O transplante renal é atualmente o tratamento de escolha para pacientes com doença renal crônica em estágio 5, devido aos seus melhores resultados na morbimortalidade e melhor qualidade de vida dos pacientes, quando comparado com o tratamento dialítico. No entanto, apesar desses resultados positivos, a sobrevida dos enxertos renais em longo prazo não se modificou. As principais causas de falências tardias do transplante renal são as alterações crônicas do enxerto, caracterizadas por componentes de rejeição crônica e efeitos nefrotóxicos relacionados aos inibidores da calcineurina. O desenvolvimento de estratégias visando modular o sistema imunológico, interferindo no balanço entre mecanismos efetores e reguladores, capazes de induzir a aceitação do órgão (tolerância) seria a melhor alternativa para este cenário. No entanto, os mecanismos imunológicos envolvidos no processo da imunorregulação são pouco compreendidos, o que dificulta a identificação de casos tolerantes e a definição de estratégias para a sua modulação. Dentre as possíveis moléculas envolvidas no processo de imunomodulação, destacam-se a Forkhead Box P3 (FOXp3), marcador de células reguladoras e a enzima indoleamina 2,3 dioxigenase (IDO), reconhecida recentemente como tendo função central na tolerância materno-fetal. No presente estudo, foram utilizadas técnicas de imunohistoquímica para identificar linfócitos T efetores (CD3+), FOXp3 e IDO em biópsias de aloenxerto renal e correlacionar sua expressão com a evolução clínica do enxerto 12 meses após a biópsia. A relação entre células reguladoras e efetoras foi avaliada pelas relações FOXp3/CD3 e IDO/CD3. Devido à limitação do reconhecimento e do diagnóstico de casos de tolerância, só foi possível analisar a expressão destes marcadores em 1 único caso de paciente tolerante. Por outro lado, o estudo do perfil da expressão destes marcadores em outras situações clínicas deve contribuir para a melhor compreensão dos mecanismos envolvidos. Neste contexto, no presente estudo foram analisadas 63 biópsias de enxerto renal em diferentes situações clínicas: enxerto Sem Rejeição (SemRA; n=13), Rejeição Aguda (RA; n=21) e lesões crônicas (LC; n=29) além de 1 caso de paciente com diagnóstico clínico de tolerância operacional (Tolerante; n=1). Este paciente evoluiu com disfunção do enxerto, reiniciou terapia dialítica com a descontinuação do tratamento imunossupressor e após 2 anos em programa de hemodiálise, recuperou a função do enxerto, sendo, então, submetido a biópsia do enxerto renal. As biópsias incluídas foram subdivididas de acordo com a Classificação de Banff-09. As rejeições agudas mediadas por linfócitos T foram classificadas em RA-Banff I (n=15) e RA-Banff II (n=6). Os casos com Lesões Crônicas também foram subdivididos de acordo com a Classificação de Banff-09 em Fibrose intersticial/Atrofia tubular (FIAT; n=15) e Rejeição Crônica Ativa (RCA; n=14). RESULTADOS: analisado isoladamente, o caso Tolerante apresentou um número expressivo de células CD3+ (814 cel/mm2) e FOXp3+ (100,9 cel/mm2), assim como elevada relação FOXp3/CD3 (12,4x102).No entanto, apresentou uma baixa expressão de IDO (0,41% área marcada).Nos casos do grupo RA o número de células CD3+. foi significativamente maior que em LC e SemRA (973±127 cel/mm2; 242±43 cel/mm2 e 0,7 ± 0,4 cel/mm2, respectivamente; p<0,001 vs LC e p<0,0001 vs SemRA). Células CD3+ foram detectadas em todos os compartimentos estudados: interstício, túbulos, vasos, e glomérulos no grupo RA e no grupo LC. Comparando os grupos, houve predomínio de células CD3+ no interstício (p<0,0001) do grupo RA. Na subanálise segundo a Classificação de Banff-09, não houve diferença entres os subgrupos de RA na análise de células CD3+ por compartimentos. Por outro lado, na análise do grupo LC, no subgrupo RCA foram detectadas significativamente mais células CD3+ que em FIAT no interstício (322±66 cel/mm2 vs 145±32 cel/mm2; p<0,05) e nos túbulos (30,7±10 cel/mm2 vs 6±2 cel/mm2; p<0,05). O