In eukaryotes protein degradation is performed by the ubiquitin-proteasome system. The 26S proteasome, a 2.5MDa large multimeric molecular machine, consists of more than 30 subunits and represents the core component of this proteolytic pathway. The complex is assembled from a proteolytically active 20S proteasome and two 19S regulator cap complexes. So far crystal structure, topology and enzymatic mechanism have only been elucidated for the 20S proteasome core particle (CP). CPs are assembled from four stacked rings of seven subunits each, following an alpha7beta7beta7alpha7-stochiometry. The strict established order of the proteasomal assembly and maturation is essential to prevent uncontrolled and premature protein degradation in the cell. CPs belong to the class of Ntn-hydrolases. Peptide hydrolysis is performed inside a central cavity at the active sites of the beta-type subunits, with Ogam of the hydroxyl group of the N-terminal threonine acting as the nucleophile. Release of the proteolytically active threonine through N-O-Acetyl rearrangement is the last step of the proteasomal assembly. Compartmentalisation of CPs is an important way to regulate substrate access to the central cavity as well as release of the generated oligopeptides. The activity of eukaryotic CPs are controlled by an unique mechanism: docking of regulatory complexes, like Blm3, PA28 or 19S, causes a conformational change of the N-terminal residues of the latent alpha-subunits, resulting in an activation of the proteolytically active sites. Archaebacterial CPs lack such regulatory gating mechanism. The controlled degradation of proteins by the proteasome dominates a variety of biological essential processes, like metabolic adaptation, apoptosis, inflammation, immune and stress response, as well as cell proliferation and cell differentiation. Selective and specific natural and synthetic inhibitors of CPs might find their practical application in treatment of cancer or inflammatory diseases.

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Es ist bekannt, dass eine diabetische Stoffwechsellage über einen gesteigerten Proteinabbau zu einer Muskelatrophie führen kann. Ein zentrales System beim Abbau von Muskelproteinen ist hierbei das Ubiquitin-Proteasom-System mit seinen zwei spezifischen E3-Ligasen MuRF-1 und MAFbx. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss einer Hyperglykämie auf die Expression von Proteinen des Ubiquitin-Proteasom-Systems im Skelett- und Herzmuskel zeit- und konzentrationsabhängig zu untersuchen. Insbesondere stand die Expression der E3-Ligasen MuRF-1 und MAFbx sowie die daraus folgende Auswirkung auf die Protein-Ubiquitinylierung im Fokus der Untersuchungen. Weiterhin sollte der Einfluss der Hyperglykämie auf die Apoptoserate von Skelett- und Herzmuskelzellen analysiert werden. Seit Kurzem stehen die GLP-1-Analoga als neue Antidiabetika für die Therapie des Diabetes mellitus Type II zur Verfügung. Da in Studien bereits positive Effekte der GLP-1-Analoga am Herzmuskel festgestellt wurden, sollte in der vorliegenden Studie geprüft werden, ob das GLP-1-Analogon Liraglutid die Veränderungen am Herzmuskel beeinflussen kann. Um die Fragestellungen zu klären, wurden verschiedene Untersuchungen in der Zellkultur durchgeführt. Skelettmuskel Myoblasten (undifferenzierte C2C12-Zellen), Skelettmuskel Myotuben (differenzierte C2C12-Zellen) und neonatale Rattenkardiomyozyten wurden unterschiedlichen Glukosekonzentrationen (5mM, 12mM, 25mM) für 24 oder 72 Stunden ausgesetzt. Die Herzmuskelzellen wurden zusätzlich in den Glukosekonzentrationen unter Zusatz von 12 mg/ml Liraglutid für 72h inkubiert. Die Expression der E3-Ligasen wurde mit qRT-PCR (MuRF-1 und MAFbx) und Western Blot (MuRF-1) quantifiziert. Die Poly-Ubiquitinylierung wurde mittels Western Blot bestimmt. Unter Verwendung des Cell Death Detection ELISA (Roche Diagnostics) wurde die Apoptoserate evaluiert. Die Inkubation von Skelett- und Herzmuskelzellen für 24 h mit hyperglykämischen Medium hatte kaum einen Einfluss auf die Expression von MuRF-1 und MAFbx sowie die Apoptoserate. Bei einer Inkubationszeit von 72 h konnten signifikante Erhöhungen bei 25mM Glukose für MuRF-1, MAFbx, der Poly-Ubiquitinylierung und der Apoptoserate in Skelett und Herzmuskelzellen festgestellt werden. Diese Anstiege konnten durch den Zusatz von Liraglutid beim Herzmuskel verhindert werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie konnten zeigen, dass eine Hyperglykämie in der Zellkultur nach 72 h die Expression von zwei wichtigen Ubiquitin-E3-Ligasen sowie die Steigerung der Apoptoserate induzieren kann und dass dies durch Liraglutid am Herzmuskel verhindert werden kann. Diese Vorgänge können eventuell den Proteinverlust bzw. die Muskelatrophie beim Diabetes mellitus zum Teil erklären. Durch die positive Beeinflussung von Liraglutid an den Herzmuskelzellen könnte sich hier ein therapeutisches Potential zur Muskelatrophiebehandlung ergeben.

