools im Zytosol die finale Epitop-Prozessierung beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurden heteromere Interaktionen von zytosolischen Peptidasen analysiert und ihre Wirkung auf die Prozessierung und Präsentation von proteasomal generier-ten Vorläuferpeptiden in Bezug auf die HCMVpp65495-503 Epitop-Generierung untersucht. Glycerolgradientenzentrifugationen und Immunpräzipitationsexperimente zeigten, dass die zytosolischen Peptidasen Nardilysin (NRDc) und Aminopeptidase-B (AP-B) in den gleichen Fraktionen sedimentieren und zu heteromeren Komplexen interagieren. Die siRNA- abhängige Reduktion der Proteinexpression beider Peptidasen hatte einen positiven Effekt auf die HCMVpp65 spezifische CTL-Antwort. Demnach vermindert der Peptidase-Komplex die HCMVpp65-spezifische Epitop-Präsentation auf der Zelloberfläche. Im Gegensatz dazu bewirkte ein in vitro rekonstituierter trimerer Peptidase-Komplex jedoch die verstärkte HCMVpp65 Epitop-Generierung aus einem proteasomal generierten Vorläuferpeptid. Auf der anderen Seite führte gereinigte AP-B zu der anhaltenden Zerstörung des Epitops. Die Ergeb-nisse deuten somit darauf hin, dass sowohl einzelne als auch verschiedene Interaktionen von zytosolischen Peptidasen die Prozessierung und Präsentation des HCMVpp65-Epitops unterschiedlich modulieren und somit die HCMVpp65-spezifische antivirale Immunantwort beeinflussen. / MHC class I presented antigens are generated by the degradation of poly- ubiquitinated pro-teins and defective ribosomal products (DRiPs) by a major protease, the 26S proteasome. However, the post- proteasomal processing by cytosolic exo-and endopeptidases mainly leads to epitope destruction and only a very small proportion of the peptides escape degradation. So far, it is still unclear how the enzymatic activity of the heterogeneous pool of peptidases in the cytosol affects final epitope processing and therewith immune response. In the present work heteromeric interactions of cytosolic peptidases and their effect on pro-cessing and presentation of proteasomal generated peptides were analysed with regard to HCMVpp65495-503 epitope generation. Glycerol gradient centrifugation and immunoprecipitation experiments indicate that the cyto-solic peptidases Nardilysine (NRDc) and Aminopeptidase B (AP-B) sediment in the same fractions and interact to heteromeric complexes. The siRNA dependent reduction of protein expression of these two peptidases had a positive effect on the HCMVpp65 specific CTL re-sponse. Thus the peptidase complex reduces HCMVpp65 epitope presentation on the cell sur-face possibly due to epitope destruction. In contrast to the findings of the CTL assays, an in vitro reconstituted trimeric peptidase complex resulted in the increased generation of HCMVpp65 epitopes from a proteasomal generated peptide precursor. On the other hand pu-rified AP-B led to the ongoing destruction of the epitope. The findings obtained show that single cytosolic peptidases and various interactions of cytosolic peptidases regulate the pro-cessing and presentation of the HCMVpp65 epitope differently, thereby influencing the HCMV-specific antiviral immune response.

Das Ubiquitin Proteasom System generiert die Mehrheit der antigenen Peptide, die zusammen mit MHC Klasse I Molekülen präsentiert werden, wobei durch Kooperation mit alternativen proteolytischen Systemen die Vielfalt der möglichen MHC I Liganden erhöht wird. In diesem Zusammenhang, insbesondere im Rahmen einer Immunantwort, ist die Rolle von Aminopeptidasen bislang nur ungenügend charakterisiert. In der vorliegenden Arbeit wurde der modulatorische Einfluss von zytosolischen und im ER lokalisierten Aminopeptidasen auf die Generierung des HCMV pp65495-503 Epitops durch Prozessierung von proteasomal generierten Peptidprodukten untersucht. Dafür wurde in pp65 exprimierenden Zellen die Expression einzelner Aminopeptidasen mittels siRNA inhibiert und der Effekt auf die Epitoppräsentation über die Aktivierung pp65495-503 spezifischer CTL bestimmt. Es zeigte sich, dass TPPII, LAP, AP-B und POP limitierend auf die Epitoppräsentation wirken. Damit wurden die Peptidasen AP-B und POP erstmalig in direkten Zusammenhang mit der MHC Klasse I Antigenprozessierung gebracht. Analysen weiterer zytosolischer Peptidasen wie TOP, BH und PSA zeigten keinen signifikanten Effekt auf die Epitoppräsentation, so dass diese Peptidasen an der zellulären Prozessierung des pp65 Antigens nicht beteiligt sind. Die Trimmaktivität von ERAPI und ERAPII im ER hingegen hatte einen bedeutenden Anteil an der pp65495-503 Epitopgenerierung. In Immunpräzipitationsexperimenten konnte zudem die Interaktion der ER Aminopeptidasen mit dem peptide-loading complex zum ersten Mal nachgewiesen werden. Die vorliegenden Daten geben Hinweise darauf, dass die Interaktion von ERAPI und ERAPII mit dem Komplex unabhängig von dessen vollständiger Assemblierung mit dem TAP Transporter stattfinden kann und vermutlich über Tapasin vermittelt wird. Da diese Assoziation durch IFNgamma induziert wird, könnte sie zu einer effizienteren Antigenprozessierung und -Präsentation, vor allem unter Infektionsbedingungen, beitragen. / The ubiquitin proteasome system is responsible for the generation of the majority of MHC class I presented antigenic peptides. By cooperation with alternative proteolytic systems the diversity of MHC class I ligands is increased. In this context, especially during immune response, the role of