Bispecific T cell engager (BiTE) display a novel design among the class of bispecific antibodies and hold great promise to fight diverse cancers. BiTE molecules consist of two different binding entities derived from two human IgG antibodies connected by a short peptide linker. Their binding arms are directed against the CD3e chain of the T cell receptor on T cells and against an antigen that is specific for (e.g., CD19 for lymphoma in MT103) or over-expressed on (e.g., EpCAM for epithelial cancer in MT110) tumor cells. Without requirement for pre- or co-stimulation, BiTE molecules efficiently redirect CD3+ T cells towards tumor cells expressing the relevant target antigen. Only a BiTE molecule simultaneously bound to both tumor cell and T cell activates the T cell to exert its cytolytic function resulting in tumor cell death. In T cells stimulated with both BiTE and target cells, elevated levels of caspase activation and increased expression of cytotoxic and signaling proteins are observed. These include cytolytic proteins granzyme B and perforin, activation markers CD69 and CD25 and adhesion molecules CD2 and LFA-1. Activated T cells secrete the usual mix of cytokines, among them pro-inflammatory cytokines IFN-g and TNF-a. The membrane of tumor cells expressing the relevant target antigen is perforated during the attack of BiTE-stimulated effector cells as can be concluded from adenylate kinase release from the cytosol of tumor cells. Ca2+-chelator EGTA completely blocked BiTE-mediated activation of caspases and tumor cell lysis. As perforin is strictly Ca2+-dependent, a major role for this pore-forming protein is assumed for the elimination of tumor cells via BiTE-stimulated T cells. Granzyme B and caspases are main players in BiTE-mediated elimination of tumor cells. Inhibitors of granzyme B or caspases reduce or block, respectively the activation of caspases. However, other signals of apoptosis (cleavage of PARP and fragmentation of DNA) were only reduced by granzyme B inhibitor or caspase inhibitor. Most interestingly, the lytic capacity of BiTE molecules was not impaired by granzyme B inhibitor or caspase inhibitor. It seems that there is no requirement for granzyme B and caspases to be present simultaneously. Instead the data presented provide evidence that they can be replaced one at a time by related proteins. Pre-incubation of effector cells with the glucocorticoids dexamethasone or methylprednisolone resulted in markedly decreased secretion of cytokines by T cells yet only a small reduction in the expression of activation markers and adhesion molecules on T cells and specific lysis of tumor cells upon BiTE stimulation. Soluble factors secreted in an undirected manner by BiTE-stimulated T cells do not mediate tumor cell death by themselves. Bystander cells negative for the antigen that is recognized by the BiTE molecule will not be compromised by BiTE activity. The cytokine TGF-b reduced proliferation as well as granzyme B and perforin expression of BiTE-stimulated T cells. Redirected lysis by BiTE-activated T cells was also decreased under the influence of TGF-b, however lysis was still performed at a reasonable rate (72 % of target cells). TGF-b does not exert a deleterious effect on lytic potential of BiTE-stimulated T cells. The minimal anticipated biological effect level for the BiTE MT110 was determined for the entry of MT110 into phase I clinical studies. Experiments analyzing redirected lysis of tumor cells, expression of activation marker CD25 and cytokine release by T cells revealed a MABEL value of 50 pg/ml for MT110. / Bispecific T cell engager stellen mit ihrem neuartigen Design eine eigene Gruppe unter den bispezifischen Antikörpern dar und zeigen sich vielversprechend im Kampf gegen unter-schiedliche Krebsarten. BiTE Moleküle bestehen aus zwei unterschiedlichen Bindungsstellen, die von zwei humanen IgG Antikörpern abgeleitet sind und durch einen kurzen Peptidlinker verbunden sind. Die Bindungsstellen sind gerichtet gegen die CD3e Kette des T-Zell-Rezeptors auf T-Zellen und gegen ein Antigen, das auf den Tumorzellen ausschließlich (CD19 bei Lymphomen in MT103) oder in erhöhtem Maße (EpCAM bei epithelialem Krebs in MT110) exprimiert wird. BiTE Moleküle richten CD3+ T-Zellen gegen Tumorzellen, die das relevante Zielantigen präsentieren. Dabei sind sie nicht auf Vor- oder Kostimulation angewiesen. Nur wenn das BiTE Molekül gleichzeitig an Tumorzelle und T-Zelle gebunden ist, aktiviert es die T-Zelle zytolytisch zu wirken und die Tumorzelle zu töten. T-Zellen, die mit BiTE und zugleich Targetzellen stimuliert wurden, zeigen erhöhte Raten von Caspaseaktivierung und vermehrte Expression von zytotoxischen und Signalproteinen. Diese beinhalten die zytolytischen Proteine Granzyme B und Perforin, die Aktivierungs-marker CD69 und CD25 und die Adhäsionsmoleküle CD2 und LFA-1. Aktivierte T-Zellen sezernieren die übliche Mischung an Zytokinen, darunter die pro-inflammatorischen Zytokine IFN-g und TNF-a. Die Freisetzung von Adenylatkinase aus dem Zytosol von Tumorzellen lässt darauf schließen, dass die Membran von Tumorzellen, die das relevante Zielantigen exprimieren, während dem Angriff von BiTE-stimulierten Effektorzellen durchlöchert wird. Der Ca2+ Chelator EGTA verhinderte die BiTE-vermittelte Aktivierung von Caspasen und Lyse von Tumorzellen vollständig. Da Perforin in Abhängigkeit von Ca2+ wirkt, wird für dieses porenbildende Protein eine entscheidende Rolle in der Beseitigung von Tumorzellen mittels BiTE-stimulierter T-Zellen angenommen. Granzyme B und Caspasen sind die Hauptakteure in der BiTE-vermittelten Beseitigung von Tumorzellen. Inhibitoren von Granzyme B oder den Caspasen vermindern bzw. hemmen die Aktivierung von Caspasen. Andere Apoptosesignale (PARP-Spaltung und DNA-Fragmentierung) werden von Granzyme B- oder Caspase-Inhibitoren jedoch lediglich reduziert. Bemerkenswerterweise wurde die lytische Kapazität von BiTE Molekülen durch einen Granzyme B- oder Caspase-Inhibitor nicht beeinträchtigt. Es scheint, dass keine Notwendigkeit für die gleichzeitige Anwesenheit von Granzyme B und Caspasen besteht. Stattdessen erbringen die vorgestellten Ergebnisse einen Hinweis dafür, dass diese Proteine jeweils einzeln durch verwandte Proteine ersetzt werden können. Präinkubation von Effektorzellen mit den Glucocorticoiden Dexamethason oder Methylpred-nisolon bewirkte eine deutlich verminderte Zytokinsekretion von T-Zellen, jedoch nur eine geringe Abnahme der Expression von Aktivierungsmarkern und Adhäsionsmolekülen auf T-Zellen und der spezifischen Lyse von Tumorzellen in Folge von BiTE-Stimulierung. Lösliche Faktoren, die von BiTE-stimulierten T-Zellen nicht zielgerichtet abgegeben werden, vermitteln keine Lyse von Tumorzellen. Zellen, die sich in der Nachbarschaft des Tumors befinden, aber das Antigen nicht exprimieren, das vom BiTE Moleküle erkannt wird, werden daher durch BiTE Aktivität nicht in Mitleidenschaft gezogen. Das Zytokin TGF-b verminderte die Proliferation von BiTE-stimulierten T-Zellen sowie deren Expression von Granzyme B und Perforin. Die gerichtete Lyse von BiTE-aktivierten T-Zellen war unter dem Einflusss von TGF-b ebenfalls vermindert. Trotzdem erreichten die Lysisraten Werte von 72 %. TGF-b übt keinen schädlichen Effekt auf das lytische Potential von BiTE-stimulierten T-Zellen aus. Die MT110-Konzentration, bei der der geringste biologische Effekt erwartet wird, wurde für den Eintritt von MT110 in klinische Studien der Phase I bestimmt. Auf Grundlage von Experimenten zur gerichteten Lyse von Tumorzellen, zur Expression des Aktivierungsmarker CD25 auf T-Zellen und zu Freisetzung von Zytokinen aus T-Zellen, ergab sich ein MABEL-Wert von 50 pg/ml für MT110.