número de células FOXp3+ foi significativamente maior nos casos do grupo RA (43±10 cel/mm2) comparado com LC e SemRA (20±4 cel/mm2 e 0,1±0,1 cel/mm2, respectivamente; p<0,05 vs LC e p<0,0001 vs SemRA). Na distribuição por compartimentos, tanto em RA quanto em LC houve a predominância de células FOXp3+ no interstício, porém não houve diferença estatística entre os 2 grupos. Na análise de células FOXp3+ por compartimentos do grupo LC segundo a Classificação de Banff-09, não houve diferença entres os subgrupos. A relação FOXp3/CD3 foi significativamente maior no grupo LC que no RA (17±5 vs 5±1; p<0,05). Na análise do grupo LC, a relação FOXp3/CD3 foi significativamente maior em FIAT que em RCA (25±8 vs 8±2; p<0,05). A análise da expressão de IDO não revelou diferença na comparação dos grupos SemRA, RA e LC. Não houve diferença também na expressão de IDO, tanto entre os grupos Banff I e Banff II, quanto entre os grupos FIAT e RCA. A relação IDO/CD3, foi significativamente maior no grupo LC do que no grupo RA (18±6 vs 3±1; p<0,05). Apesar da presença de células FOXp3+ ter sido maior nos casos com diagnóstico de rejeição aguda como descrito na literatura, não houve correlação da sua expressão com uma maior função do enxerto na análise de 12 meses após a biópsia, nem com a sobrevida do enxerto em 12 meses. Nos casos com diagnóstico de lesões crônicas, a maior relação FOXp3/CD3 se correlacionou negativamente com a função do enxerto 12 meses após a biópsia. A expressão de IDO também não se correlacionou com uma melhor função, nem com a sobrevida do enxerto na análise em 12 meses após a biópsia. A análise dos resultados apresentados sugere o envolvimento dos marcadores estudados na resposta inflamatória ocasionada pelo aloreconhecimento, uma vez que estão presentes em cenários imunológicos distintos, aparentemente, mediando o dano tecidual no microambiente do aloenxerto. No entanto, não há dados o suficiente para apontar para um papel das células FOXp3+ e da IDO no desenvolvimento de tolerância ao aloenxerto no presente estudo. Concluindo, ainda não está claro o quanto a presença de Tregs e IDO limitam os processos de rejeição/cronificação ou participam desses processos, sendo sua presença ainda controversa / Currently, kidney transplantation is choice therapy for patients with chronic kidney disease in stage 5, due to their good results in morbidity and improved quality of life compared with dialysis treatment. However, despite these positive results, renal grafts survival in the long term has not changed. The major cause of failures in long-term in kidney transplant are chronic graft changes, characterized by chronic rejection and components related to the nephrotoxic effects of calcineurin inhibitors. The development of strategies to modulate the immune system interfering with the balance between regulatory and effector mechanisms, capable of inducing organ acceptance (tolerance), would be the excellent alternative in this scenario. However, the immunological mechanisms involved in the immunoregulation are poorly understood, hindering to identify cases tolerant as well as developing strategies for their modulation. Within the possible molecules involved in immunomodulation, stand out the Forkhead Box P3 (FOXp3), a marker of regulatory cells, and the enzyme indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO), recently recognized by their role in maternal-fetal tolerance. In this present study, we used immunohistochemical techniques to identify T lymphocytes (CD3+), FOXp3 and IDO in renal allograft biopsies and to correlate its expression with graft function 12 months after the biopsy procedure. The relationship between regulatory and effector cells was analysed by FOXp3/CD3 and IDO/CD3 ratios. Due to limited recognition and diagnosis of tolerance cases, only was possible to analyze the expression of these markers in one single case of tolerant patient. On the other hand, the study of the expression of these markers