aminopeptidases is barely characterised. In this project the effect of cytosolic and ER-resident aminopeptidases on processing of proteasomal generated peptides was investigated with regard to HCMV pp65495-503 epitope generation. Therefore, expression level of single aminopeptidases was down regulated by siRNA in pp65 expressing cells and the effect of down regulation on epitope presentation was analysed by activation of pp65495-503 specific CTLs. It could be demonstrated that TPPII, LAP, AP-B and POP have negative effects on pp65 epitope presentation. With AP-B and POP two additional cytosolic aminopeptidases with a functional role in epitope processing were identified. Other aminopeptidases, that have been characterised as part of the antigen processing machinery, namely TOP, BH and PSA, did not affect pp65 epitope generation. In contrast, trimming by ERAPI and ERAPII in the ER resulted in an efficient epitope presentation. For the first time, experimental evidence was provided that the two ER-resident peptidases interact with the MHC class I peptide-loading complex (PLC). The obtained results indicate that this association takes place independently of the assembly of the entire complex including TAP and is probably mediated by tapasin. The observation that this complex formation is inducible by IFNgamma suggests that the association of ERAPI and ERAPII to the PLC accounts for a better antigen processing and presentation mainly at the site of infection.

Das Ubiquitin-Proteasom-System gewährleistet in eukaryontischen Zellen den regulierten Abbau der meisten intrazellulären Proteine und ist mit der Generierung von T-Zell-Epitopen grundlegend an der Immunantwort beteiligt. Wegen der Komplexität des Systems stand ein in vitro Verfahren zur 26S proteasomalen Prozessierung eines ubiquitinierten Modellsubstrates erstmals im Jahr 2000 zur Verfügung. In der vorliegenden Arbeit gelang es, diese von Thrower et al. publizierte Methode hinsichtlich einer größeren Proteinquantität zu optimieren und auf die in vitro Ubiquitinierung und Degradation von Proteinen anzuwenden, deren proteasomaler Abbau unter dem Aspekt der Epitopgenerierung immunologisch von besonderer Relevanz ist. Die biochemische und massenspektrometrische Analyse der 26S proteasomalen Degradation von penta-ubiquitinierten Derivaten des tumorassoziierten Glykoproteins Mucin1 zeigte erstens, dass die Prozessierung der Substrate zu einem 26S proteasomalen gating-Effekt führt, der von Substratbindung und -deubiquitinierung sowie von ATP-Hydrolyse abhängig ist. Zweitens ließ sich als Folge der Substratprozessierung eine Instabilisierung des 26S Proteasoms beobachten, die auf einen Assoziations-Dissoziations-Zyklus hindeutet. Drittens ergab die Untersuchung zum Einfluss des Proteasom-Aktivators PA28 auf den Abbau eines Mucin1-Polyepitops, dass PA28 eine erhöhte Quantität an 26S proteasomal generiertem Epitop verursacht. Viertens war unter Zuhilfenahme des Inhibitors clasto-Lactacystin und anhand der ubiquitinierten Mucin1-Derivate erstmals für ubiquitinierte Substrate nachweisbar, dass die proteasomale katalytische Untereinheit beta5 für die Proteindegradation durch den 26S-Komplex nicht essentiell ist. Das in der vorliegenden Arbeit etablierte Abbausystem hat zudem sein Potential unter Beweis gestellt, als ein in vivo-nahes in vitro Testsystem zu fungieren, um die Wirksamkeit von Proteasom-Inhibitoren sowie die Prozessierbarkeit von Polyepitop-Vakzinen zu bewerten. / The ubiquitin-proteasome pathway plays a major role in cellular protein degradation. By generating T-cell epitopes it contributes essentially to the immune response. The complexity of the system impeded the establishment of an in vitro approach that would make a detailed analysis of the protein degradation by the 26S proteasome possible. Finally, in 2000 Thrower et al. published an in vitro method enabling the synthesis and degradation of an ubiquitinated model substrate by the 26S proteasome. In the study presented here the approach of Thrower et al. was improved by scaling up and by the synthesis of substrates the degradation of which by the 26S proteasome is of great importance immunologically, mainly in regard to the generation of T-cell epitopes. In vitro synthesised penta-ubiquitinated versions of the tumor-associated glycoprotein mucin1 were processed by purified 26S proteasomes. The analysis of substrate degradation and product generation by biochemistry and mass spectrometry showed firstly, that substrate processing initiated a 26S proteasomal gating effect which depends on substrate binding to the proteasome, deubiquitination and proteasomal ATP-hydrolysis. Secondly, a disassembly of the 26S proteasome was observed following substrate processing which suggests a regulated association-dissociation cycle of the proteasome. Thirdly, supplementation of the degradation approach with the proteasome activator PA28 led to a higher quantity of epitope generated by the 26S proteasome out of a mucin1 polyepitope string. Fourthly, use of the proteasome inhibitor clasto-Lactacystin revealed, for the first time, that the catalytic proteasome subunit beta5 is not essential for the degradation of ubiquitinated protein substrates by the 26S proteasome. In addition, the in vitro approach established in the presented study has shown its potential to function as an in vivo-like system which helps to assess proteasome inhibitors and potential polyepitope vaccines.

