Depuis plusieurs années, le tissu adipeux est reconnu comme un organe complexe et extrêmement important au maintien de l'homéostasie chez les mammifères. En effet, une dérégulation de sa taille et/ou de ses fonctions endocrines peut mener à l'apparition de nombreuses pathologies potentiellement mortelles, telles que le diabète de type II, l'hypertension ou encore des troubles cardiovasculaires. Ainsi, il est d'une importance capitale de bien comprendre les phénomènes moléculaires qui entourent la différenciation des cellules graisseuses afin de mieux réagir en clinique lors de l'apparition de telles conditions. Dans cette thèse, j'ai étudié le rôle d'une protéine kinase appelée dual leucine zipper-bearing kinase (DLK) dans la formation du tissu graisseux en utilisant un modèle cellulaire murin à différenciation inductible, les 3T3-L1. À l'aide d'approches pharmacologiques et d'ARN interférence, j'ai pu démontrer que cette protéine est essentielle à l'adipogenèse. En effet, une diminution de l'expression de DLK dans les cellules 3T3-L1 bloque la différenciation à un stade précoce, i.e. entre la liaison du facteur de transcription C/EBP[béta] à l'ADN et l'expression de ses gènes cibles, tels que C/EBP[alpha] et PPAR[gamma]. L'étude plus poussée des voies de signalisation des MAPKs à l'aide d'inhibiteurs pharmacologiques dans des cellules où l'expression de DLK a été diminuée a révélé que l'action bénéfique de DLK lors de la différenciation se situe au niveau de la voie ERK. En effet, l'induction de DLK au cours de l'adipogenèse résulte en une diminution de l'association des protéines KSR-1, Mek et ERK, ce qui mène à une diminution temporaire de l'activité de ERK et de la phosphorylation inhibitrice sur la sérine 82 du régulateur central de la différenciation des adipocytes, PPAR[gamma]. Finalement, nous avons pu déterminer que l'induction de DLK au cours de la différenciation des cellules graisseuses est modulée par PPAR[gamma].

Le corps humain est composé de plusieurs milliards de cellules neuronales, lesquelles ont un impact primordial sur les systèmes vitaux. En effet, le système nerveux, étant lui-même un système vital du corps humain, effectue de nombreuses fonctions afin de voir au bon fonctionnement des autres systèmes du corps, tels que le système cardiovasculaire, le système digestif, le système musculaire et bien d’autres. Plusieurs maladies neurodégénératives telles que l’Alzheimer et la maladie de Creutzfeldt-Jakob, affectent les cellules nerveuses du corps et occasionnent la perte de différentes fonctions causant une diminution du bien-être et pouvant mener à la mort. La hausse du nombre d’individus atteint de maladies neurodégénératives observée au fils des ans nous montre l’importance de comprendre les phénomènes moléculaires qui se produisent lors des mécanismes de dégénérescence axonale dans les neurones. Lors de ma maîtrise dans le laboratoire du professeur Richard Blouin, j’ai étudié l’impact d’une augmentation intracellulaire de calcium sur la protéine dual leucine zipper kinase (DLK) en utilisant un modèle cellulaire humain, les SH-SY5Y. J’ai pu démontrer que l’entrée de calcium dans la cellule avait un impact sur la quantité de protéine DLK présente dans celles-ci. En effet, j’ai pu observer une diminution de la quantité de DLK dans les cellules suite à une entrée de calcium, un phénomène exclusivement calcium-dépendant. À l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques, j’ai pu montrer l’implication, des calpaïnes, des protéases calcium-dépendantes reconnues pour leur rôle dans la dégénérescence axonale. Les essais in vitro montrent que DLK est une cible spécifique des calpaïnes.

Dlk is a transmembrane protein that possesses six epidermal growth factor-like sequences at the extracellular domain, a single transmembrane domain and an intracellular tail. The extracellular EFG-like region of Dlk can be released by action of an unknown protease that cuts the extracellular region near the cell membrane. Dlk belongs to the EGF-like homeotic protein family and has received many names: pG2, FA-1, Pref-1, SCP-1, ZOG and Dlk. All the proteins are identical or polymorphic products of a single gene. Dlk has been involved in several differentiation processes, such as adipogenesis, hematopoiesis and neuroendocrine differentiation. Dlk is also known as the preadipocyte factor-1 (Pref-1), is highly expressed in preadipocytes but is completely abolished in adipocytes. Pref-1 may function in the maintenance of the preadipocyte state and is a negative regulator of adipocyte differentiation. Dlk is expressed in tumors with neuroendocrine features, such as human neuroblastoma, rat pheochromocytoma, and a subset of Small Cell Lung Cancer (SCLC) cell lines. The Dlk expression is probably associated with some differentiation stages because the most undifferentiated cells were lacking expression of Dlk. The finding suggests that Dlk plays an important role in differentiation and tumorigenesis of several cell types. The study was designed to examine the influence of dlk overexpression on tumorigenicity of hepatoma cells. We constructed the mammalian expression vectors for full-length dlk, dlk extracellular domain, which were transfected into SK-Hep-1 cells for generation of stable clones. The transgene expressions in selected stable clones were verified by QRT-PCR and western blot analysis. Our results indicated that overexpression of extracellular domain significantly promoted the viability of SK-Hep1 cells during serum deprivation. In SCID mice, injection of full-length dlk clones led to increased tumor growth compared with the control groups. However, the migration ability was reduced in Dlk stable clones. In summary, these results suggested full-length Dlk promoted the tumor growth but reduced the migration ability of SK-Hep1 cells.