in other clinical situations, should contribute to a better understanding of the mechanisms involved. In this context, the present study analyzed 63 renal allograft biopsies in different clinical situations: no graft rejection (NR, n = 13), acute rejection (AR, n = 21) and chronic injury (CI, n = 29). In addition, one patient with clinical operational tolerance diagnosis (tolerant, n = 1) was analyzed. This patient developed graft dysfunction, restarted dialysis discontinuation of immunosuppressive treatment. After 2 years on dialysis therapy, recovered graft function and then was submitted to renal allograft biopsy. The biopsies included in this study were subdivided according to the Banff-09 classification. The acute rejection mediated by T lymphocytes was classified in Banff I (n = 15) and Banff II (n = 6). Cases that showed chronic injury were also subdivided according to the Banff-09 classification in Interstitial Fibrosis/Tubular Atrophy (IFTA, n = 15) and Chronic Rejection (CR, n = 14). Results: Analyzed separately, the tolerant case showed an expressive number of CD3+ cells (814 cells/mm2) and FOXp3+ cells (100.9 cells/mm2). Also, expressive FOXp3/CD3+ ratio (12,4x102) and low IDO expression (0.41% area).In AR group the number of CD3+ cells was significantly higher compared with CI and NR groups (973 ± 127 cells/mm2; 242 ± 43 cells/mm2 and 0.7 ± 0.4, cells/mm2, respectively; p<0.001 vs CI and p <0.0001 vs NR). In AR and CI groups CD3+ cells were detected in all compartments studied: interstitium, tubules, vessels and glomeruli. Comparing the groups, there was a predominance of CD3+ cells in the interstitium (p<0.0001) of AR group. No difference was observed between Banff I and Banff II subgroups analysis of CD3+ in the compartments. On the other hand, in the CR subgroup analysis was detected in significantly higher of CD3+ cells in the interstitium compared with IFTA (322 ± 66 cells/mm2 vs. 145 ± 32 cells/mm2, p<0.05) and in tubules (30,7±10 cells/mm2 vs. 6±2 cells/mm2, respectively; p<0.05). The number of FOXp3+ cells was significantly higher in the AR group (43±10 cells/mm2) compared with CI and NR (20±4 cells/mm2 and 0.1±0.1 cells/mm2, respectively; p<0,05 vs CI and p<0,0001 vs NR). The distribution of compartments, both AR and in CI predominated FOXp3+ cells in the interstitium, but there was no statistical difference between the 2 groups. In the FOXp3+ cells analysis, CI do not showed difference between subgroups in the compartments. The relationship FOXp3/CD3 was significantly higher in AR group compared in the CI group (17 ± 5 vs. 5 ± 1; p<0.05). In the CI group analysis, FOXp3/CD3 ratio was significantly higher in IFTA compared with CR (25±8 vs 8±2; p<0.05). IDO expression analysis shows no difference when compared NR, AR and CI groups. No difference in IDO expression analysis in Banff I compared with Banff II, and IFTA compared with CR was observed. The relationship of IDO/CD3, was significantly higher in the CI group when compared with AR group (18±6 vs 3±1, p<0.05). Despite the presence of FOXp3+ cells was higher in cases with a diagnosis of acute rejection as described in the literature, there was no correlation of its expression with improved graft function in the 12 months analysis after the biopsy procedure, as well as with graft survival in 12 months. In cases with a diagnosis of chronic injuries, FOXp3/CD3 ratio was negatively correlated with graft function 12 months after the biopsy procedure. The analysis of these results led us to speculate about the involvement of these markers in the inflammatory response, mediating the tissue damage in the microenvironment of the graft, once it is immunological distinct scenarios, however, in this study, there is no enough data to point to a role in development of tolerance. In conclusion, it is unclear how the presence of Tregs and IDO limit the allograft rejection/chronicity or participate in this process, and their presence is still controversial