Der Großteil MHC Klasse I restringierter Epitope wird bei der Proteindegradation durch das Ubiquitin Proteasom System (UPS) generiert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle des UPS in der Antigenpräsenation in einer Coxsackievirus B3 (CVB3) induzierten akuten und chronischen Myokarditis untersucht. Für in vitro Degradationsexperimente mit isolierten 20S Proteasomen wurden CVB3 Polypeptide synthetisiert und die Degradationsprodukte massenspektrometrisch analysiert. Eine erhöhte Substratumsatzrate und eine Verschiebung von Schnittpräferenzen durch Immunoproteasomen oder unter dem Einfluss von PA28 führten zu einer verbesserten Generierung immunrelevanter CVB3 Fragmente. Inflammatorische Kardiomyopathien können in Mäusen durch eine CVB3 Infektion ausgelöst werden. Resistente Stämme (C57BL/6) eliminieren das Virus vollständig, in anfälligen Mäusen (A.BY/SnJ) erfolgt keine vollständige Elimination. In Herzen gesunder Mäuse werden vorwiegend konstitutive 20S Proteasomen exprimiert. Eine myokardiale Entzündung, ausgelöst durch eine CVB3 Infektion, führte in den Herzen beider Mausstämme zu der Bildung von Immunoproteasomen, was zu einer gesteigerten Generierung immunrelevanter CVB3 Fragmente führte. Die größte Menge immunrelevanter Fragmente wurden durch Proteasomen gebildet, die am Tag vier aus den Herzen akut erkrankender C57BL/6 Mäuse und am Tag acht aus chronisch erkrankenden A.BY/SnJ Mäusen isoliert wurden. Dies korrelierte mit der Inkorporation von Immunountereinheiten in de novo assemblierende Proteasomen und einer unterschiedlichen Interferon (IFN) Typ I Kinetik. In Geweben lymphatischen Ursprungs hingegen waren Zusammensetzung und proteolytische Aktivität der Proteasomen im Verlauf der Infektion in beiden Mausstämmen unverändert. Die vorliegende Arbeit unterstreicht die Bedeutung einer zeitlich optimalen IFN Sekretion an der Infektionsstelle, die zu der Anpassung des UPS an die inflammatorischen Bedingungen führt. / The recognition of viral antigens bound to major histocompatibility complex (MHC) class I molecules by CD8+ T cells is crucial for virus elimination. Most MHC class I restricted antigenic peptides are produced by the Ubiquitin Proteasome System (UPS). In the present study, the impact of the UPS in antigen presentation during Coxsackievirus B3 (CVB3) induced acute and chronic myocarditis has been investigated. To examine whether the proteasome is involved in the generation of MHC class I ligands derived from the CVB3 polyprotein, polypeptides were synthesized for in vitro processing by 20S proteasomes. Mass spectrometry analysis demonstrated an enhanced generation of immunorelevant CVB3 fragments due to an increased substrate degradation rate and altered cleavage site preferences by immunoproteasomes or in the presence of PA28. Murine models of CVB3 induced myocarditis mimic human disease pattern with diverse outcomes. Permissive mice (A.BY/SnJ) develop chronic myocarditis with cardiac CVB3 persistence whereas resistant mice (C57BL/6) recover and eliminate the virus after acute infection. Constitutive 20S proteasomes are mainly expressed in hearts of healthy mice. Myocardial inflammation, caused by a CVB3 infection, resulted in immunoproteasome formation in hearts of both, resistant C57BL/6 and susceptible A.BY/SnJ mice, and was correlated with enhanced generation of immunorelevant CVB3 peptides. In concurrence with distinctive type I interferon kinetics, immunoproteasome formation and improved epitope generation peaked on day 4 post infection in resistant mice, and was delayed in susceptible mice. No alterations were observed in assembly and proteolytic activity of 20S proteasomes in lymphatic tissues during CVB3 infection, independent from mouse strain. The results emphasise the impact of a rapid adjustment of the UPS to viral infection due to early secretion of type I interferon at site of infection.

