Dysfunktionale Angiogenese spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung mikrovaskulärer Spätkomplikationen bei Diabetespatienten. Ziel der Dissertation ist es, die Auswirkungen der chronischen Hyperglykämie auf die Angiogenese im in vitro Diabetesmodell, sowie den Einfluss einer Proteinkinase C-Inhibition und β2-Adrenozeptorstimulation zu untersuchen. Die Experimente wurden an humanen umbilicalen Endothelzellen im Angiogeneseassay durchgeführt.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1. Einführung 1.1. Diabetes mellitus 1.2. Endothel und Angiogenese 1.3. Diabetes mellitus und Endotheliale Dysfunktion 1.4. Therapeutische Interventionsmöglichkeiten und Forschungsbedarf 2. Fragestellung 3. Material 3.1. Zellkultur 3.2. Angiogeneseassay 3.3. Allgemeine Chemikalien 3.4. Herstellung der einzelnen Lösungen 3.4.1. Allgemeine Lösungen 3.4.2. Zellkultur 3.4.3. Angiogeneseassay 3.5. Software 4. Methoden 4.1. Ethikerklärung 4.2. Versuchsaufbau 4.3. Zellkultur 4.3.1. Gelatinebeschichtung von Zellkulturgefäßen 4.3.2. Präparation von Endothelzellen 4.3.3. Kultivierung und Passage der Endothelzellen 4.4. Angiogenese Assay (3D-Kultur) 4.4.1. Versuchsprotokoll Tag 1 4.4.2. Matrigelherstellung 4.4.3. FITC-Lektin-Färbung 4.4.4. Versuchsprotokoll Tag 2 4.4.5. DAPI-Färbung 4.4.6. Auswertung Angiogenese Assay 4.4.7. Eindeckelung 4.5. Statistische Analyse und Textverarbeitung 5. Ergebnisse 5.1. Menschliche venöse Endothelzellen aus der Nabelschnur (HUVECs) in der Zellkultur 5.2. Der Einfluss von Hyperglykämie (D-Glukose), 3-O-Methyl-D-Glukose und L-Glukose auf die Angiogenese 5.3. Der Effekt von Salbutamol unter normoglykämischen Bedingungen auf die Angiogenese 5.4. Der Effekt von Salbutamol und Bisindolylmaleimid 1 unter hyperglykämischen Bedingungen auf die Angiogenese 6. Diskussion der verwendeten Methoden 6.1. Zellkultur 6.2. Angiogeneseassay 6.3. Simulation des Diabetes mellitus im Zellkulturmodell 7. Diskussion der Ergebnisse 7.1. Effekte der Hyperglykämie auf die Angiogenese 7.2. Endotheliale Dysfunktion, verminderte NO-Bioverfügbarkeit und eingeschränkte Angiogenese 7.3. Pathomechanismen der Hyperglykämie induzierten endothelialen Dysfunktion –Akkumulation reaktiver Sauerstoffverbindungen 7.4. Hyperglykämie induzierte metabolische Signalwege 7.4.1. Steigerung des Polyolweges 7.4.2. Steigerung des Hexosaminweges 7.4.3. Akkumulation von AGEˈs (Advanced glycation end products) 7.4.4. Aktivierung des PKC-Signalweges 7.5. Die Effekte von Pharmaka auf die Angiogenese von unter Hyperglykämie kultivierten HUVEC – PKC-Inhibition durch BIM 7.6. Die PKC-Inhibition als therapeutischer Angriffspunkt 7.6.1. Der Effekt der PKC-Inhibition auf die endotheliale Funktion in Diabetesmodellen 7.6.2. Der Effekt der PKC-Inhibition auf die Angiogenese in Diabetesmodellen 7.6.3. Der Effekt der PKC-Inhibition auf mikrovaskuläre Komplikationen des Diabetes in klinischen Studien 7.6.4. Ein Ausblick 7.7. Die Effekte von Pharmaka auf unter Hyperglykämie kultivierte HUVEC – Der Effekt der Behandlung mit Salbutamol 8. Zusammenfassung der Arbeit 9. Literaturverzeichnis 10. Abbildungsverzeichnis 11. Tabellenverzeichnis