Das 20S Proteasom ist das Kernelement des Ubiquitin-Proteasom-Systems und baut fehlerhafte, nicht mehr benötigte und oxidierte Proteine ab, wobei drei katalytisch aktive Untereinheiten die Polypeptidkette schneiden. Das proinflammatorische Cytokin IFNg induziert die Expression und Inkorporation der alternativen katalytisch aktiven Immunountereinheiten, was in variablen Isoformen des 20S Proteasoms resultiert. Die zusätzliche Assoziation des 19S Regulators, bzw. des PA28 und des PA200 Aktivators an eine Isoform erweitert das Sortiment an proteasomalen Komplexsubtypen. Der zeitliche Verlauf einer IFNg Stimulation zeigte, dass die Aktivatoren PA28 und PA200 antagonistisch an das 20S Proteasom assoziieren und niedermolekulare Komplexsubtypen bilden, sodass in dieser Studie auch zum ersten Mal eine IFNg abhängige Assoziation des PA200 Monomers an das 20S Proteasom detektiert wurde. Ex vivo Versuche zeigten, dass die Defizienz der Immunountereinheit LMP7 mit der Assoziation des PA28-Aktivators an das 20S-19S Proteasom kompensiert wird, wobei die funktionelle Wirksamkeit aber offen bleibt. In einer monozytären Zelllinie wird ein sehr hochmolekularer, chymotryptisch aktiver Komplex assembliert und massenspektrometrische Analysen detektierten proteasomale Untereinheiten und viele Komponenten der Proteinbiosynthese, was für eine Assoziation des Proteasoms mit dem Polysom spricht. Diese Möglichkeit der kotranslationalen Degradation kann auch die Assoziation des detektieren Chaperonins TriC erklären, wobei dieser Komplex, der ATP abhängig Proteine faltet, möglicherweise auch direkt mit dem Proteasom interagieren könnte, wie elektronenmikroskopische Aufnahmen belegten. Neben den neuen strukturellen Ergebnissen, bestätigte die funktionelle Analyse den Abbau polyubiquitinierter Substrate durch 19S-Regulator assoziierte Komplexsubtypen, doch das 19S-20S-19S Proteasom konnte das Modellsubstrat HA-Ubi-IkBa-flag besser abbauen und deubiquitinieren als das 20S-19S Proteasom. / The 20S proteasome is the core element of the ubiquitin-proteasome-system, which degrades defective, unneeded and oxidized proteins, while three catalytically active subunits hydrolyze the peptide bonds of the polypeptide. The proinflammatory cytokine IFNg induces the expression and incorporation of three alternative, catalytically active immunosubunits resulting in variable isoforms of the 20S proteasome. The additional association of the 19S regulator, or the PA28 and PA200 activator, respectively, expands the range of proteasome complex subtypes. The time course of IFNg stimulation showed that the proteasomal association of PA28 and PA200 occurs antagonistically, forming low molecular weight complex subtypes. Furthermore, this study revealed for the first time an IFNg dependent association of the PA200 monomer to the 20S proteasome. Ex vivo experiments showed that the deficiency of the immunosubunit LMP7 is compensated by the association of the PA28 activator to the 20S-19S proteasome, whereas the functional efficacy remains elusive. In a monocytic cell line, a chymotryptic active complex with a very high molecular weight was detected, and mass spectrometry confirmed proteasomal subunits and components of the protein synthesis machinery, suggesting an association of the proteasome with the polysome. The fact of cotranslational degradation may also explain the association of the chaperonin TriC, an ATP dependent protein folding chaperonin. Electron micrographs could reveal that TriC possibly interacts directly with the proteasome. Next to the new structural results, the functional analysis confirmed the degradation of polyubiquitinated substrates by 19S regulator associated complex subtypes, and in addition to it, the 19S-20S-19S proteasome degraded and deubiquitinated the model substrate HA-Ubi-IkBa-flag better than the 20S-19S proteasome.