Die Studie beinhaltet eine biochemisch-molekularbiologische Analyse des 20S-Proteasoms und seiner Aktivierung durch Proteine der PA28-Familie. Das 20S-Proteasom ist die zentrale Epitop-prozessierende cytosolisch-nukleäre Protease des MHC-Klasse-I-Antigenpräsentationsweges. In Mikroglia, wie auch in anderen Zellen, unterliegt das Proteasom einer Interferon-g-(IFN-g)-vermittelten strukturellen Plastizität, d.h. einer Substitution der Untereinheiten der Aktiven Zentren. Durch diesen Austauschmechanismus werden proteolytische Schnittpräferenzen modifiziert, was für die Hierarchie von cytotoxischen T-Zellantworten von Bedeutung ist. Lipopolysaccharide (LPS) bewirken in Mikroglia ebenfalls Veränderungen der proteasomalen Zusammensetzung des 20S-Komplexes und seines PA700-Aktivators. Dies ist ein Hinweis auf die Rolle des Proteasoms auch bei der Prozessierung von Antigenen des endolysosomalen Antigenpräsentationsweges. Die Modulation der Zusammensetzung des 20S-Proteasoms in Mikroglia durch IFN-g und LPS ist ein weiterer Beleg für die Rolle der Mikroglia bei der zellulären Immunantwort im Zentralnervensystem. Funktionen des Proteasoms in der MHC-Klasse-I-Antigenpräsentation werden durch den Proteasomaktivator PA28 optimiert. Die PA28-Proteinfamilie besteht aus den Proteinen PA28a, PA28b und PA28g. Diese Studie trägt - basierend auf kinetischen Modellierungen, Mutagenese- und Protein-Protein-Interaktionsstudien und Untersuchungen zur MHC-Klasse-I-Antigen-präsentation in PA28-Transfektanten - zur funktionellen Neubewertung dieser drei Proteine bei. Die drei PA28-Proteine sind autonome Aktivatoren des Proteasoms. Heteromere PA28ab-Komplexe verursachen eine stärkere Aktivierung des Proteasoms als die homomeren PA28a-oder PA28b-Komplexe. Das PA28g-Protein ist in vitro ein schwacher Aktivator verschiedener proteasomaler Peptidaseaktivitäten, der dennoch in unserem in vivo-Modell eine verbesserte MHC-Klasse-I-Antigenpräsentation bewirkt. Kinetische Argumente sprechen für Funktionen der PA28a und PA28b-Proteine als Translokasen für Peptidsubstate und -produkte des Proteasoms. Anhand des HBx-Proteins des Hepatitis B-Virus wird die Möglichkeit illustriert, das vorgestellte Modell zur Analyse viraler Faktoren anzuwenden, die mit der Aktivierung des Proteasoms durch PA28 interferieren. / The 20S proteasome is the proteolytic core complex of the main cytoplasmic and nuclear protein degradation system. One of the numerous functions assigned to the 20S proteasome is the generation of antigenic peptides from intracellular proteins. MHC class I surface presentation of antigenic peptides is one key event of the cellular immune response. The presented study was aimed on the biochemical and molecular-biological analysis of the 20S proteasome and its activation by regulatory proteins of the PA28 family. In the brain, microglial cells are the major antigen presenting cells and they respond sensitive to pathologic events. Cultured mouse microglia was used as a model to study the correlation between microglial activation parameters and structural plasticity of the 20S/26S proteasome. In response to interferon-g , constitutive active site subunits were replaced by inducible subunits as described for other cellular systems. These replacements result in altered proteolytic cleavage preferences, indicating that activated microglia adapts its proteasomal subunit composition to the requirements of an optimized MHC class I epitope processing. Since lipopolysaccharide (LPS), a glycolipid of bacterial pathogens, also alters proteasome subunit composition of the 20S proteasome and its activator PA700, a function of microglial proteasome in processing of antigens of the endolysosomal pathway has been postulated. The modulation of the 20S proteasome subunit composition indicates that microglia is part of the cellular immune response in the central nervous system. The proteasome activator PA28 has been reported to optimize MHC class I antigen presentation. The PA28 protein family is composed of three proteins: PA28a, PA28b and PA28b. Based on kinetic modelling approaches, mutagenesis of activator proteins, protein-protein interaction studies and investigation of MHC class I antigen presentation in PA28-transfected cell lines a evaluation of functions of these three proteins has been performed. In vitro investigations revealed that the recombinant PA28 proteins are activators of peptidase activities of the proteasome. Heteromeric PA28ab complexes are stronger activators than homomeric PA28a o PA28b complexes. Recombinant PA28g is a weak activator of several peptidase activities. Nevertheless, in PA28g transfected B8-fibroblasts preliminary results indicate an improved MHC class I presentation. Based on kinetic evidence, a model has been presented indicating that PA28a and PA28b proteins act as peptide translocases, performing the import of substrates or the export of products into the catalytic chamber of the 20S proteasome. Finally, as examplified with the HBx protein of Hepatitis B virus, the opportunity is presented to use an in vitro reconstitution system of proteasomal activation to examine viral proteins interfering with proteasomal activation.