The development of a stereotyped pattern of neural connectivity depends upon the behavior of growth cones, motile structures at the tips of axons that propel axon growth and steer the axon to its targets. When growth cones reach their appropriate target cells, they halt and ultimately remodel into stationary presynaptic boutons. The influence of extracellular cues in directing growth cones to their targets is well studied, but cell-intrinsic factors are also increasingly appreciated for their role in driving much of growth cone behavior. Dual leucine zipper kinases (DLKs) promote growth cone motility and must be kept in check to ensure normal development. PHR (Pam/Highwire/RPM-1) ubiquitin ligases therefore target DLK for proteosomal degradation unless axon injury occurs. Overall DLK levels decrease during development, but how DLK levels are regulated within a developing growth cone has not been examined. We analyzed the expression of the fly DLK Wallenda (Wnd) in R7 photoreceptor growth cones as they halt at their targets and as they remodel into presynaptic boutons. We found that Wnd protein levels are repressed by the PHR protein Highwire (Hiw) during R7 growth cone halting, as has been observed in other systems. However, during remodeling, Wnd levels are further repressed by a temporally-expressed transcription factor, Tramtrack69 (Ttk69). Previously unobserved negative feedback from JNK also contributes to Wnd repression. We conclude that maturing neurons progressively deploy additional mechanisms to keep DLK off and thereby protect their connectivity. We use live imaging to directly probe the effects of Wnd and Ttk69 on remodeling R7 growth cones and conclude that Ttk69 coordinates multiple regulators of this process. Preliminary results indicate that excess Wnd signaling requires the transcription factor Fos to disrupt growth cone remodeling in R7s. This opens up new strategies to identify how Wnd exerts its motility-promoting effects on growth cone cytoskeletons. Additional findings point to a later requirement for Wnd in normal R7 synapse development, suggesting that Wnd expression is not fully silenced in R7s. Further investigation into these findings would greatly advance our understanding of how the neuronal cytoskeleton is regulated as neurons undergo profound morphological and functional changes while developing. This dissertation includes both unpublished and published co-authored material. This dissertation also includes supplemental movie files, which can be found online and are described in Appendix B.

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Die Pathophysiologie des Diabetes mellitus Typ 2 ist gekennzeichnet durch einen fortschreitenden Verlust an funktioneller β-Zellmasse mit unzureichender Insulinbiosynthese und Insulinsekretion. Die Transkription des Insulingens ist eine wichtige β-Zell-spezifische Funktion. Der Transkriptionsfaktor MafA ist für die Aufrechterhaltung der β-Zell-Funktion bedeutend. Die MAPK Dual Leucin-Zipper Kinase (DLK) ist an der MafA-abhängigen Insulingentranskription beteiligt. In der vorliegenden Arbeit konnte mithilfe einer β-Zelllinie gezeigt werden, dass die DLK MafA hemmt. Daten aus Luciferase-Reportergenassays zeigten, dass über eine Hemmung der transkriptionellen Aktivität von MafA und über eine Hemmung der humanen Insulingentranskription die DLK zum Verlust der Insulinbiosynthese beitrug. Aus Immunoblotanalysen ging hervor, dass die Proteinmenge von MafA durch die DLK vermindert wurde. Mithilfe von Kernerkennungssequenzmutanten der DLK konnte nachvollzogen werden, dass die hemmende Wirkung der DLK auf die transkriptionelle Aktivität von MafA außerhalb des Zellkerns stattfand, vermutlich indem die DLK die ihr untergeordnete Kinase JNK aktivierte, welche wiederum MafA phosphorylierte und hemmte. Die DLK hemmte die Transkription des als Glucosesensor fungierenden Enzyms Glucokinase, welches für eine adäquate Insulinsekretion vonnöten ist. Mit einer Hemmung des anti-apoptotischen Proteins Bcl-xL durch die DLK wurden weitere Hinweise auf eine Beteiligung der DLK an der β-Zell-Apoptose geliefert. Eine Hemmung der Funktion der DLK könnte ein therapeutischer Ansatz sein, um eine weitere Progression des Diabetes mellitus Typ 2 zu verhindern.

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