In Saccharomyces cerevisiae nimmt die membrangebundene RING-Ub-Ligase Doa10 eine bedeutende Rolle in der Proteinqualitätskontrolle (PQC) des Endoplasmatischen Retikulums (ER) und des Nukleus ein. Doa10 katalysiert dabei die Verknüpfung K48- verbundener Ub-Ketten auf Proteine, die entweder in der ER-Membran oder löslich im Cytosol oder dem Nukleoplasma vorliegen. Diese Markierung leitet die Degradation dieser Proteine ein. Interessanterweise kooperiert Doa10, im Gegensatz zu anderen RING-Ub-Ligasen, mit zwei Ub-konjugierenden Enzymen (E2), um ihre Substrate zu prozessieren. In dieser Arbeit wird veranschaulicht, wie die beiden hochspezialisierten E2 Enzyme Ubc6 und Ubc7 sequentiell agieren, um Doa10 Substrate zu modifizieren. Zuerst wird ein einzelnes Ub-Molekül Ubc6-abhängig an ein Substrat konjugiert (Initiation). Von diesem Rest ausgehen katalysiert Ubc7 die Ausbildung einer K48-verbundenen Ub-Kette (Elongation). Die Fähigkeit von Ubc6 nicht nur Lysine, sondern auch hydroxylierten Aminosäuren wie Serin und Threonin mit Ub-Molekülen zu verknüpfen, erweitert das Substratspektrum von Doa10 und ermöglicht die Prozessieren von Proteinen, die keine zugänglichen Lysinreste exponieren. Weiterhin wird gezeigt, dass ein Überangebot von Ubc6 den Doa10-abhängigen Substratabbau beeinträchtigt. Dies weist darauf hin, dass die Generierung eines effizienten Poly-Ub-Signals einer streng kontrollierten Koordination beider E2 Enzyme am Doa10-Ligase-Komplex unterliegt. / In Saccharomyces cerevisiae, the membrane-bound RING-type Ub ligase Doa10 is a key player of Protein Quality Control (PQC) in the endoplasmic reticulum (ER) and the nucleus. Doa10 promotes lysine 48-linked poly-ubiquitylation of proteins that either reside in the ER membrane or are soluble in the cytosol or the nucleus and thereby labels them for degradation. Strikingly, in contrast to other RING Ub ligases, which typically employ a single Ub conjugating enzyme (E2) for substrate ubiquitylation, the Doa10 ligase requires two of such enzymes for client processing. This study demonstrates that the highly specialized E2 enzymes Ubc6 and Ubc7 act in a sequential manner on Doa10 client proteins. In a first step Ubc6 attaches a single Ub molecule to a substrate (priming), which is followed by the elongation of this moiety with K48-linked Ub chains by Ubc7 (elongation). The ability of Ubc6 to conjugate Ub not only to lysine but also to hydroxylated amino acids like serine and threonine broadens the substrate range of Doa10 and allows processing of proteins, which do not expose accessible lysine residues. Overproduction of Ubc6 was shown to impair Doa10 dependent substrate degradation. Apparently, the generation of a productive K48-linked poly-Ub signal requires a tightly coordinated activity of the individual E2 enzymes at the Doa10 ligase complex.