Immunologische Toleranz ist eine elementare Eigenschaft des Immunsystems, die primär durch die klonale Deletion autoreaktiver T-Zellen im Thymus gewährleistet wird. Neben diesem als zentrale Toleranz bezeichneten Mechanismus, verfügt ein Organismus gleichzeitig über periphere Toleranzmechanismen wie Ignoranz, Anergie und regulatorische T-Zellen. Trotz dieser Kontrollmechanismen können in bestimmten Situationen autoreaktive CD4+ und CD8+ T-Zellen aktiviert werden und meistens zu örtlich und zeitlich begrenzten Autoimmunreaktionen führen. Ursache hierfür kann die hormonelle Regulation oder das gewebespezifische Vorkommen eines Selbsttantigens sein. Am Beispiel von HSP60-kreuzreaktiven CD8+ T-Zellen konnte gezeigt werden, dass der Transfer dieser T-Zellen in Tiere zu einer Entzündung des Dünndarms aber nicht des Dickdarms führt, obwohl das Selbstantigen im letzteren wesentlich stärker exprimiert wird. Die Gewebespezifität der Autoimmunpathologie konnte durch die in den Organen unterschiedliche, proteasomale Antigenprozessierung, erklärt werden. Proteinbiochemische und immunologische Analysen ergaben, dass sich die 20S Proteasomen verschiedener Organe strukturell und funktionell deutlich unterscheiden und somit jedes Gewebe ein individuelles Repertoire von MHC-Klasse I restringierten Peptiden präsentiert. Damit wurde ein weiterer Mechanismus entdeckt, durch den Reaktivität von protektiven und pathologischen CD8+ T-Zellen kontrolliert wird. / Immunological tolerance which is primarily mediated by the clonal deletion of autoreactive T cells in the thymus is a key feature of the immune system. Besides this central tolerance, several mechanisms act also in the periphery including ignorance, anergy and regulatory T cells. Despite all these checkpoints, autoreactive CD4+ and CD8+ T cells may still be activated causing local and time restricted autoimmune-reactions. This may refer primarily to self-antigens which are hormonally regulated or tissue-specifically expressed. Adoptive transfer of crossreactive, hsp60-specific CD8+ T cells into mice induced an local inflammation of the small intestine but not the colon despite elevated expression of hsp60 in the latter organ. The pathology could be explained by the finding that the proteasomal antigen processing varies between different organs. Biochemical and immunological analyses revealed that 20S proteasomes of different organs vary in their structural and functional properties indicating that every tissue displays an individual and distinct repertoire of MHC class I peptides. This represents a new mechanism by which the activity of protective and pathological CD8+ T cell responses may be controlled.

Das Proteasom ist eine ATP- abhängige Protease, die sich aus vielen Untereinheiten zusammensetzt. Es ist für die Generierung der MHC Klasse I- restringierten Peptide verantwortlich, die im Folgenden auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Nicht-funktionelle Proteine, die als so genannte defective ribosomal products (DRIP) bezeichnet werden, stellen eine wichtige Quelle für die Generierung von antigenen Peptiden, insbesondere jedoch von viralen Peptiden dar. Generell wird die Lehrmeinung vertreten, dass der Abbau von polyubiquitinierten Proteinen durch das 26S Proteasom zur Generierung von MHC Klasse I- Liganden führt. Allerdings ist weiterhin unklar, ob virale Proteine Ubiquitin- abhängig vom Proteasom abgebaut werden. Demnach sollte im Rahmen dieser Arbeit der Proteasom- abhängige Abbau des mCMV ie pp89 Proteins vor allem hinsichtlich einer Ubiquitinierung untersucht werden. Folglich wurden Konstrukte sowohl für ein rekombinantes pp89 (rek pp89) als auch für ein ODCpp89 Fusionsprotein entworfen. Somit konnten sowohl der in vitro Abbau dieser Proteine als auch die Prozessierung des spezifischen MHC Klasse I H2-Ld Epitops verfolgt werden. Experimente zum Nachweis von Ubiquitin- Protein- Konjugaten wurden in vivo mit stabil transfizierten Mausfibroblasten (B8 Zellen) durchgeführt. Die experimentellen Daten sprechen für einen schnellen in vitro Abbau des rek pp89 durch das 20S Proteasom. Das MHC Klasse I pp89 Epitop bzw. dessen 11mer Precursorpeptid wurden dabei mit hoher Präzision generiert. Spezifische CTL Assays weisen auf die Generierung des korrekten Epitops bzw. des Precursors hin. Nach Verdau des ODCpp89 Fusionsproteins durch 26S Proteasomen in Anwesenheit von Antizym konnten mit diesem Test ebenfalls das 9mer Epitop respektive das 11mer des pp89 nachgewiesen werden. Eine potentielle Ubiquitinierung des pp89 wurde in vivo in Zellkulturen untersucht. Nach Gabe von Proteasomeninhibitoren zu Mausfibroblasten konnte eine starke Akkumulierung von Ubiquitin- Konjugaten beobachtet werden. Allerdings konnte in den verschiedenen Versuchsansätzen kein Nachweis von pp89- Ubiquitin- Konjugaten erbracht werden. Demzufolge ist für die Generierung von viralen Epitopen ein Proteasom- abhängiger, aber Ubiquitin- unabhängiger Abbauweg denkbar. / The proteasome, an ATP-dependent, multisubunit protease, is responsible for the generation of most MHC class I restricted epitopes presented on the cell surface. Non-functional proteins, also known as defectice ribosomal products (DRiP), represent an important source for the generation of