Typ-2-Diabetiker haben ein hohes kardiovaskuläres Risiko. Es wurden 23 Typ-2-Diabetiker in eine Interventions- und eine Kontrollgruppe randomisiert. Die Interventionsgruppe nahm an einem multifaktoriellen Sekundärpräventionsprogramm mit Fokus auf intensivem körperlichen Training teil. Die Kontrollgruppe wurde leitlinienkonform durch die Hausärzte therapiert. Nach einem vierwöchigen stationären Training trainierte die Interventionsgruppe über fünf Monate zu Hause. Beide Gruppen wurden bei Studienbeginn, nach vier Wochen und nach sechs Monaten umfassend untersucht (Ergometrie, Labordiagnostik verschiedener Stoffwechselparameter, Messung der Endothelfunktion, Quantifizierung der koronaren Plaquelast). Nach vier Wochen sowie nach sechs Monaten Training zeigte sich in der Interventionsgruppe eine Verbesserung von Gewicht, BMI, maximaler Trainingsintensität und Trainingsdauer. Weiterhin zeigte sich nach vier Wochen Training eine signifikante Verbesserung der Stoffwechselparameter, die nach sechs Monaten nicht mehr nachweisbar war. Die Endothelfunktion verbesserte sich erst nach sechs Monaten Training signifikant. Die koronare Plaquelast veränderte sich nicht. Die Kontrollgruppe zeigte zu keinem Zeitpunkt Veränderungen. Ein intensives multifaktorielles Interventionsprogramm kann die endotheliale Dysfunktion der Koronararterien von Typ-2-Diabetikern korrigieren, ohne eine quantitative Regression der Atherosklerose zu erreichen. Ein stationäres Training verbessert die Stoffwechselsituation gegenüber einem Heimtraining, vermutlich durch verbesserte Compliance und bessere diätetische Kontrolle.

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Typ-2-Diabetiker haben ein hohes kardiovaskuläres Risiko. Es wurden 23 Typ-2-Diabetiker in eine Interventions- und eine Kontrollgruppe randomisiert. Die Interventionsgruppe nahm an einem multifaktoriellen Sekundärpräventionsprogramm mit Fokus auf intensivem körperlichen Training teil. Die Kontrollgruppe wurde leitlinienkonform durch die Hausärzte therapiert. Nach einem vierwöchigen stationären Training trainierte die Interventionsgruppe über fünf Monate zu Hause. Beide Gruppen wurden bei Studienbeginn, nach vier Wochen und nach sechs Monaten umfassend untersucht (Ergometrie, Labordiagnostik verschiedener Stoffwechselparameter, Messung der Endothelfunktion, Quantifizierung der koronaren Plaquelast). Nach vier Wochen sowie nach sechs Monaten Training zeigte sich in der Interventionsgruppe eine Verbesserung von Gewicht, BMI, maximaler Trainingsintensität und Trainingsdauer. Weiterhin zeigte sich nach vier Wochen Training eine signifikante Verbesserung der Stoffwechselparameter, die nach sechs Monaten nicht mehr nachweisbar war. Die Endothelfunktion verbesserte sich erst nach sechs Monaten Training signifikant. Die koronare Plaquelast veränderte sich nicht. Die Kontrollgruppe zeigte zu keinem Zeitpunkt Veränderungen. Ein intensives multifaktorielles Interventionsprogramm kann die endotheliale Dysfunktion der Koronararterien von Typ-2-Diabetikern korrigieren, ohne eine quantitative Regression der Atherosklerose zu erreichen. Ein stationäres Training verbessert die Stoffwechselsituation gegenüber einem Heimtraining, vermutlich durch verbesserte Compliance und bessere diätetische Kontrolle.