Es ist bekannt, dass eine diabetische Stoffwechsellage über einen gesteigerten Proteinabbau zu einer Muskelatrophie führen kann. Ein zentrales System beim Abbau von Muskelproteinen ist hierbei das Ubiquitin-Proteasom-System mit seinen zwei spezifischen E3-Ligasen MuRF-1 und MAFbx. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss einer Hyperglykämie auf die Expression von Proteinen des Ubiquitin-Proteasom-Systems im Skelett- und Herzmuskel zeit- und konzentrationsabhängig zu untersuchen. Insbesondere stand die Expression der E3-Ligasen MuRF-1 und MAFbx sowie die daraus folgende Auswirkung auf die Protein-Ubiquitinylierung im Fokus der Untersuchungen. Weiterhin sollte der Einfluss der Hyperglykämie auf die Apoptoserate von Skelett- und Herzmuskelzellen analysiert werden. Seit Kurzem stehen die GLP-1-Analoga als neue Antidiabetika für die Therapie des Diabetes mellitus Type II zur Verfügung. Da in Studien bereits positive Effekte der GLP-1-Analoga am Herzmuskel festgestellt wurden, sollte in der vorliegenden Studie geprüft werden, ob das GLP-1-Analogon Liraglutid die Veränderungen am Herzmuskel beeinflussen kann. Um die Fragestellungen zu klären, wurden verschiedene Untersuchungen in der Zellkultur durchgeführt. Skelettmuskel Myoblasten (undifferenzierte C2C12-Zellen), Skelettmuskel Myotuben (differenzierte C2C12-Zellen) und neonatale Rattenkardiomyozyten wurden unterschiedlichen Glukosekonzentrationen (5mM, 12mM, 25mM) für 24 oder 72 Stunden ausgesetzt. Die Herzmuskelzellen wurden zusätzlich in den Glukosekonzentrationen unter Zusatz von 12 mg/ml Liraglutid für 72h inkubiert. Die Expression der E3-Ligasen wurde mit qRT-PCR (MuRF-1 und MAFbx) und Western Blot (MuRF-1) quantifiziert. Die Poly-Ubiquitinylierung wurde mittels Western Blot bestimmt. Unter Verwendung des Cell Death Detection ELISA (Roche Diagnostics) wurde die Apoptoserate evaluiert. Die Inkubation von Skelett- und Herzmuskelzellen für 24 h mit hyperglykämischen Medium hatte kaum einen Einfluss auf die Expression von MuRF-1 und MAFbx sowie die Apoptoserate. Bei einer Inkubationszeit von 72 h konnten signifikante Erhöhungen bei 25mM Glukose für MuRF-1, MAFbx, der Poly-Ubiquitinylierung und der Apoptoserate in Skelett und Herzmuskelzellen festgestellt werden. Diese Anstiege konnten durch den Zusatz von Liraglutid beim Herzmuskel verhindert werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie konnten zeigen, dass eine Hyperglykämie in der Zellkultur nach 72 h die Expression von zwei wichtigen Ubiquitin-E3-Ligasen sowie die Steigerung der Apoptoserate induzieren kann und dass dies durch Liraglutid am Herzmuskel verhindert werden kann. Diese Vorgänge können eventuell den Proteinverlust bzw. die Muskelatrophie beim Diabetes mellitus zum Teil erklären. Durch die positive Beeinflussung von Liraglutid an den Herzmuskelzellen könnte sich hier ein therapeutisches Potential zur Muskelatrophiebehandlung ergeben.

