Four cases of extremity cancers received effective management with cisplatin and etoposide via isolated limb perfusion. They demonstrated minimal, if any, soft tissue damage. This result counters the theory that a caustic response is a prerequisite for successful therapy. This characteristic allows for simultaneous surgical resection with regional, isolated limb perfusion of potent cytotoxic agents without increased morbidity from tissue necrosis, a common consequence of previously used drugs. There is no apparent affect on wound healing, even in cases involving extensive, radical operative procedures.

Introduction : Le TNF-a, impliqué dans l’inflammation et la défense de l’hôte, aaussi des propriétés anti-tumorales et est utilisé dans le traitement local des sarcomesdes membres. P53 est un anti-oncogène dont la mutation est associée audéveloppement de tumeurs. Des données expérimentales ont démontré une relationentre activité anti-tumorale de TNF-a et le statut de p53. Matériel et méthodes : Notre objectif a été d’étudier en immunohistochimie lestatut de p53 chez 110 patients atteints de sarcomes et traités par TNF-a. Ensuite,dans 8 sarcomes cultivés ex-vivo, nous avons étudié la localisation de l’apoptoseinduite par le TNF-a par microscopie confocale. Puis, dans 9 lignées de sarcomeshumains, nous avons testé la relation p53/TNF-a en abrogeant p53 grâce à un sh-RNA, ou en utilisant des petites molécules telles que CP-31398 ou Nutlin-3a aptes àrestaurer p53. Enfin, pour mieux comprendre les mécanismes de résistance au TNF-a,nous avons mesuré par méthode EMSA la liaison de NF-kB à l’ADN et recherché parRT-PCR quels gènes de l’apoptose étaient différentiellement régulés.Résultats : Le statut muté de p53 corrèle avec la réponse histologique autraitement par TNF-a chez l’homme. L’apoptose induite par le TNF-a est trouvée aussibien au niveau de la cellule endothéliale que de la cellule tumorale. De plus, laréponse au TNF-a est modulée par le statut de p53 puisque dans les lignées étudiées,l’abrogation de p53 supprime celle-ci alors que la réparation d’une activité p53 permetde l’augmenter. Enfin, une potentialisation de l’apoptose induite par TNF-a estobservée lorsqu’il est associé avec CP-31398 ou Nutlin-3a et elle corrèle avec ladiminution de la liaison du NF-kB à l’ADN. Une augmentation de l’expression desgènes RIPK2, TP53BP2 et GADD45 et une diminution de l’expression de TGF-b1 etFAIM est observée lorsque l’association de Nutlin-3a et TNF-a est synergique sur lamort cellulaire.Conclusions : Ces résultats suggèrent que l’utilisation de molécules capablesde restaurer l’activité de p53 peut inverser la résistance des sarcomes des tissusmous au traitement par TNF-a. Dans ce contexte, des études cliniques pourraientexploiter cette approche pour l’utiliser dans le cadre des sarcomes particulièrementrésistants aux traitements conventionnels ainsi que dans d’autres tumeurs. / Introduction: Although named for its antitumor properties, TNF-a is implicatedin a wide spectrum of diseases including chronic inflammation, autoimmunity andcancer. It is used for the loco regional treatment of limb’s sarcoma. P53 is an antioncogenewhose mutation is associated with tumour development. Experimental datademonstrated that TNF-a cytotoxic activity and p53 status are related.Material and methods: Our objective was to study by immunohistochemistrythe p53 status in 110 sarcoma patients treated by isolated limb perfusion with TNF-a. Then, we studied by confocal microscopy in 8 freshly obtained sarcoma tumours,the localization of apoptosis. Finally, in 9 sarcoma cell lines with different p53 status,we tested the p53/TNF-a relationship by abrogating p53 with a sh-RNA and by usingsmall molecules known to restore p53 functions. To better understand the mechanismsof resistance to TNF-a, we measured by EMSA the NF-kB-binding to DNA and withRT-PCR, we explored the regulation of some apoptosis related genes.Results: We demonstrated a relationship between p53 status and thehistological response to TNF-a use in humans. TNF-a induced apoptosis was presentin endothelial cells as well as in the tumour cells. TNF-a cytotoxicity was dependent onthe p53 status since in the cell lines studied, p53 abrogation reduced it and p53restoration allowed it to increase. Moreover, a potentiation of TNF-a cytotoxic effectwas observed when it was combined to CP-31398 or Nutlin-3a. The killing magnitudewas therefore related to the decrease in the NF-kB-binding to DNA when Nutlin-3awas added. A gene expression increase for RIPK2, TP53BP2 and GADD45 and adecrease for TGF-b1 and FAIM was observed if the combined treatment wassynergistic on tumour death cells.Conclusions: These results suggest that the use of compounds able to restorep53 activity could reverse the soft tissue sarcoma’s resistance to TNF-a treatment.Clinical studies should be performed in order to utilize this approach and to use it inthe context of sarcomas that are particularly resistant to conventional treatments.