Thymome sind die einzigen Tumoren, die reife T-Zellen aus unreifen Vorläuferzellen generieren, wobei die unreifen Thymozytenpopulationen in Thymomen im Vergleich zum Thymus abnorm vermehrt und die reifen Populationen vermindert sind. Zusätzlich weist das Thymomgewebe im Vergleich zum Thymus weniger B-Zellen und Effektor-T-Zellen auf. Bisher ist unbekannt, welche Faktoren die veränderte intratumoröse Zusammensetzung der Zellpopulationen bedingen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, Mikromilieufaktoren in Thymomen mit möglichen Auswirkungen auf die intratumoröse Thymopoese zu identifizieren und deren Einfluß auf das periphere Immunsystem zu untersuchen. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde nach Ursachen für die abnorme Thymozytenreifung und die Generierung autoreaktiver T-Zellen in Thymomen gesucht. Als potentielles Autoantigen, das die positive Selektion in Thymomen beeinflussen könnte, wurde das in Thymomen exprimierte Protein p153 als Neurofilament mittleren Molekulargewichtes (NF-M) identifiziert. Mittels T-Zell-Proliferationstests konnte gezeigt werden, daß intratumoröse T-Zellen von Thymompatienten mit Myasthenia gravis (MG) nach Stimulation mit dem mittleren Fragment dieses Proteins (NF-M-B) signifikant höhere Antworten aufwiesen als Thymozyten von Thymitispatienten oder Thymompatienten ohne MG. NF-M-B-reaktive T-Zellen waren charakteristisch für die paraneoplastische MG, wohingegen T-Zell-Antworten gegen ein Azetylcholinrezeptor (AChR)-Fragment bei allen MG-Patienten (Thymitis und Thymom) erhöht waren. Diese Ergebnisse geben einen Hinweis darauf, daß intratumoröses NF-M eine autoantigene Determinante speziell für die paraneoplastische MG darstellt. Das Mikromilieu von Thymomen wurde außerdem mittels cDNA-Arrays und RT-PCR analysiert. Als differentiell exprimierte Gene sind besonders das "Heparin-binding growth-associated molecule" (HB-GAM) und der "B-cell growth factor 1" (BCGF 1) hervorzuheben. Die Expression von HB-GAM zeigte sowohl eine Abhängigkeit vom histologischen Thymomtyp (kortikal > gemischt / medullär) als auch vom MG-Status der Patienten (MG+ > MG-).Umgekehrt wurde für den Faktor BCGF 1 eine signifikante Erhöhung in Thymomen ohne MG gefunden und keine Abhängigkeit vom histologischen Thymomtyp. Die Expression des Chemokins "Interferon-inducible T cell alpha chemoattractant" (I-TAC) war ebenfalls mit dem MG (+)-Status von Thymompatienten signifikant assoziiert. Diese Befunde machen eine Beteiligung von HB-GAM, BCGF 1 und I-TAC an der Pathogenese der paraneoplastischen MG wahrscheinlich. Im Gegensatz dazu wurde die Expression des Chemokins "Thymus-expressed chemokine" (TECK) weder durch den histologischen Thymomtyp noch durch den MG-Status der Patienten beeinflußt. TECK ist vermutlich auch in Thymomen dafür verantwortlich, daß unreife Thymozyten nicht ins Blut gelangen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe von FACS-Analysen und T-Zell-Proliferationsassays der Einfluß von Thymomen auf das periphere Immunsystem untersucht. Es zeigte sich, daß die veränderte Thymopoese und autoreaktive T-Zell-Funktion in Thymomen mit immunologischen Veränderungen im Blut korreliert waren. Der Anteil zirkulierender CD45RA+ CD8+ T-Zellen war bei Thymompatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen signifikant erhöht, in Übereinstimmung mit einer intratumorösen T-Zell-Reifung, die in Richtung der CD8+-Linie verschoben war. Auf funktioneller Ebene war die intratumorös nachweisbare, thymomtypische T-Zell-Autoreaktivität gegen NF-M-B und alpha-AChR (301-398) gleichermaßen im Thymom und Blut zu finden. Diese funktionellen Studien unterstützen die Hypothese, daß die in Thymomen stattfindende Thymopoese das periphere T-Zell-Repertoire verändert. Hinsichtlich des Importes von T-Zellen aus der Peripherie in das Thymom ergaben die funktionellen Assays dagegen, daß T-Zellen, die auf ein fremdes Antigen (Tetanus Toxoid) reagierten, nur innerhalb zirkulierender T-Zellen, nicht aber innerhalb intratumoröser Thymozyten nachweisbar waren. Ebenso fanden sich erhöhte autoreaktive T-Zell-Antworten gegen andere Fragmente des NF-M-Proteins (NF-M-A und NF-M-C) sowie für ein Fragment der delta-Untereinheit des AChR nur im Blut von Thymompatienten. Diese Befunde sprechen dafür, daß die Migration von Effektor-T-Zellen aus der Peripherie ins Thymom vermindert ist. Während die Mechanismen für diese gestörte T-Zell-Rezirkulation ins Thymom ungeklärt sind, bestand eine Korrelation zwischen der Expression des B-Zell-spezifischen Chemokins BLC (B-Lymphocyte chemoattractant) und der Anzahl der B-Zellen, die immunhistochemisch in den entsprechenden Geweben dargestellt wurden. Dieser Befund kann auf eine Rolle von BLC bei der Migration reifer B-Zellen in Thymus- bzw. Thymomgewebe hinweisen. Zusammenfassend konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit Mikromilieufaktoren benannt werden, die von potentieller pathogenetischer Relevanz für die gestörte, nicht-tolerogene Thymopoese innerhalb von Thymomen sind. Zweitens konnte eindeutig gezeigt werden, daß die intratumoröse Thymopoese das periphere Immunsystem beeinflußt und bei MG-assoziierten Thymomen in Richtung auf ein höheres autoreaktives Potential verändert / Thymomas are the only tumors that generate mature T cells from immature precursors. In particular, the precursor subsets are increased inside thymomas while the mature T-cell subsets are decreased compared with normal thymus. Moreover, the number of B cells and effector T-cells are diminished in thymomas. It is unknown, which kind of intratumorous factors are responsible for the abnormal thymopoiesis and abnormal thymocyte subset composition in these tumors. The aim of this study was therefore to investigate micromilieu factors inside thymomas which have an impact on the abnormal thymopoiesis and on the extrathymic immune system. In the first part of the study, the molecular basis of the abnormal thymopoiesis and the generation of autoreactive T cells inside thymomas were investigated. It was shown, that the previously described thymoma protein p153 and the midsize-neurofilament (NF-M) are the same molecule. This potential autoantigen could have an impact on the generation of autoreactive T cells by influencing the positive selection inside thymomas. Using T-cell proliferation assays, intratumorous T cells showed significantly increased responses to one fragment of this protein (NF-M-B) in thymoma patients with myasthenia gravis (MG), in contrast to MG patients with thymitis or thymoma patients without MG. NF-M-B reactive T cells were characteristic for paraneoplastic MG while anti-AChR responses were increased in MG patients in general. These results offer further evidence that intratumurous NF-M is an autoantigenic determinant in paraneoplastic MG. Further investigations concerning the micromilieu inside thymomas were performed, using