antigenic peptides in general and of viral epitopes in particular. It is widely accepted that the degradation of polyubiquitinated proteins by the 26S proteasome is a prerequisite for the generation of MHC class I ligands. However, the ubiquitin dependence for the proteasomal degradation of viral proteins is an issue so far unresolved. Therefore, the aim of this study was to analyze the proteasomal degradation of the mCMV ie pp89 in respect to an anticipated ubiquitinylation. Thus, a recombinant pp89 (recpp89) as well as an ODCpp89 fusion protein were generated. The in vitro processing of these proteins and the generation of a MHC class I H2-Ld epitope by proteasomes was further studied. Murine fibroblast cell lines (B8 cells) were used to analyze any in vivo evidence for potentially existing ubiquitin-protein conjugates. The experiments show that the recpp89 protein is rapidly degraded in vitro by the 20S proteasomes and that the correct MHC class I pp89 epitope or its 11mer precursor are generated with high fidelity. Furthermore, CTL assays, indicating the generation of the specific pp89 epitope or the 11mer precursor, also suggested a 26S proteasome-dependent degradation of the mCMV pp89-ODC fusion protein in the presence of antizyme. Treating cell cultures with proteasome inhibitors resulted in a significant accumulation of ubiquitin-conjugates in vivo. However, higher molecular weight pp89-ubiquitin conjugates were not detectable throughout the entire experimental set-up. Consequently, a proteasome-dependent, but ubiquitin-independent pathway can be postulated for the generation of viral epitopes.

Dendritische Zellen (DCs) und Makrophagen sind spezialisierte antigenpräsentierende Zellen, die eigene und fremde Antigene prozessieren und mittels Haupthistokompatibilitätsmoleküle, humane Leukozytenantige (HLA) im Menschen, T-Zellen präsentieren, um Toleranzen zu induzieren oder T-Zell-vermittelte Immunantworten zu initiieren. Abhängig von ihrer Differenzierung haben sie spezifische Phänotypen und Funktionen undunterschiedliche Interaktionen mit Pathogenen, in dieser Arbeit durch Leishmania donovani (LD) repräsentiert, welche in Phagolysosomen der Makrophagen propagieren. Der Einfluss der Differenzierungszustände und von intrazelluläre Infektionen auf die Antigenprozessierung und -präsentation waren weitgehend undefiniert. Um hier Einblick zu gewinnen, haben wir die HLA-I-präsentierten Selbstpeptidome von menschlichen unreifen und reifen DCs, die aus der MUTZ3-Zelllinie generiert wurden, und LD-infizierte bzw. nicht-infizierte aus der THP1-Zelllinie generierte Makrophagen mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS), sowie die Proteasom-Zusammensetzung per RT-PCR und die HLA-Expression und Aktivierungszustände der Zellen per Durchflusszytometrie analysiert und verglichen. Wir fanden, dass die HLA-I-Selbstpeptidome der Zellen heterogen und individualisiert waren, von Nonapeptiden dominiert wurden und ähnliche HLA-Bindungsaffinitäten und Ankerreste aufwiesen. Sie stammten aus Quellenproteinen aus fast allen subzellulären Lokalisationen und mit unterschiedlichen zellulären Funktionen in ähnlichen Anteilen und schlossen Tumor-assoziierter Antigene (TAAs) ein. Die Persistenz der LD hatte keinen Einfluß auf den Aktivierungszustand der Makrophagen, verursachte aber eine weitgehende Veränderungen des Peptidoms, der HLA-Bindungsaffinitäten und Ankerreste, der Quellproteine einschließlich TAAs und der HLA- und Proteasom-Expression. / Dendritic cells (DCs) and macrophages are specialized antigen presenting cells that process self and foreign antigens and present them to T cells via major histocompatibility complex molecules, human leukocyte antigens (HLA) in humans, for induction of tolerance or initiation of T cell-mediated immune responses. Related to differentiation state, they have specific phenotypes and functions, and varied interactions with pathogens herein exemplified by Leishmania donovani (LD) that parasitize macrophages and propagate within their phagolysosomes. The impact of the differentiation state and intracellular infection on antigen processing and presentation by HLA class I remained undefined. To gain insight, we analyzed and compared the HLA-I self peptidomes of MUTZ3 cell line-derived human immature and mature DCs, and THP1 cell line-derived LD-infected and none-infected macrophages by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), as well as proteasome compositions by quantitative RT-PCR, and HLA expression and cell activation states by flow cytometry. We found that the HLA I-presented self-peptidomes of the cells in the different states were heterogeneous and individualized, dominated by nonapeptides with similar HLA binding affinities and anchor residues. They were sampled from source proteins of almost all subcellular locations and from proteins involved in various cellular functions in similar proportion including tumour-associated antigens (TAAs). The persistence of LD within the macrophage, did not affect macrophage activation. However, its impact was observed in self-peptidome heterogeneity, HLA binding affinities, anchor residue preferences, source protein peptide sampling (including TAAs) and HLA and proteasome expression.