112 Patienten wurden im Rahmen von 2 prospektiven multizentrischen Phase-II Studien mit einer isolierten Extremitätenperfusion mit Tumornekrosefaktor (TNF) und Melphalan behandelt. Hiervon waren 49 Patienten an einem lokoregionär metastasierten Melanom und 63 Patienten an einem lokal fortgeschrittenen Weichgewebssarkom erkrankt. Bei Patienten mit regionären Metastasen eines Melanoms fand sich in 46 % eine komplette und in 20 % eine partielle Remission. Die mittlere lokoregionäre progressionsfreie Zeit war 32,3 Monate (Median 15,6 Monate). Sie war signifikant länger bei Patienten mit einer kompletten Remission (46,0 Monate, Median 30,2 Monate) im Vergleich zu Patienten mit einer partiellen Remission (15,2 Monate, Median 16,1 Monate) oder Patienten mit unverändertem Befund (7,2 Monate, Median 6,0 Monate). Die Gesamt-Überlebenszeit der Patienten mit Melanom betrug im Mittel 42,6 Monate (Median 24,4 Monate) und die 5-Jahres-Überlebensrate 42 %. Die klinische Ansprechrate der Patienten mit Weichgewebssarkomen betrug 44,5 %. Bei kombinierter Analyse der klinischen und histologischen Remission betrug die Gesamtansprechrate in der Gruppe der Patienten mit Weichgewebssarkomen 60 % (21 % CR). Insgesamt war bei 86 % der Patienten mit Sarkomen (54/63 Patienten) ein extremitätenerhaltendes Vorgehen möglich. Die mittlere lokale progressionsfreie Zeit betrug für alle 63 Patienten mit Weichgewebssarkom 63,7 Monate und die 5-Jahres-Progessionsfreiheit 72 %. Die mittlere Überlebenszeit der Patienten mit Sarkomen betrug 61,9 Monate und die 5-Jahres-Überlebenszeit 64 %. Wichtigste Einflussfaktoren auf die Überlebenszeit waren das Tumorgrading (p=0,016) und die Tumorgrösse (p=0,046). 94 der 112 behandelten Patienten hatten nach der Extremitätenperfusion im Bereich der Extremität eine regionale Toxizität Grad I-II nach Wieberdink und bei 18 Patienten kam es zu einer höhergradigen Gewebeschädigung (Grad III-IV). Die postoperativen Serumkonzentrationen von Creatinkinase (CK) und Myoglobin zeigten eine signifikante Korrelation zur regionalen Toxizität (p=0,007 bzw. 0,003). An systemischen Nebenwirkungen der isolierten Extremitätenperfusion mit TNF und Melphalan fiel vor allem eine Erhöhung der Leberwerte auf, mit Anstieg der Transaminasen und des Bilirubins bis zu WHO-Schweregrad III und IV. Einschränkungen der Lebersyntheseleistungen wurden nicht beobachtet. Alle Veränderungen waren spontan rückläufig. Leuko- und Thrombopenien Grad III/IV betrafen häufig Patienten mit einer systemischen Leckrate von > 5 % (29 % bzw. 21 %). Eine Überlegenheit der isolierten Extremitätenperfusion mit TNF und Melphalan beim Melanom gegenüber der Perfusion mit Melphalan alleine kann aus den vorliegenden Daten nicht abgeleitet werden. Die von uns festgestellte klinische Remissionsrate von 66 % ist nicht höher als in der Literatur angegeben. Durch die isolierte Extremitätenperfusion mit TNF und Melphalan kann bei ca. 80 % der behandelten Patienten mit lokal fortgeschrittenen und primär nicht resektablen Weichgewebssarkomen ein Extremitätenerhalt erreicht werden. Die hohe Rate auch histologisch belegter Remissionen bei diesen Patienten untermauert den Stellenwert dieser Therapie eindrucksvoll. / 112 patients were treated by isolated limb perfusion with tumor necrosis factor (TNF) and melphalan for locoregional metastases of melanoma (49 patients) or locally advanced soft tissue sarcoma (63 patients). Patients were treated in 2 prospective multicentric phase-II trials. For patients with intransit metastases from melanoma, complete response could be reached in 46 % and partial response in 20 %. Mean time to locoregional progression was 32.3 months (median 15.6 months). This was significantly