cDNA array technology and RT-PCR analysis. Among the differentially expressed genes were "heparin-binding growth-associated molecule" (HB-GAM) and the "B-cell growth factor" (BCGF 1). The expression of HB-GAM depended on the histological thymoma subtype (cortical > mixed/medullar) and on the MG association of the thymomas (MG+ > MG-). By contrast, BCGF 1 was significantly increased in thymomas of patients without MG, irrespective of the histological thymoma subtype. Furthermore, there was a significant association between the expression of the chemokine "Interferon-inducible T cell alpha chemoattractant" (I-TAC) and the occurrence of MG. These results could be a hint at an influence of HB-GAM, BCGF 1 or I-TAC on the pathogenesis of MG. By contrast, expression of the chemokine "thymus-expressed chemokine" (TECK) was normal irrespective of the histological thymoma subtype and the MG association. Therefore, this chemokine probably acts as a "thymocyte retention factor" inside thymomas as previously described for non-neoplastic thymus. In the second part of this work, the impact of thymomas on the peripheral immune system was investigated, using FACS analysis and T-cell proliferation assays. The results showed, that abnormal thympoiesis and autoreactive T-cell function in thymomas correspond with immunologic alterations in the blood. Specifically, the proportion of circulating CD45RA+ CD8+ T cells was significantly increased in patients with thymoma compared with normal controls, in accordance with intratumorous T-cell development that is abnormally skewed toward the CD8+ phenotype. On the functional level, the intratumous thymoma-specific T-cell responses to NF-M-B and alpha-AChR (301-398) were equally distributed between thymomas and blood. These functional studies support the hypothesis that thymopoiesis occurring within thymomas alters the peripheral T-cell repertoire. Concerning T-cell import from the periphery into thymomas, the functional studies demonstrate that T-cell responses to foreign antigen (ie, tetanus toxoid) were seen only among circulating T cells and not among thymoma-derived T cells. Moreover, increased autoreactive T-cell responses towards other fragments of the NF-M protein (NF-M-A, NF-M-C) or toward a fragment of the AChR d-subunit could be detected only in the blood of thymoma patients. These results demonstrate a diminished migration of effector T-cells from the periphery into thymomas. While the mechanisms for this altered T-cell recirculation are still unknown, the results of this study could show a correlation between the expression of the B-cell chemokine "B-lymphocyte chemoattractant" (BLC) and the number of B cells as determined by immunohistochemistry. This is a hint at a role of BLC in the migration of mature B cells into thymus or thymoma tissue. In summary, the present study could identify micromilieu factors with potential relevance for the pathogenesis of the disturbed, non-tolerogenic thympoiesis occurring inside thymomas. Furthermore, it could be shown unequivocally that intratumorous thymopoiesis has an impact on the peripheral immune system of virtually all thymoma patients but contributes to its increased autoreactive potential specifically in thymoma patients with myasthenia gravis.

Der MHC der Lewis.1F-Ratte (RT1f) stimuliert die präferentielle Expansion von CD8-T-Zellen, die das V-Segment 8.2 (AV8S2) der TCR-alpha-Kette verwenden. Sowohl als Folge der positiven thymischen Selektion in der Lewis.1F-Ratte (LEW.1F) wie auch bei der RT1f-Alloerkennung. Es war Ziel dieser Arbeit, das MHC Kl. I-Molekül der LEW.1F-Ratte, das diese präferentielle Expansion von AV8S2-Zellen induziert, zu klonieren sowie die Kontaktpunkte der Interaktion zwischen dem MHC-Molekül und AV8S2 zu kartieren. Über RT-PCR wurde ein MHC-I-Gen der LEW.1F-Ratte (RT1.Af) isoliert, sequenziert und zusammen mit einem anderen MHC-I-Gen aus der LEW.1F-Ratte (A2f) analysiert, das von einer Arbeitsgruppe aus Babraham (Cambridge, UK) gefunden worden war. Durch einen Nukleotidsequenz-Vergleich von Af und A2f mit bekannten Ratte-MHC-I-Genen konnte gezeigt werden, daß die Sequenzen beider charakteristisch für Ratte-MHC-I-Gene sind. Beide Moleküle wurden stabil in L-Zellen, rCD80-transfizierte P815-Zellen und T-Zellhybridomen (THO35/1) exprimiert. Die serologische Charakterisierung mit 19 RT1f-reaktiven Alloantikörpern ergab, daß sich die LEW.1F-Serologie alleine durch Af erklären läßt. In einem Zytotoxizitätstest mit LEW.1F-reaktiven zytotoxischen T-Lymphozyten, wurde Af spezifisch erkannt, A2f dagegen nicht. Serologie und Zytotoxizitätstest zeigen, daß die RT1f-spezifische Alloerkennung das Af-Molekül fokussiert, A2f unbedeutend scheint. Möglicherweise, da dieses Molekül in der LEW.1F-Ratte nur schwach exprimiert ist. Die Interaktion von Af und A2f mit AV8S2-Zellen wurde mittels einer MLR (gemischte Lymphozytenreaktion) in der Alloerkennung untersucht: Af, nicht aber A2f, stimuliert die präferentielle Expansion AV8S2-positiver CD8-T-Zellen in der Alloreaktion. Somit ist Af als das Molekül identifiziert, daß die Überselektion von AV8S2-Zellen vermutlich auch in der thymischen Repertoire-Selektion induziert. Zur Kartierung der Af/AV8S2-Interaktion wurden Hybridmoleküle aus Aa und Af gentechnisch hergestellt: Aa und Af unterscheiden sich extrazellulär nur in sieben Aminosäuren, die konzentriert auf zwei Regionen des MHC-Moleküls liegen: "Region I" (AS 62, 63, 65, 69, 70) und "Region II" (167, 169). Aa stimuliert keine präferentielle AV8S2-Zell-Expansion, daher muß die charakteristische Kombination dieser sieben Aminosäuren für die präferentielle Interaktion mit AV8S2-positiven CD8-T-Zellen ausschlaggebend sein. Durch MLRs mit Hybrid-exprimierenden Stimulatorzellen wurde gezeigt, daß beide Regionen zur präferentiellen Expansion AV8S2-exprimierender CD8-T-Zellen beitragen. Durch den Vergleich mit anderen Daten unseres Labors konnte dargelegt werden, daß die beta-Kette zur präferentiellen Interaktion von AV8S2-Zellen mit Af keinen spezifischen Beitrag leistet. Ebenso unbeteiligt ist die Komplementarität-bestimmende Region 2 (CDR2) der alpha-Kette. Die charakteristischen Sequenzen von CDR1alpha und CDR3alpha dagegen sind für die präferentielle Expansion von AV8S2-positiven CD8-T-Zellen durch Af essentiell. / It was shown previously that RT1f (the MHC of the LEW.1F rat) preferentially expands AV8S2 (V-segment 8.2 of the TCR-alpha chain) expressing T-cells in positive thymic selection in the LEW.1F rat (overselection) as well as AV8S2 cells alloreactive to RT1f. As the preferential AV8S2 expansion was only detected in the CD8 T-cells, a MHC class I molecule of the LEW.1F rat was postulated to be responsible for the overselection. In this thesis the MHC I molecule of the LEW.1F rat promoting preferential expansion of AV8S2 CD8 T-cells in allorecognition was identified. To this end a MHC