Im Kampf gegen eine Virusinfektion spielen CD8+ T Zellen des adaptiven Immunsystems eine besondere Rolle. Sie patroullieren im Körper und entdecken spezifische Virusepitope, welche mittels MHC Klasse I Molekülen auf der Oberfläche infizierter Zellen präsentiert werden. Wird eine virus-infizierte Zelle erkannt, kann diese schnell und effizient eliminiert. Für die Generierung viraler Peptide, welche auf MHC Klasse I Komplexe geladen werden, ist das Ubiquitin-Proteasom-System von essentieller Bedeutung. Kürzlich wurden weitere Funktionen des Immunoproteasoms aufgedeckt wie zum Beispiel der Schutz gegen oxidativen Stress. Innerhalb der vorliegenden Arbeit konnte die Fähigkeit des Immunoproteasoms gegen eine Akkumulation oxidativ geschädigter Proteine zu schützen mit der Generierung von MHC Klasse I Liganden kombiniert und neu interpretiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass während einer Virusinfektion in Nicht-Immunzellen die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies durch die alternative NADPH Oxidase Nox4 eine bedeutende Rolle spielt. Die Aktivierung von Nox4 resultiert in der Akkumulation oxidativ geschädigter Proteine. Innerhalb von zwei Stunden nach dem Eintreten von Viruspartikeln in die Zellen wurden strukturelle Virusproteine oxidiert und anschließend ubiquityliert. Die gleichzeitige, virus-induzierte Expression von Immunoproteasomen führte zu einem schnellen und effizienten Abbau ubiquitylierter Virusantigene. Infolgedessen konnten immundominante Virusepitope vermehrt freigesetzt werden. Folglich wurde ein soweit unbekannter Mechanismus gefunden, welcher Substrate für das Proteasom zur Generierung von MHC Klasse I Liganden bereitstellt. Zusammenfassend konnte innerhalb dieser Arbeit gezeigt werden, dass das Immunoproteasom den Schutz vor oxidativen Stress mit der Generierung antigener Peptide verbindet, wodurch eine effektive adaptive Immunantwort etabliert werden kann. / An efficient immune control of virus infection is predominantly mediated by CD8+ T cells which patrol through the body and eliminate infected cells. Infected cells are recognized when they present viral antigenic peptides on their surface via MHC class I molecules. To make antigenic peptides available for loading on MHC class I complexes, the ubiquitin proteasome system plays a crucial role. Moreover, the induction of the i-proteasome is known to support the generation of MHC class I ligands. Recently, new functions of the i-proteasome have been discovered. Evidence is increasing that the i-proteasome is involved in the protection of cells against oxidative stress. Within this thesis the characteristic of the i-proteasome to protect cells against the accumulation of oxidant-damaged proteins could be linked to its role in improving the generation of MHC class I ligands. It could be demonstrated that during a virus infection in non-immune cells the production of reactive oxygen species by the alternative NADPH oxidase Nox4 is of critical importance resulting in the accumulation of potentially toxic oxidant-damaged proteins. Indeed, within two hours of infection structural virus proteins were oxidized and subsequently poly-ubiquitylated. The concomitant formation of i-proteasomes led to a rapid and efficient degradation of ubiquitylated virus antigens thereby improving the liberation of immunodominant viral epitopes. In conclusion, a so far unknown mechanism to fuel proteasomal substrates into the MHC class I antigen presentation pathway has been revealed. A new protein pool consisting of exogenously delivered viral proteins provides proteasomal substrates in the very early phase of a virus infection. Within the scope of this thesis the i-proteasome has been shown to link the protection against oxidative stress, initiated directly by pathogen recognition, with the generation of antigenic peptides. Together, an effective adaptive immune response is triggered.