O transplante renal é atualmente o tratamento de escolha para pacientes com doença renal crônica em estágio 5, devido aos seus melhores resultados na morbimortalidade e melhor qualidade de vida dos pacientes, quando comparado com o tratamento dialítico. No entanto, apesar desses resultados positivos, a sobrevida dos enxertos renais em longo prazo não se modificou. As principais causas de falências tardias do transplante renal são as alterações crônicas do enxerto, caracterizadas por componentes de rejeição crônica e efeitos nefrotóxicos relacionados aos inibidores da calcineurina. O desenvolvimento de estratégias visando modular o sistema imunológico, interferindo no balanço entre mecanismos efetores e reguladores, capazes de induzir a aceitação do órgão (tolerância) seria a melhor alternativa para este cenário. No entanto, os mecanismos imunológicos envolvidos no processo da imunorregulação são pouco compreendidos, o que dificulta a identificação de casos tolerantes e a definição de estratégias para a sua modulação. Dentre as possíveis moléculas envolvidas no processo de imunomodulação, destacam-se a Forkhead Box P3 (FOXp3), marcador de células reguladoras e a enzima indoleamina 2,3 dioxigenase (IDO), reconhecida recentemente como tendo função central na tolerância materno-fetal. No presente estudo, foram utilizadas técnicas de imunohistoquímica para identificar linfócitos T efetores (CD3+), FOXp3 e IDO em biópsias de aloenxerto renal e correlacionar sua expressão com a evolução clínica do enxerto 12 meses após a biópsia. A relação entre células reguladoras e efetoras foi avaliada pelas relações FOXp3/CD3 e IDO/CD3. Devido à limitação do reconhecimento e do diagnóstico de casos de tolerância, só foi possível analisar a expressão destes marcadores em 1 único caso de paciente tolerante. Por outro lado, o estudo do perfil da expressão destes marcadores em outras situações clínicas deve contribuir para a melhor compreensão dos mecanismos envolvidos. Neste contexto, no presente estudo foram analisadas 63 biópsias de enxerto renal em diferentes situações clínicas: enxerto Sem Rejeição (SemRA; n=13), Rejeição Aguda (RA; n=21) e lesões crônicas (LC; n=29) além de 1 caso de paciente com diagnóstico clínico de tolerância operacional (Tolerante; n=1). Este paciente evoluiu com disfunção do enxerto, reiniciou terapia dialítica com a descontinuação do tratamento imunossupressor e após 2 anos em programa de hemodiálise, recuperou a função do enxerto, sendo, então, submetido a biópsia do enxerto renal. As biópsias incluídas foram subdivididas de acordo com a Classificação de Banff-09. As rejeições agudas mediadas por linfócitos T foram classificadas em RA-Banff I (n=15) e RA-Banff II (n=6). Os casos com Lesões Crônicas também foram subdivididos de acordo com a Classificação de Banff-09 em Fibrose intersticial/Atrofia tubular (FIAT; n=15) e Rejeição Crônica Ativa (RCA; n=14). RESULTADOS: analisado isoladamente, o caso Tolerante apresentou um número expressivo de células CD3+ (814 cel/mm2) e FOXp3+ (100,9 cel/mm2), assim como elevada relação FOXp3/CD3 (12,4x102).No entanto, apresentou uma baixa expressão de IDO (0,41% área marcada).Nos casos do grupo RA o número de células CD3+. foi significativamente maior que em LC e SemRA (973±127 cel/mm2; 242±43 cel/mm2 e 0,7 ± 0,4 cel/mm2, respectivamente; p<0,001 vs LC e p<0,0001 vs SemRA). Células CD3+ foram detectadas em todos os compartimentos estudados: interstício, túbulos, vasos, e glomérulos no grupo RA e no grupo LC. Comparando os grupos, houve predomínio de células CD3+ no interstício (p<0,0001) do grupo RA. Na subanálise segundo a Classificação de Banff-09, não houve diferença entres os subgrupos de RA na análise de células CD3+ por compartimentos. Por outro lado, na análise do grupo LC, no subgrupo RCA foram detectadas significativamente mais células CD3+ que em FIAT no interstício (322±66 cel/mm2 vs 145±32 cel/mm2; p<0,05) e nos túbulos (30,7±10 cel/mm2 vs 6±2 cel/mm2; p<0,05). O