I molecule of the LEW.1F rat, Af, was cloned and sequenced. Together with A2f, another MHC I molecule of the LEW.1F rat, cloned and sequenced by a group from Babraham/UK, Af was expressed in various cell lines and hybridomas. The two molecules were tested for recognition by RT1f-reactive antibodies and cytotoxic T-lymphocytes. By these criteria Af was defined as a MHC class I molecule of the LEW.1F rat whereas A2f was not. The ability to overselect AV8S2 CD8 T-cells was examined by MLR (mixed lymphocyte reaction). Preferential interaction of this TCR segment with Af but not A2f has therefore been demonstrated. Thus Af is the molecule preferentially expanding AV8S2 cells. To identify the Af/AV8S2-contact points hybrids between Aa and Af were generated: Extracellularly, Aa differs from Af in only seven aminoacids, which are clustered in two different regions (region I and II). Yet Aa is not able to promote preferential expansion of AV8S2 CD8 T-cells. Therefore the specific combination of the seven aminoacids differing between the two molecules are crucial in the observed preferential AV8S2 reactivity of Af. In generating hybrids differing in these regions, equal contributions of both regions for recognition by AV8S2 RT1f-reactive CD8 T-cells could be demonstrated. By theoretical implication the Af/AV8S2 interaction points could be narrowed down further: On the side of the MHC, solely the presumably directly TCR-contacted MHC aminoacids 62, 65, 69 and 167 are likely to be involved in AV8S2-cell expansion. On TCR side, the beta-chain is not involved in specific Af interaction. Only complementarity determining regions 1 and 3 of the TCR-alpha chain are essential for preferential interaction with Af by AV8S2 positive CD8 T-cells.

Transforming-Growth-Factor-beta1 (TGF-b1) ist ein multifunktionelles Zytokin, welches insbesondere Zellwachstum und Zelldifferenzierung koordiniert. TGF-b ist vor allem dafür bekannt, Zellen des Immunsystems zu beeinflussen. TGF-b steuert zum Beispiel die Differenzierung von T-Zellen und und deren Effektorfunktionen. Die Signaltransduktion von TGF-b wird vermittelt durch die Phosphorylierung von Rezeptor-assoziierten Smad-Proteinen (R-Smads). R-Smads werden vom Typ I Rezeptor aktiviert, der seinerseits vom hochaffinen Typ II Rezeptor phosphoryliert wird, sobald der Ligand bindet. Die phosphorylierten RSmads assoziieren darauf mit Co-Smads. Heterooligomere von R-Smads und Co-Smads wandern dann in den Zellkern, wo sie im Zusammenspiel mit Transkriptionsfaktoren wie CBP/p300 oder AP-1 die Transkription TGF-b-spezifischer Zielgene koordinieren. Neue Erkenntnisse lassen vermuten, daß die pleiotropen Effekte von TGF-b durch das Interagieren mit anderen Signalkaskaden entstehen, zum Beispiel mit dem MAP-Kinase-Weg oder der STAT-Kaskade. Wir beschreiben hier den Effekt von TGF-b auf die Effektorfunktionen unterschiedlich stimulierter primärer Maus-Milzzellen und aufgereinigten zytotoxischen CD8+ Maus-TZellen. Langzeitbehandlung mit TGF-b resultierte in der Unfähigkeit der Zellen, Smad2 ligandeninduziert zu phosphorylieren. Entweder wurde überhaupt keine Phosphorylierung beobachtet, oder eine anhaltende Phosphorylierung von Smad2 unabhängig vom Vorhandensein des Liganden. Des weiteren stellten wir einen Zusammenhang zwischen anhaltender Smad2-Phosphorylierung und der Resistenz gegenüber TGF-b induzierter Wachstumshemmung fest. Im Gegensatz dazu zeigen Zellen, die sensitiv sind gegenüber TGF-b vermittelter Wachstumshemmung, keine Smad2-Phosphorylierung mehr. Bezüglich ihrer zytotoxische Aktivtät waren allerdings beide Phänotypen nicht mehr lytisch wirksam, unabhängig von der jeweiligen Smad2-Phosphorylierung. In dieser Arbeit zeigen wir auch die Notwendigkeit eines funktionalen MEK-1-Signalweges auf, der unabdingbar ist, damit TZellen keine Wachstumsinhibierung durch TGF-b mehr erfahren. Das Blockieren dieses Signalweges führt darüberhinaus bei diesen Zellen ebenfalls zu einem veränderten Smad2- Phosphorylierungsmuster. Bezüglich des JNK-Signalweges konnten wir feststellen, daß ein funktional aktiver JNK-Signalweg mit der Resistenz gegenüber TGF-b vermittelter Wachstumsinhibierung einhergeht. Allerdings führt die Zugabe von IFNg und/oder aCD28- Antikörper nicht zu einer veränderten Sensitivität gegenüber TGF-b. Im Gegensatz zuprimären Zellen können die beschriebenen Zusammenhänge in Zellkulturen vom humanen und murinen T Zellen nicht beobachtet werden, und sind somit spezifisch für primare TZellen. Wir beschreiben auch die Klonierung eines chimären dominant-negativen Typ II Rezeptors, der an eine Kinase gekoppelt ist, die bei Aktivierung Zelltod auslöst. Damit soll es in Zukunft möglich sein, T-Zellen gegenüber TGF-b Resistenz zu verleihen. Die hier geschilderten Ergebnisse vertiefen die Kenntnisse über molekulare Mechanismen der Wirkung von TGF-b auf T-Zellen und können vielleicht dazu beitragen, negative Effekte von TGF-b, zum Beispiel in der Tumortherapie, gezielt abzuwenden. / Transforming-Growth-Factor-beta1 (TGF-b1) is a multifunctional cytokine that regulates cell growth and differentiation in many types of cells. TGF-b1 is especially known to exert a variety of regulatory functions in the immune system, such as T cell differentiation and T cell function. Signal transduction of TGF-b1 is mediated by phosphorylation of receptorassociated Smad proteins (R-Smads). R-Smads are phosphorylated by the activated type I receptor, which is itself phosphorylated by the high affinity type II receptor upon ligand binding. The phosphorylated R-Smads then associate with Co-Smads. Heterooligomers of R- and Co-Smads translocate into the nucleus where they regulate transcription of target genes in concert with other transcription factors such as CBP/p300 or AP-1. Recent findings suggest that the pleiotropic effects of TGF-b1 are conferred by crosstalks to other signal transduction pathways such as the MAP-kinases or the STAT-pathway. Here we describe the effect of long-term exposure to TGF-b1 on the effector function of differentially stimulated primary murine splenocytes and purified primary murine CD8+ cytotoxic T cells. Long-term exposure to TGF-b1 results in non-responsiveness to TGF-b1- induced Smad2 phosphorylation. This is seen either by no phosphorylation or sustained phosphorylation of Smad2. Furthermore, we observed a strong correlation between sustained Smad2 phosphorylation and resistance to TGF-b1 mediated growth inhibition. In contrast, splenocyte cultures strongly growth inhibited by TGF-b1 showed no Smad2 phosphorylation. Lytic activity of these cultures, however, was found to be suppressed regardless of proliferation properties and Smad2 phosphorylation pattern. We also describe that a functional MEK-1 pathway is a prerequisite for rendering murine splenocytes unresponsive to TGF-b1 mediated growth inhibition, and that inhibition of the MEK-1 cascade alters the Smad2 phosphorylation pattern. In addition, we show that resistance to TGF-b1 mediated growth inhibition correlates with the activation of the JNK pathway. However, the resistant phenotype was found unable to be reverted upon administration of exogeneous IFNg and/or aCD28 antibody. In human or mouse T cell lines, however, the described correlation between the type of stimulation and TGF-b growth resistance or growth sensitivity is not present. Thus, this correlation is specific for primary T cells. We also cloned a chimeric dominantnegative TGF-b receptor which is coupled to a suicide gene, in order to render T cells resistant to TGF-b mediated effects.These findings shed light on how TGF-b1 mediates its immunosuppressive role, and may help to gain knowledge of averting these TGF-b1 effects in the course of tumor therapy.