longer for patients with complete response (46.0 months, median 30.2 months) when compared to patients with a partial response (15.2 months, median 16.1 months) or patients with no change (7.2 months, median 6.0 months). The mean overall survival time for patients with melanoma was 42.6 months (median 24.4 months) and the 5-year survival rate 42 %. The clinical response rate for sarcoma patients was 44.5 %, but on combined analysis of clinical and histologically confirmed response the overall response rate was 60 % (21 % CR). Limb salvage was possible in 86 % of the sarcoma patients (54/63 patients). The mean time to local progression was 63.7 months and the 5-year progression-free rate was 72 %. Mean overall survival time in this group was 61.9 months with a 5-year survival rate of 64 %. Grading (p=0,016) and tumor size (p=0,046) were the most important factors influencing survival. Regional toxicity after isolated limb perfusion was mild (Wieberdink grade I-II) in 94 of the 112 patients, and 18 patients had a more severe reaction (grade III-IV). Postoperative serum concentrations of creatinekinase (CK) and myoglobin were significantly correlated to regional toxicity (p=0.007 and 0.003). Elevated liver enzymes and bilirubin with levels up to WHO III and IV were the most profound systemic side effect of isolated limb perfusion with TNF and melphalan. All changes resolved completely. Leucopenia and thrombopenia grade III/IV were mainly observed in patients with a systemic leakage rate greater than 5 % (29 % resp. 21 %). In melanoma patients, the observed overall response rate of 66 % after isolated limb perfusion with TNF and melphalan is not superior to literature results for limb perfusion with melphalan alone. Thus, the superiority of this treatment cannot be confirmed for this indication. In contrast, limb salvage became possible in approx. 80 % of the patients with locally advanced and unresectable sarcoma. In addition, the high rate of histologically confirmed response in these patients underlines the value of this treatment modality.

Fragestellung: Es wird untersucht, ob die isolierte hypertherme Extremitätenperfusion (ILP) mit TNF-alpha und Melphalan eine akute systemische inflammatorische Reaktion (SIRS) auslöst. Weiterhin soll der Einfluß von zwei verschiedenen total intravenösen Narkoseverfahren sowie der Zusammenhang der unabhängig voneinander bestimmten Meßgrößen Herzindex/Sauerstoffverbrauchsindex (HI/VO2I) und Sauerstoffverbrauchsindex/Sauerstoffangebotsindex (VO2I/DO2I) beim Entstehen eines SIRS analysiert werden. Methodik: 73 Patienten, die sich einer ILP mit TNF-alpha und Melphalan in Allgemeinanästhesie unterzogen, wurden in diese klinische, retrospektive Untersuchung eingeschlossen. Ein erweitertes kardiopulmonales Monitoring, bestehend aus kontinuierlicher Thermodilution, kontinuierlicher indirekter Kalorimetrie, invasiver Blutdruckmessung sowie arterieller und gemischtvenöser Blutgasanalysen ermöglichte die Analyse von hämodynamischen, metabolischen und gasanalytischen Parametern an 8 definierten Zeitpunkten im Verlauf der ILP mit TNF-alpha und Melphalan. 21 Patienten erhielten eine Narkose mit Etomidate/Midazolam/Sufentanil/Pancuroniumbromid (N1), und bei 52 Patienten wurde die Narkose mit Propofol/Remifentanil/Cis-Atracurium (N2) durchgeführt. Ergebnisse: Während der ILP mit TNF-alpha und Melphalan kam es bei folgenden Parametern zu signifikanten Veränderungen in der systemischen Reperfusionsphase gegenüber den Ausgangswerten vor der extrakorporalen Zirkulation: Herzfrequenz, Herzindex, Temperatur, Gesamtsauerstoffaufnahme, pulmonale Sauerstoffaufnahme, Sauerstoffangebot, systemischer Gefäßwiderstand, pulmonalarterieller