Die Interaktion von RING-finger-Ubiquitin (Ub)-Ligasen (E3-Enzyme) mit Ub-konjugierenden Enzymen (E2-Enzyme) bestimmt wie schnell ein Zielprotein mit einer Ub-Modifikation versehen wird. In dieser Arbeit wird die Stimulation der E2-Enzyme Ubc6 und Ubc7 durch die E3-Enzyme Hrd1 und Doa10 untersucht. Es wird gezeigt, dass Ubc6~Ub-Konjugate bereitwilliger sogenannte "closed conformations" annehmen als Ubc7~Ub-Konjugate, was wiederum die Tendenz, Ub zu übertragen, steigert. Die katalytische Aktivität von Ubc7 kann durch RING-Domänen stimuliert werden. Durch einen allosterischen Mechanismus, der linchpin allostery, werden Ubc7~Ub-Intermediate in "closed conformations" gedrängt. Zusätzlich werden spezifische Kontakte zwischen RING-finger-Domänen und der Ub-Einheit in einem E2~Ub-Konjugat identifiziert. Diese schränken die Flexibilität des Konjugates weiter ein und begünstigen dadurch die Reaktivität des E2~Ub-Intermediates. Dieser Mechanismus scheint weit verbreitet zu sein und wurde schon bei anderen Ub-Ligasen beobachtet. Poly-Ub-Signale werden in mehreren Schritten generiert. In einer Priming genannten Reaktion wird die erste Ub-Einheit auf das Zielprotein übertragen. Dieser Vorgang erfordert sehr flexible Enzyme, die in diversem Umfeld Akzeptorstellen finden und mit Ub modifizieren. Die zweite Reaktion, die elongation, umfasst das schrittweise Anheften weiterer Ub-Moleküle an die erste Einheit. Im Gegensatz zum Priming, beruht die Bildung einheitlicher Ketten auf der wiederholten und robusten Konjugation von Ub-Molekülen in gleichbleibendem Milieu. Ub-Ligasen verwenden verschiedene Strategien, um die unterschiedlichen Herausforderungen dieser Reaktionen zu bewältigen. Während Doa10 je ein E2-Enzym pro Reaktion nutzt, kann Hrd1 ein einzelnes E2-Enzym durch linchpin allostery ausreichend stimulieren, um beide Prozesse durchzuführen, wie diese Arbeit zeigt. / The interaction of RING-finger ubiquitin (Ub) ligases (E3 enzymes) with Ub conjugating enzymes (E2 enzymes) dictates how fast a Ub modification is synthesized on a client protein. This thesis addresses the catalytic stimulation of the E2 enzymes Ubc6 and Ubc7 by their cognate E3 enzymes Hrd1 and Doa10. Results show that Ubc6~Ub conjugates adopt closed conformations more readily than Ubc7~Ub conjugates, indicative for an inherently higher propensity to transfer Ub. The catalytic activity of Ubc7 can be stimulated by a RING domain which relies on so-called linchpin allostery. This drives Ubc7~Ub intermediates into a closed conformation. In addition, specific contacts of the RING-finger domain and the Ub moiety in an E2~Ub conjugate were identified which further restrict the flexibility of the conjugate and thereby increase the reactivity of the E2~Ub intermediate. This seems to represent a common mechanism for the stimulation of E2 enzymes because similar contacts of RING-finger proteins with Ub have been observed for other Ub ligases. Poly-Ub signals on proteins are generated in successive steps. The first reaction, called "priming", comprises the attachment of an initial Ub moiety to the target. This requires high flexibility of the involved enzymes to modify acceptor sites in a versatile environment. The second step is the sequential addition of Ub to previously attached Ub molecules in a process termed elongation. In contrast to priming, the formation of uniform Ub chains relies on the repeated and robust conjugation of Ub moieties in a mostly invariant setting. Ub ligases employ different strategies to meet the divergent requirements of these reactions. Doa10 uses separate E2 enzymes for priming and elongation. This thesis shows that Hrd1 efficiently stimulates a single E2 enzyme for the catalysis of both steps via linchpin allostery.

Signal peptide peptidase (SPP) and SPP-like (SPPL) aspartyl intramembrane proteases are known to contribute to sequential processing of type II-oriented membrane proteins referred to as regulated intramembrane proteolysis. The ER-resident family members SPP and SPPL2c were shown to also cleave tail-anchored proteins, including selected SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) proteins facilitating membrane fusion events. Here, we analysed whether the related SPPL2a and SPPL2b proteases, which localise to the endocytic or late secretory pathway, are also able to process SNARE proteins. Therefore, we screened 18 SNARE proteins for cleavage by SPPL2a and SPPL2b based on cellular co-expression assays, of which the proteins VAMP1, VAMP2, VAMP3 and VAMP4 were processed by SPPL2a/b demonstrating the capability of these two proteases to proteolyse tail-anchored proteins. Cleavage of the four SNARE proteins was scrutinised at the endogenous level upon SPPL2a/b inhibition in different cell lines as well as by analysing VAMP1-4 levels in tissues and primary cells of SPPL2a/b double-deficient (dKO) mice. Loss of SPPL2a/b activity resulted in an accumulation of VAMP1-4 in a cell type- and tissue-dependent manner, identifying these proteins as SPPL2a/b substrates validated in vivo. Therefore, we propose that SPPL2a/b control cellular levels of VAMP1-4 by initiating the degradation of these proteins, which might impact cellular trafficking.