In der vorliegenden Arbeit wurden die in-vivo-Effekte eines „superagonistischen“ mAks mit Spezifität für den kostimulierenden Rezeptor CD28 der Ratte untersucht. Dieser Antikörper unterscheidet sich von konventionellen CD28-spezifischen mAk durch seine Fähigkeit, T Zellen auch ohne Ligation des TZR und damit polyklonal zu aktivieren. Die so ausgelöste Expansion der T Zellen verläuft so schnell und effizient wie eine durch Antigen gesteuerte Proliferation; die überproportionale Vermehrung anti-inflammatorischer regulatorischer T Zellen während der initialen Expansionsphase ist vermutlich für das Ausbleiben toxischer Effekte im Zuge der polyklonalen TZellvermehrung verantwortlich. / The present project focuses on the mitogenic effects of the superagonistic rat anti- CD28 mAb, with particular emphasis on its ability to activate and expand residual, mature T cells in lymphopenic rats in a TCR independent manner. The CD28 superagonist possesses the capacity to initiate T cell activation without TCR engagement. The resulting polyclonal T cell expansion is as rapid and efficient as an antigen driven proliferation, and its additional property to transiently increase the frequency of antiinflammatory regulatory T-cells is likely to be responsible for the of toxic side-effects during CD28-driven polyclonal T-cell expansion.

We examined the regulation of NFATc1 in different lymphomas and observed an inversed correlation between the methylation status and expression of NFATc1. Our data demonstrate that aberrant DNA methylation associated with chromatin remodeling within nfatc1 locus is a major mechanism for the repression of NFATc1 expression, suggesting that the DNA methylation-mediated transcriptional silencing of NFATc1 may be a critical event in the tumorogenesis of ALCLs and cHLs. Furthermore, the DNA methylation of human nfatc1 promoter region could be used as a novel biomarker of tumor progression. Our results indicate a close link between the loss of immunoreceptor signaling and NFATc1 expression in human lymphomas. For both ALCLs and cHLs, defects in immunoreceptor signaling have been described which result in a loss of receptor-mediated gene expression programs (Schwering et al., 2003; Bonzheim et al., 2004; Marafioti et al., 2004). In T cells, one indicator gene of these programs appears to be the nfatc1 gene whose expression is controlled by TCR signals (Chuvpilo et al., 2002a). In contrast, in T cells NFATc1 expression is unaffected by TCR signals, and NFATc2 was found to be expressed at normal levels in ALCLs and cHLs (L.K., unpubl. data). Moreover, the activity of NF-kappaB factors which can bind to certain NFAT binding sites and share a distantly-related DNA binding domain with NFATs is strongly elevated in cHL cells (Bargou et al., 1997; Hinz et al., 2001; Hinz et al., 2002) suggesting that NFATs and NF-kappaBs exert very different effects on generation and maintenance of Hodgkin’s lymhomas. However, it should be mentioned that in Burkitt’s and further B cell lymphomas in which NFATc1 proteins are strongly expressed and controlled by receptor signals (Kondo et al., 2003), they could exert a promoting function in tumor development. The genes of p53 family members p63 and p73 are prominent examples for mammalian genes whose products can act both as oncoproteins and tumor suppressor genes (Hibi et al., 2000; Stiewe and Putzer, 2002), and it is likely that more genes exist which encode both tumor suppressors and oncoproteins. It remains to be shown whether the nfatc1 gene is one of them. / Wir haben die Regulation von NFATc1 in verschiedenen Lymphomen untersucht und beobachteten eine umgekehrte Korrelation zwischen dem Ausmaß an Methylierung und der Expression von NFATc1. Unsere Daten demonstrieren, dass eine aberrante DNA-Methylierung, die mit veränderter Chromatinstruktur innerhalb des nfatc1 Lokus assoziiert ist, der Hauptmechanismus für die Repression der NFATc1-Expression ist. Es wäre zu vermuten, dass die durch DNA-Methylierung verursachte transkriptionelle Abschaltung von NFATc1 der kritische Schritt bei der Tumorgenese von ALCLs und cHLs ist. Des weiteren könnte das Ausmaß der DNA-Methylierung in der humanen nfatc1-Promotorregion als neuer Biomarker für Tumorprogression genutzt werden. Unsere Daten indizieren eine enge Verbindung zwischen dem Verlust von Immunrezeptorsignalen und der NFATc1-Expression in humanen Lymphomen. Für sowohl ALCLs als auch cHLs wurden Defekte in der Immunrezeptorsignalgebung beschrieben, welche sich im Verlust des Rezeptor vermittelten Genexpressionsprogramms niederschlagen (Schwering et al., 2003; Bonzheim et al., 2004; Marafioti et al., 2004). In T-Zellen scheint das nfatc1-Gen eins der Indikatorgene dieses Programms zu sein, dessen Expression durch TCR-Signale kontrolliert wird (Chuvpilo et al., 2002a). Im Gegensatz dazu bleibt die NFATc2-Expression in T-Zellen unbeeinflusst von TCR-Signalen, weshalb NFATc2 in ALCLs und cHLs auch in normalem Ausmaß exprimiert wird (L.K., unpubl. data). Andererseits ist die Aktivität der NF-kappaB-Faktoren, die auch an bestimmte NFAT-Bindungsstellen binden können und deren DNA-Bindungsdomäne entfernt mit der der NFATs verwandt ist, in cHL-Zellen stark erhöht (Bargou et al., 1997; Hinz et al., 2001; Hinz et al., 2002). Das lässt vermuten, dass NFATc1 und die NF-kappa-Faktoren eine sehr unterschiedliche Rolle bei der Entstehung und dem Erhalt der Hodgkinlymphome spielen. Es sollte aber erwähnt werden, dass in Burkitts und anderen B-Zelllymphomen, in denen NFATc1-Proteine stark exprimiert und darüber hinaus durch Rezeptorsignale kontrolliert sind (Kondo et al., 2003), diese eine Tumor fördernde Funktion ausüben könnten. Die Gene der p53-Familienmitglieder p63 und p73 sind prominente Beispiele für Säugergene, deren Produkte sowohl als Onkoproteine als auch als Tumorsuppressoren fungieren können (Hibi et al., 2000; Stiewe and Putzer, 2002), und es ist wahrscheinlich, dass es noch weitere Gene gibt, die beide Funktionen ausüben. Es wird zu zeigen sein, ob das nfatc1-Gen eins von ihnen ist.