número de células FOXp3+ foi significativamente maior nos casos do grupo RA (43±10 cel/mm2) comparado com LC e SemRA (20±4 cel/mm2 e 0,1±0,1 cel/mm2, respectivamente; p<0,05 vs LC e p<0,0001 vs SemRA). Na distribuição por compartimentos, tanto em RA quanto em LC houve a predominância de células FOXp3+ no interstício, porém não houve diferença estatística entre os 2 grupos. Na análise de células FOXp3+ por compartimentos do grupo LC segundo a Classificação de Banff-09, não houve diferença entres os subgrupos. A relação FOXp3/CD3 foi significativamente maior no grupo LC que no RA (17±5 vs 5±1; p<0,05). Na análise do grupo LC, a relação FOXp3/CD3 foi significativamente maior em FIAT que em RCA (25±8 vs 8±2; p<0,05). A análise da expressão de IDO não revelou diferença na comparação dos grupos SemRA, RA e LC. Não houve diferença também na expressão de IDO, tanto entre os grupos Banff I e Banff II, quanto entre os grupos FIAT e RCA. A relação IDO/CD3, foi significativamente maior no grupo LC do que no grupo RA (18±6 vs 3±1; p<0,05). Apesar da presença de células FOXp3+ ter sido maior nos casos com diagnóstico de rejeição aguda como descrito na literatura, não houve correlação da sua expressão com uma maior função do enxerto na análise de 12 meses após a biópsia, nem com a sobrevida do enxerto em 12 meses. Nos casos com diagnóstico de lesões crônicas, a maior relação FOXp3/CD3 se correlacionou negativamente com a função do enxerto 12 meses após a biópsia. A expressão de IDO também não se correlacionou com uma melhor função, nem com a sobrevida do enxerto na análise em 12 meses após a biópsia. A análise dos resultados apresentados sugere o envolvimento dos marcadores estudados na resposta inflamatória ocasionada pelo aloreconhecimento, uma vez que estão presentes em cenários imunológicos distintos, aparentemente, mediando o dano tecidual no microambiente do aloenxerto. No entanto, não há dados o suficiente para apontar para um papel das células FOXp3+ e da IDO no desenvolvimento de tolerância ao aloenxerto no presente estudo. Concluindo, ainda não está claro o quanto a presença de Tregs e IDO limitam os processos de rejeição/cronificação ou participam desses processos, sendo sua presença ainda controversa / Currently, kidney transplantation is choice therapy for patients with chronic kidney disease in stage 5, due to their good results in morbidity and improved quality of life compared with dialysis treatment. However, despite these positive results, renal grafts survival in the long term has not changed. The major cause of failures in long-term in kidney transplant are chronic graft changes, characterized by chronic rejection and components related to the nephrotoxic effects of calcineurin inhibitors. The development of strategies to modulate the immune system interfering with the balance between regulatory and effector mechanisms, capable of inducing organ acceptance (tolerance), would be the excellent alternative in this scenario. However, the immunological mechanisms involved in the immunoregulation are poorly understood, hindering to identify cases tolerant as well as developing strategies for their modulation. Within the possible molecules involved in immunomodulation, stand out the Forkhead Box P3 (FOXp3), a marker of regulatory cells, and the enzyme indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO), recently recognized by their role in maternal-fetal tolerance. In this present study, we used immunohistochemical techniques to identify T lymphocytes (CD3+), FOXp3 and IDO in renal allograft biopsies and to correlate its expression with graft function 12 months after the biopsy procedure. The relationship between regulatory and effector cells was analysed by FOXp3/CD3 and IDO/CD3 ratios. Due to limited recognition and diagnosis of tolerance cases, only was possible to analyze the expression of these markers in one single case of tolerant patient. On the other hand, the study of the expression of these markers