Das Ubiquitin-Proteasom-System ist an der Degradation cytosolischer Proteine und der Generierung von Antigenen beteiligt, die über MHC Klasse I Moleküle CD8+ T Zellen präsentiert werden. Die Antigenprozessierung wird durch Typ I und II Interferone beeinflusst, welche die Formierung des Immunoproteasoms und des Proteasomen-Aktivators PA28 induzieren und so die katalytische Aktivität des Ubiquitin-Proteasom-Systems qualitativ verändern. In der vorliegenden Arbeit wurde im Zellkulturmodell unter dem Einfluss von IFN gamma die zunehmende Inkorporation der Immunountereinheiten in de novo assemblierende 20S Proteasomen und die daraus resultierende Veränderung der proteolytische Aktivität untersucht. Die Inkorporation der Immunountereinheiten wurde mittels 2D Gelelektrophorese und Western Blots von 20S Proteasomen untersucht, die nach unterschiedlicher Stimulationsdauer mit IFN gamma aus HeLa Zellen isoliert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass innerhalb der ersten 24h einer IFN gamma Stimulation die strukturelle Heterogenität des zellulären Proteasomenpools zunimmt, indem sowohl intermediäre als auch Immunoproteasomen assemblieren. In der Nativ-PAGE von Lysaten IFN gamma stimulierter Zellen wurde eine Zunahme des 20S Proteasoms als freier Komplex und in Assoziation mit PA28 beobachtet, während die Menge des zum ATP-abhängigen Abbau von polyubiquitinierten Proteinen notwendigen 26S Proteasoms unverändert blieb. Die Stimulation mit IFN gamma hatte eine Steigerung der gesamtproteasomalen Aktivität zur Folge, die unter Inhibition der Interaktion zwischen 20S Proteasom und PA28 verzögert erfolgte. Die katalytischen Eigenschaften isolierter Proteasomen wurden anhand der Generierung eines immunrelevanten Hepatitis C CTL Epitops des viralen Core Proteins in vitro untersucht. Im Verlauf der IFN gamma Stimulation de novo assemblierte Proteasomen wiesen jeweils unterschiedliche Präferenzen für die Generierung des untersuchten CTL Epitops auf. Eine weitere, proteasomen-spezifische Änderung der katalytischen Aktivität bewirkte die Assoziation des Proteasomen-Aktivators. Innerhalb der ersten zwölf Stunden einer IFN gamma Stimulation wurde das Epitop vermehrt mit der Unterstützung des Proteasomen-Aktivators generiert, nach 24 Stunden zunehmend durch freies 20S Proteasom. Die Ergebnisse der vorgestellten Arbeit zeigen, dass Strukturvarianten des Proteasoms zusammen mit PA28 redundant funktionieren und eine hohe proteolytische Plastizität des UPS gewährleisten. / The ubiquitin proteasome system is responsible for the degradation of cytosolic proteins and the processing of MHC class I restricted antigens. The generation of these antigens is influenced by type I and II interferons which induce the expression of immunoproteasomes and the proteasome activator PA28; and thereby impact the quality of peptides processed by the proteasome system. The adoption of the proteasome system to a proinflammatory environment has been investigated in a cell culture model by isolating proteasomes after different stages of IFN gamma stimulation. The composition of isolated proteasomes was analysed by 2D PAGE and western blot approach. The presented work shows that within 24h of IFN gamma stimulation an increasing heterogeneity of the cellular proteasome pool is observed, resulting from the assembly of both intermediate type proteasomes and immunoproteasomes at the early stage of IFN gamma stimulation. It could be shown by native PAGE of HeLa cell lysates that IFN gamma induces increasing amounts of 20S proteasomes and PA28 associated proteasomes without decreasing the amount of 26S proteasomes that are necessary for the ATP dependent degradation of ubiquitinated proteins; and resulting in an enhanced total proteasomal activity in vitro. This increase in activity was delayed when the interaction of 20S proteasomes and PA28 was inhibited. A comparative analysis of the ability of isolated 20S proteasomes to generate a known hepatitis C virus derived CTL epitope in vitro proved that during early IFN gamma stimulation de novo assembled proteasomes exhibited a structure specific preference to generate the HCV CTL epitope either alone or in combination with the proteasome activator PA28. Within the first 12h of IFN gamma stimulation the epitope was generated with higher efficiency by 20S proteasomes in association with PA28, whereas after 24h the impact of PA28 on the proteasome pool was less pronounced. The presented work shows that IFN gamma induces a heterogeneity of 20S proteasomes in the early stage of stimulation, acting in combination with the proteasome activator in a redundant manner; and provides a high proteolytic placticity of the proteasome system.