Diabetes mellitus und seine schwerwiegenden Folgen im Gefäßsystem stellen ein großes Problem der heutigen Gesellschaft dar. Ein wichtiger Aspekt der Erkrankung sind die Mikro- und Makroangiopathien, die im schlimmsten Fall zum Apoplex oder Tod führen. Es existieren bereits Hinweise, dass proinflammatorische Zytokine wie TNFα an der Entstehung des Diabetes mellitus beteiligt sind. TNFα führt zu einer Aktivierung der DLK und ihrer untergeordneten Kinase JNK, was in Betazellen zur Apoptose führt. In der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle und Regulation der DLK in Gefäßzellen untersucht werden. Zusätzlich wurde die Angiogenese bei diät-induzierter Adipositas und Diabetes melitus in einem Mausmodell untersucht. Immunhistochemische Untersuchungen zeigen, dass die DLK in Endothelien und in glatten Muskelzellen der Aorta exprimiert wird. Um die Aktivierung und somit die Phosphorylierung der DLK zu untersuchen, wurde ein spezieller Antikörper, der an S-302 der DLK bindet, bei der Immunoblotanalyse verwendet. Eine Phosphorylierung an S-302 entspricht einer Aktivierung der DLK. Eine Behandlung von humanen Endothelzellen aus der Nabelschnurvene (HUVECs) mit TNFα zeigen eine Phosphorylierung der DLK und ihrer untergeordneten Kinase JNK. Eine Aktivierung durch Leptin oder dem vaskulären Wachstumsfaktor (VEGF) konnte hingegen nicht gezeigt werden. Zusätzlich zeigt eine Behandlung mit dem JNK-Inhibitor SP600125 eine verminderteTNFα-induzierte DLK- und JNK-Phosphorylierung, was zu der Annahme führt, dass in HUVECs die Aktivierung von JNK zu einer Phosphorylierung der DLK führt. Die Untersuchungen im Tiermodell lieferten Hinweise, dass die Regulation von TNFα ein entscheidender therapeutischer Ansatzpunkt bei der Entstehung endothelialer Dysfunktion darstellt. Es wurde gezeigt, dass das Ausschalten nur eines Allels der DLK einen messbaren Unterschied in Zusammenhang mit früher Kollateralbildung nach Ischämie erbringt. In Zusammenschau der vorliegenden Ergebnisse kann festgestellt werden, dass die Regulation der DLK durch TNFα in endothlialen Zellen einen wichtigen Aspekt in der Entwicklung der endothelialen Dysfunktion darstellt und dass die DLK als kollateralfördernde Kinase eine wichtige Rolle in der Revaskularisierung nach Ischämie spielt.

There is increasing evidence that chronic inflammation is tightly linked to diseases associated with endothelial dysfunction, including the induction of aberrant angiogenesis. While leukocytes have been described as mediators of inflammation-associated angiogenesis, the effects of direct chronic endothelial activation have not been addressed in this context. Using an uncleavable mutant of the transmembrane form of tumor necrosis factor-α (TNF-α), we have established models of stable TNF-α expression in endothelial cells in vitro and in transgenic mice in vivo. In the in vitro model, continuous endothelial activation leads to increased leukocyte cellular adhesion molecule expression and intracellular reactive oxygen species, hallmarks of a proinflammatory and dysfunctional endothelium. In addition, stable expression of TNF-α in endothelial cells increased angiogenic sprout formation in the presence but also in the absence of angiogenic growth factors. The partial neutralization of this effect by TNF-α antibodies and the inability of conditioned media from stable TNF-α-expressing endothelial cells to induce angiogenic activities in control endothelial cells suggest that this effect does not require expression of additional autocrine factors, but is an autonomous effect of the transmembrane TNF on the endothelial cells. Furthermore, using the Matrigel plug assay in vivo, increased angiogenesis was observed in endothelial TNF-α-expressing transgenic versus control mice. In conclusion, chronic inflammatory changes mediated by TNF-α can induce angiogenesis in vitro and in vivo, suggesting endothelial cell activation as a direct link between inflammation and angiogenesis. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

There is increasing evidence that chronic inflammation is tightly linked to diseases associated with endothelial dysfunction, including the induction of aberrant angiogenesis. While leukocytes have been described as mediators of inflammation-associated angiogenesis, the effects of direct chronic endothelial activation have not been addressed in this context. Using an uncleavable mutant of the transmembrane form of tumor necrosis factor-α (TNF-α), we have established models of stable TNF-α expression in endothelial cells in vitro and in transgenic mice in vivo. In the in vitro model, continuous endothelial activation leads to increased leukocyte cellular adhesion molecule expression and intracellular reactive oxygen species, hallmarks of a proinflammatory and dysfunctional endothelium. In addition, stable expression of TNF-α in endothelial cells increased angiogenic sprout formation in the presence but also in the absence of angiogenic growth factors. The partial neutralization of this effect by TNF-α antibodies and the inability of conditioned media from stable TNF-α-expressing endothelial cells to induce angiogenic activities in control endothelial cells suggest that this effect does not require expression of additional autocrine factors, but is an autonomous effect of the transmembrane TNF on the endothelial cells. Furthermore, using the Matrigel plug assay in vivo, increased angiogenesis was observed in endothelial TNF-α-expressing transgenic versus control mice. In conclusion, chronic inflammatory changes mediated by TNF-α can induce angiogenesis in vitro and in vivo, suggesting endothelial cell activation as a direct link between inflammation and angiogenesis. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.