To analyze the role of protein kinase B(PKB)on developmental and functional aspects of T cells, we have generated transgenic mouse lines expressing a constitutively active form of PKB (myrPKB) in early stages of T cell development.Peripheral CD4+ T cells from PKB tg mice are hyperreactive, more efficient in producing th1 and th2 cytokines and show faster and CD28 co-stimulation independent cell cycle progression.Interestingly PKB tg T cells are resistant to CsA treatment in proliferation and cytokine production.Further analysis show PKB tg CD4+ T cells have a drastically reduced nuclear translocation of NFAT proteins and this is due to a direct interaction between PKB and NFAT. To study whether the negative regulatiopn of NFATs by PKB affects T cell development, we analyzed double tg mice expressing both, a constitutively active version of calcineurin (dCam) and myrPKB. dCam tg mice have a severe block in thymocyte development at the DN3 stage.But in the dCam/PKB double tg mice this developmental block is significantly rescued.This rescue of thymocyte development by PKB is due to the expression of RAG1 and subsequent TCRb chain expression. CsA treatment of neonatal thymic lobes from dCam mice restores normal thymocyte development, indicating involvement of NFATs in the severe block in dCam thymocyte development.Confocal studies clearly established that compared to dCam DN cells there is a significant reduction in the nuclear levels of NFATc1 and NFATc3 in dCam/PKB cells.Downregulation of nuclear NFAT levels by myrPKB thus seems to be an essential parameter in dCam cells to proceed with normal differentiation. In summary, the data from PKB tg peripheral CD4+ T cells and dCam/PKB double tg thymocytes clearly establish PKB as an important modulator of T cell development and function and PKB as a novel negative regulator of NFAT activation.

Notch Proteine gehören zu einer Familie hochkonservierter Transmembranrezeptoren, die bei Entwicklungsprozessen, beispielsweise im hämatopoetischen System, eine bedeutende Rolle spielen. So konnte eine Beteiligung von Notch und seinen Liganden bei der Differenzierung lymphatischer Zellen im Knochenmark, Thymus sowie in peripheren Organen gezeigt werden. Insbesondere unterdrückt Notch1 nach Ligandenbindung die Bildung von B-Zellen im Thymus und fördert stattdessen die Entwicklung von T-Zellen. Durch Aktivierung der γ-Sekretase wird die intrazelluläre Domäne von Notch1 freigesetzt und transloziert in den Kern. Dort wirkt Notch1 zusammen mit Proteinen der CSL Familie als Transkriptionsfaktor und reguliert so die Expression von Zielgenen wie beispielsweise HES1. Weiterhin kann die Signaltransduktion von Notch1 im Zytosol durch Wechselwirkung mit Proteinen wie Numb oder Deltex1 moduliert werden. Angesichts der Fähigkeit, die Proliferation unreifer Zellen aufrecht zu erhalten, kann eine aberrante Expression von Notch1 zur Entstehung von Neoplasien beitragen. Numb wird eine wichtige Rolle in der Regulation von Notch1 zugeschrieben, doch seine genaue Funktion in der T-Zellentwicklung ist unklar. Die Klonierung aller vier in der Ratte exprimierten Isoformen erlaubte erstmals deren detaillierte Charakterisierung. Die differentielle Expression und die preferentielle Interaktion von Numb i/o mit Notch1 deuten darauf hin, dass den verschiedenen Splice-Varianten nicht nur in der T-Zellentwicklung sondern auch in der Kontrolle von Notch1 unterschiedliche Funktionen zukommen. Diese Schlussfolgerung wird durch eine spezifische Expression der Numb Isoformen in humanen T-ALL Zelllinien weiter unterstützt. Transgene Ratten welche die intrazelluläre Domäne von Notch1 (N1IC) unter der Kontrolle des proximalen lck-Promoters überexprimieren (NICA), sind ein geeignetes Werkzeug, um die Rolle von Notch1 für die Genexpression und die Lymphomgenese zu untersuchen. Junge NICA-Ratten exprimieren N1IC spezifisch in Thymozyten, nicht jedoch in peripheren T-Zellen. In Folge dessen kommt es zu einer starken Expression bekannter Notch1 Zielgene, unter anderem dem präTα Rezeptor. Dies wiederum führt zur Substitution klassischer T-Zellrezeptor-Komplexe durch den präT-Zellrezeptor, was in adulten Tieren zur Entwicklung von thymischen Lymphomen beiträgt. Die Lymphomzellen in NICA-Ratten exprimieren das N1IC-Transgen sowohl im primären Tumor als auch nach Infiltration peripherer Organe. Dabei könnte die beobachtete Hochregulation von Notch3 ein möglicher Mechanismus der Tumorgenese in NICA-Ratten darstellen. Um die Ursache der Lymphomgenese besser zu verstehen, wurde eine genomweite Expressionsanalyse der Tumore mittels SAGE und Affymetrix DNA-Chips durchgeführt. Dabei wurden zahlreiche potentiell bedeutende Gene identifiziert, welche bei der Notch1-vermittelten Lymphomgenese eine Rolle spielen könnten. Die Beobachtung, dass ein Teil dieser Gene auch in humanen T-ALL-Zelllinien verändert ist, unterstreicht deren Bedeutung auch für die Pathogenese des Menschen. Eines der in NICA-Lymphomen am stärksten veränderten Gene wurde bislang weder in der Literatur noch in Sequenzdatenbanken beschrieben. Dieses von uns als Nip1 bezeichnete Protein ähnelt einem Enzym aus dem Isoprenoid-Stoffwechsel und ist vor allem im Thymus exprimiert. Ein anderes interessantes Kandidatengen ist CD30, ein Transmembran-Rezeptor welcher bei Hodgkin Lymphomen beschrieben wurde. Neben T-ALL wurde auch bei Hodgkin Lymphomen eine wichtige Rolle von Notch1 berichtet. Dabei könnte dessen hohe Expression im Zusammenhang mit der Transformation und dem Verlust der B-Zell-Identität dieser Tumore stehen. Um dies näher zu untersuchen, wurde Notch1 mittels RNAi bzw. durch Überexpression des negativen Regulators Deltex1 in Hodgkin-Zelllinien inaktiviert. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse unterstützen die These, dass nach Repression der Notch1 Aktivität die Expression B-Zellspezifischer Marker wieder gewonnen werden kann. Zusammengefasst deuten die Ergebnisse dieser Arbeit auf eine bedeutende Funktion von Notch1 bei der T-Zellentwicklung und der Entstehung von Lymphomen hin. Dabei scheint insbesondere die Interaktion mit Proteinen wie Numb und Deltex1 sowie die Regulation der Genexpression wichtig zu sein. Die gewonnenen Daten könnten in Zukunft einen neuen Ansatzpunkt zur Entwicklung verbesserter Strategien zur Therapie von Krebserkrankungen des hämatopoetischen System bilden. / Notch proteins belong to a family of highly conserved transmembrane receptors, which play an important role in development processes such as in the hematopoietic system. Participation of Notch and its ligands could be demonstrated during differentiation of lymphatic cells in the bone marrow, thymus as well as in peripheral organs. After ligand binding, Notch1 particularly suppresses the formation of B-cells in the thymus while promoting the development of T-cells. The intracellular domain of Notch1 is released by activated γ-secretase and translocates into the nucleus. There, Notch1 and proteins of the CSL family act as a transcription factor and regulate the expression of target genes, for example HES1. Furthermore, signal transduction by Notch1 is modulated within the cytosol by interaction with proteins such as Numb or Deltex1. In view of the ability to maintain the proliferation of immature cells, aberrant Notch1 expression can also contribute to the formation of neoplasias. Numb is attributed an important role in the regulation of Notch1, but its exact function in T-cell development remains unclear. Cloning of all four Numb