in other clinical situations, should contribute to a better understanding of the mechanisms involved. In this context, the present study analyzed 63 renal allograft biopsies in different clinical situations: no graft rejection (NR, n = 13), acute rejection (AR, n = 21) and chronic injury (CI, n = 29). In addition, one patient with clinical operational tolerance diagnosis (tolerant, n = 1) was analyzed. This patient developed graft dysfunction, restarted dialysis discontinuation of immunosuppressive treatment. After 2 years on dialysis therapy, recovered graft function and then was submitted to renal allograft biopsy. The biopsies included in this study were subdivided according to the Banff-09 classification. The acute rejection mediated by T lymphocytes was classified in Banff I (n = 15) and Banff II (n = 6). Cases that showed chronic injury were also subdivided according to the Banff-09 classification in Interstitial Fibrosis/Tubular Atrophy (IFTA, n = 15) and Chronic Rejection (CR, n = 14). Results: Analyzed separately, the tolerant case showed an expressive number of CD3+ cells (814 cells/mm2) and FOXp3+ cells (100.9 cells/mm2). Also, expressive FOXp3/CD3+ ratio (12,4x102) and low IDO expression (0.41% area).In AR group the number of CD3+ cells was significantly higher compared with CI and NR groups (973 ± 127 cells/mm2; 242 ± 43 cells/mm2 and 0.7 ± 0.4, cells/mm2, respectively; p<0.001 vs CI and p <0.0001 vs NR). In AR and CI groups CD3+ cells were detected in all compartments studied: interstitium, tubules, vessels and glomeruli. Comparing the groups, there was a predominance of CD3+ cells in the interstitium (p<0.0001) of AR group. No difference was observed between Banff I and Banff II subgroups analysis of CD3+ in the compartments. On the other hand, in the CR subgroup analysis was detected in significantly higher of CD3+ cells in the interstitium compared with IFTA (322 ± 66 cells/mm2 vs. 145 ± 32 cells/mm2, p<0.05) and in tubules (30,7±10 cells/mm2 vs. 6±2 cells/mm2, respectively; p<0.05). The number of FOXp3+ cells was significantly higher in the AR group (43±10 cells/mm2) compared with CI and NR (20±4 cells/mm2 and 0.1±0.1 cells/mm2, respectively; p<0,05 vs CI and p<0,0001 vs NR). The distribution of compartments, both AR and in CI predominated FOXp3+ cells in the interstitium, but there was no statistical difference between the 2 groups. In the FOXp3+ cells analysis, CI do not showed difference between subgroups in the compartments. The relationship FOXp3/CD3 was significantly higher in AR group compared in the CI group (17 ± 5 vs. 5 ± 1; p<0.05). In the CI group analysis, FOXp3/CD3 ratio was significantly higher in IFTA compared with CR (25±8 vs 8±2; p<0.05). IDO expression analysis shows no difference when compared NR, AR and CI groups. No difference in IDO expression analysis in Banff I compared with Banff II, and IFTA compared with CR was observed. The relationship of IDO/CD3, was significantly higher in the CI group when compared with AR group (18±6 vs 3±1, p<0.05). Despite the presence of FOXp3+ cells was higher in cases with a diagnosis of acute rejection as described in the literature, there was no correlation of its expression with improved graft function in the 12 months analysis after the biopsy procedure, as well as with graft survival in 12 months. In cases with a diagnosis of chronic injuries, FOXp3/CD3 ratio was negatively correlated with graft function 12 months after the biopsy procedure. The analysis of these results led us to speculate about the involvement of these markers in the inflammatory response, mediating the tissue damage in the microenvironment of the graft, once it is immunological distinct scenarios, however, in this study, there is no enough data to point to a role in development of tolerance. In conclusion, it is unclear how the presence of Tregs and IDO limit the allograft rejection/chronicity or participate in this process, and their presence is still controversial