Mitteldruck, kardiale Füllungsdrücke, gemischtvenöser Kohlendioxid- und Sauerstoffpartialdruck, arterieller Kohlendioxid- und Sauerstoffpartialdruck, gemischtvenöse Sauerstoffsättigung, arterieller und gemischtvenöser Sauerstoffgehalt sowie arterieller pH- und Laktatwert. Bezüglich der Narkoseverfahren zeigte die Narkose N2 versus N1 signifikant geringere Herzfrequenzen und Herzindices, sowie signifikant erhöhte pulmonalarterielle Mitteldrücke, pulmonale und systemische Gefäßwiderstände. Die Korrelationen von HI/VO2I und VO2I/DO2I sind in der prä-Bypass-Phase gering, nehmen im Verlauf der ILP zu und erreichen zum Zeitpunkt der systemischen Reperfusion jeweils ihren Maximalwert. Schlußfolgerungen: Die ILP mit TNF-alpha und Melphalan kann als dynamisches in-vivo Modell für das Entstehen einer SIRS-Reaktion aufgefaßt werden. Die inflammatorische Antwort ist in ihrem Ausmaß eher gering und erreicht nach Aufhebung der extrakorporalen Zirkulation mit systemischer Reperfusion der behandelten Extremität ihr Maximum. Die Überwachung der Teilkreisläufe, ein erweitertes hämodynamisches Monitoring sowie forcierte intravenöse Volumentherapie in der Reperfusionsphase lassen dieses Behandlungsverfahren für die Patienten in Allgemeinanästhesie sicher erscheinen. Beide beschriebenen Narkoseverfahren sind für diese operative Therapie geeignet. Der Zusammenhang von HI/VO2I sowie VO2I/DO2I ist im Verlauf der ILP gering, kann sich aber mit Zunahme der inflammatorischen Reaktion verstärken. / objective: To determine whether the isolated hyperthermic limb perfusion (ILP) with tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) and melphalan causes an acute systemic inflammatory response syndrome (SIRS)? Also analysed will be the influence of two total intravenous anaesthesias and the correlation of independent measured values cardiac index/oxygen consumption index (HI/VO2I) and oxygen consumption index/oxygen delivery index (VO2I/DO2I). design: Retrospective review of hemodynamic, metabolic and blood gas values from 73 patients, undervented isolated hyperthermic limb perfusion of leg with TNF-alpha and Melphalan in general anaesthesia. methods: Cardiopulmonary monitoring consisted of continuous thermodilution, continuous calorimetry, arterial pressure and arterial as well as admixed blood-gas analyses. Values were measured on 8 time points in the course of ILP. In 21 patients anaesthesia was carried out with drug-combination of Etomidate/Midazolam/Sufentanil/Pancuroniumbromid (N1), and 52 patients were given anaesthesia with Propofol/Remifentanil/Cis-atracurium (N2). results: The following values changed significantly after limb-reperfusion compared with the baseline: heart rate, cardiac index, temperature, oxygen consumption, pulmonary oxygen consumption, oxygen delivery, systemic vascular resistance, mean pulmonary arterial pressure, precardial pressures, admixed carbon dioxide pressure, admixed oxygen pressure, arterial carbon dioxide pressure, arterial oxygen pressure, admixed oxygen saturation, arterial and admixed oxygen content as well as arterial pH- and lactat. conclusions: The isolated hyperthermic limb perfusion with TNF-alpha and melphalan may be used as a dynamic in-vivo model for the development of an SIRS. The inflammatory response is slight and reached the maximum after reperfusion of treated limb. Monitoring of the two circulations, extended cardiopulmonary monitoring and intravenous volumetherapie in the reperfusion time makes this cancer treatment in general anaesthesia safe. Both anaesthesia are suitable. The correlations of HI/VO2I as well as VO2I/DO2I are low in the beginning and rise with the increase of the inflammatory response.