iso-forms in the rat permitted for the first time their detailed characterisation. The differential expression and the preferential interaction of Numb i/o with Notch1 indicate that the different splice variants not only play distinct roles in T-cell development but also in the control of Notch1 function. The observation that the Numb iso-forms in human T-ALL cell lines are also differentially expressed further supports this conclusion. Transgenic rats (NICA) which overexpress the intracellular domain of Notch1 under the control of the proximal lck promoter (N1IC), are a suitable tool to study the role that Notch1 has for gene expression and lymphomagenesis. Young NICA rats specifically express N1IC in thymocytes but not in peripheral T-cells. This leads to a strong expression of Notch1 target genes, e.g. the preTα chain. Consequently, classical TCR complexes are substituted by the preT cell receptor, which presumably contributes to the development of thymic lymphomas in adult animals. The lymphoma cells in NICA rats express the N1IC transgene both in the primary tumor and after infiltration of peripheral organs. In this context, the observed upregulation of Notch3 could represent a possible mechanism of tumorigenesis in NICA rats. In order to understand the cause of the lymphomagenesis, a genome-wide expression analysis of the tumors was accomplished by means of SAGE and Affymetrix DNA chips. Numerous potentially meaningfull genes were identified, which could play a role for Notch1-dependent lymphomagenesis. The observation that part of these genes is also altered in human T-ALL cell lines, underlines their meaning also for human pathogenesis. One of the genes that was most strongly upregulated in NICA lymphomas has so far neither been described in literature nor in sequence data bases. This protein, designated Nip1, resembles an enzyme from the isoprenoid metabolism and is particularly expressed in the thymus. Another interesting candidate gene is CD30, a transmembrane receptor which was described in Hodgkin lymphoma. Besides T-ALL, an important role of Notch1 was also reported in the context of Hodgkin lymphomas. Its high expression is potentially related to the transformation and loss of the B-cell identity of these tumor. In order to examine this in more detail, Notch1 was inactivated in Hodgkin lymphoma cell lines by means of RNAi and by overexpression of the negative modulator Deltex1. The results that have hereby been obtained are in support of the the notion that expression of B-cell specific markers can be regained after repression of Notch1 activity. In summary, the results of this work point towards an important function of Notch1 during T-cell development and the formation of lymphomas. In particular, interaction with proteins such as Numb and Deltex1 as well as regulation of gene expression appear to be important for these Notch1 functions. In the future, the obtained data could form a basis for the development of improved strategies to treat malignancies of the hematopoietic system.

Der Kontakt humaner T-Zellen mit dem MV Glykoproteinkomplex interferiert mit der CD3/CD28 stimulierten Aktivierung von PI3/Akt-Kinase Signalwegen. Damit verbunden ist der ineffiziente Transport PH-Domänen-enthaltender Proteine in Membran-rafts, wie der Akt-Kinase und Vav, den Guaninnukleotid-Austauschfaktor von Rho GTPasen. Es konnte gezeigt werden, dass infolge des MV-Kontaktes die CD3/CD28 stimulierte Aktivität der Rho GTPasen Cdc42 und Rac1 inhibiert ist. Dagegen war in MV-behandelten Zellen eine leichte RhoA Aktivierung festzustellen. Rho GTPasen spielen eine kritische Rolle in der Regulation von Zytoskelettorganisation von T-Lymphozyten. Übereinstimmend damit wurde gezeigt, dass der Kontakt mit MV die CD3/CD28 costimulierte Aktivierung und Polymerisation des F-Aktins inhibiert. Damit verbunden ist die reduzierte Fähigkeit MV-behandelter T-Zellen auf Fibronektin- und mit CD3/CD28 Antikörpern-beschichteten Objektträgern zu polarisieren. Die Ausbildung F-Aktin-getriebener morphologischer Veränderungen, wie Filopodien, Lamellipodien und Uropodien, ist drastisch reduziert. Rasterelektronenmikroskopische Auf-nahmen zeigten in nicht-stimulierten und CD3/CD28 costimulierten MV-behandelten T-Zellen einen nahezu kompletten Verlust an Mikrovilli und Lamellipodien. Die Bindung von MV induziert die Dephosphorylierung des F-Aktin–bindenden Proteins Cofilin und der ERM-Proteine. Es konnte demonstriert werden, dass der MV-Kontakt die Ausbildung einer reifen immunologischen Synapse stört. Trotz der morphologischen Veränderungen konjugieren MV-behandelte T-Zellen mit DCs. Die Anzahl MV-behandelter T-Zellen, die mit DCs inter-agieren, ist vergleichbar mit der mock-behandelter T-Zellen. Allerdings zeigt die 3-dimensionale Rekonstruktion der DC/T-Zell-Kontaktzone, dass in MV-behandelten T-Zellen die zentrale Akkumulation und Clusterbildung des CD3-Moleküls gestört ist und keine monozentrische Synapse ausbildet wird. Desweiteren erfolgt die Relokalisation des MTOC in T-Zellen in Richtung der DC unvollständig. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der MV Glykoproteinkomplex mit essentiellen Schritten einer erfolgreichen T-Zell-Aktivierung während der APC/T-Zell-Interaktion interferiert. / It was previously shown, that CD3/CD28-induced activation of PI3/Akt kinase pathway and proliferation are impaired in T cells after contact with the MV glycoprotein complex. As a result of PI3 kinase inactivation, membrane recruitment of PH domain containing proteins such as Akt kinase and the Rho GEF Vav, was abolished after CD3/CD28 coligation. The binding of MV interferes with CD3/CD28 coligation induced GTP-loading of the Rho GTPases, Cdc42 and Rac1. GTP-loading of RhoA was not impaired after MV treatment. Rather, RhoA was slightly activated by MV alone and this was enhanced upon CD3/CD28 ligation. Consisting with the failure of CD3/CD28 ligation to induce GTP-loading of Cdc42 and Rac1, polymerization of F-actin and morphological changes required for the formation of a contact plane such relaxation, flattening did not occur in MV treated T cells. MV treatment also efficiently interfered with the ability of T cells to adhere to ECM components. In contrast to mock treated, the majority of MV exposed T cells failed to aquire a polar front-rear organization. Thus, MV induced signaling efficiently impairs stimulation dependent reorganisation of the F-actin cytoskeleton and adhesion in T cells. As revealed by scanning electron microscopy, exposure of T cells to MV induced an almost complete breakdown of microvillar structures which could also not be restored upon CD3/CD28 costimulation. The almost complete collapse of membrane protrusions in MV treated cells was associated with reduced phosphorylation levels of cofilin and ERM proteins. The ability of MV exposed T cells to interact with DCs and form DC/T-cells conjugates is not affected. MV signaling to T cells interfered with clustering and recruitment of CD3 into the central supramolecular activation cluster of the IS. MV also prevents the redistribution of the MTOC in T cells towards the synapse. In summary, MV interferes with stimulated cytoskeleton remodeling, and this disturbes the ability of T cells to adhere, spread and cluster receptors essential for sustained activation. The signal given by the MV glycoprotein complex apparently prevents essential steps in APC/T cells interactions which are required for migration and successful activation.

Zu den gefährlichen Komplikationen der Masern gehört die selten vorkommende ZNS-Erkrankung subakute sklerosierende Panenzephalitis (SSPE), die erst mehrere Jahre nach einer akuten Masernvirusinfektion auftritt. Die SSPE verläuft immer tödlich und bis heute gibt es keine spezifische Therapie gegen diese Erkrankung. Unsere Arbeitsgruppe hat ein Modell für eine persistierende, virale ZNS-Infektion entwickelt, in dem 2-Wochen-alte, immunologisch normale C57BL/6-Mäuse mit einem rekombinanten, neurotropen Masernvirus (MV), das das Hämagglutinin eines an Nagern angepassten MV-Stammes enthält, intrazerebral (i.c.) infiziert werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Rolle regulatorischer CD4+ CD25+ Foxp3+ T-Zellen (Treg) in diesem Mausmodell analysiert und untersucht, ob die persistierende ZNS-Infektion durch Manipulation peripherer Treg beeinflusst werden kann. Außerdem wurde ein IFN-y-ELISPOT-Assay etabliert, der CD8+ zytotoxische T-Zellen (CTL) identifiziert, die spezifisch für die MV-Hämagglutinin-Epitope MV-H22-30 (RIVINREHL) bzw. MVH446-454 (SNHNNVYWL) sind. In Bezug auf das erstgenannte Epitop wurde desweiteren eine Pentamer-Färbung etabliert, um CTLs mit Hilfe der Durchflusszytometrie zu identifizieren, die H-2Db-gekoppelte MV-H22-30-Epitope erkennen. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit zeigen, dass sich trotz eines hohen Anteils Masern-spezifischer CTLs und nur sehr wenigen Treg im Gehirn eine persistierende ZNSInfektion ausbildet. Periphere Treg wurden während der persistierenden Phase der ZNS-Infektion expandiert bzw. depletiert und die Konsequenzen für die Virus-spezifische Immunantwort sowie das Ausmaß der persistierenden Infektion wurden analysiert. Die Expansion von Treg mit Hilfe des superagonistischen anti-Maus CD28 Antikörpers D665 verursachte eine transiente Immunsuppression, die die Virus-Replikation sowie -Ausbreitung im Gehirn verstärkte. Im Gegensatz dazu führte die Depletion von Treg in DEREG-Mäusen mittels Diphtherietoxin zu einem erhöhten Anteil Virus-spezifischer CTLs im Gehirn sowie zu einer Reduktion der persistierenden ZNS-Infektion. Diese Daten zeigen, dass Treg die Fähigkeit besitzen, die Persistenz von MV im Gehirn zu kontrollieren und somit möglicherweise Teil eines Therapiekonzeptes gegen ZNS-Infektionen mit dem Masernvirus sein können. Frühere Studien unserer Arbeitsgruppe haben außerdem gezeigt, dass das durch IFN-y induzierbare Enzym Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) antivirale Aktivitäten gegen MV aufweist. Dies wurde in dieser Doktorarbeit in vivo in unserem Mausmodell anhand von IDOk.o.-Tieren bestätigt, die nach i.c. Infektion nicht nur eine erhöhte Mortalitätsrate aufwiesen sondern auch in den überlebenden Tieren eine verstärkte persistierende ZNS-Infektion zeigten. / Among the serious complications following a measles virus infection is the CNS disease subacute sclerosing panencephalitis (SSPE), which occurs very late after acute measles and always leads to death within a few years. Unfortunately, there is no specific therapy available till today. Our group earlier established a model of a persistent viral CNS infection using two week old immunologically normal mice and a recombinant neurotropic MV expressing the hemagglutinin of the rodent brain-adapted MV strain CAM/RB. Using this model infection we investigated the role of regulatory CD4+CD25+ Foxp3+ T cells (Treg) as regulators of the immune response in the brain, and assessed whether the persistent CNS infection can be modulated by manipulation of Treg in the periphery. We also established an IFN-y-ELISPOT assay to identify CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) specific for the MV hemagglutinin epitopes MV-H22-30 (RIVINREHL) and MV-H446-454 (SNHNNVYWL). With respect to the first epitope (MV-H22-30) we also established pentamer staining identifying CTLs recognising this epitope linked to H-2Db molecules via FACS analyses. Our results show that in spite of a high number of MV-specific CTLs and only a few Treg in the brain a persistent infection is established. Treg were expanded or depleted during the persistent phase of the CNS infection, and the consequences for the virus-specific immune response and the extent of persistent infection were analyzed. Expansion of Treg after intraperitoneal application of the superagonistic mouse anti-mouse CD28 monoclonal antibody D665 inducing transient immunosuppression caused increased virus replication and spread in the CNS. In contrast, depletion of Treg using diphtheria toxin (DT) in DEREG (depletion of regulatory T cells)-mice induced an increase of virus-specific CTLs in the brain and caused a reduction of the persistent infection. These data indicate that Treg have the capacity to control MV persistence in the CNS which recommend them to be considered as a strategy to combat human MV CNS diseases. Previous studies in our group also showed an anti-MV activity of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), an IFN-y inducible enzyme, which was confirmed in this work using IDO knock-out mice resulting in increased decease after intracerebral infection and enhanced persistent CNS infection in surviving animals compared to wild type mice.