La maladie de Paget est caractérisée par un remodelage osseux anarchique débutant par une phase de résorption excessive suivie d’une phase de formation désordonnée. Comme les ostéoclastes sont recrutés en plus grand nombre et sont hyperactifs aux sites affectés par la maladie, cette cellule a été incriminée dans ce désordre osseux. Le phénotype de l’ostéoclaste pagétique comporte de plus un défaut du processus autophagique, de même qu'une résistance à l'apoptose, dont les mécanismes restent mal connus. Certains facteurs génétiques et environnementaux contribuent en partie au phénotype, mais d'autres facteurs pourraient y être associés. Des travaux du laboratoire ont mis en évidence six événements de l’épissage alternatif associés à la maladie de Paget. Parmi les gènes identifiés, le gène TBC1D25 et ses deux isoformes connus n’ont jamais été étudiés dans l’ostéoclaste. Le gène TBC1D25 possède un domaine hautement conservé TBC régulant l’activité des petites GTPases Rabs dans le transport vésiculaire et un domaine LIR liant la protéine LC3 durant le processus de l’autophagie. Ces domaines fonctionnels se retrouvent seulement dans l’isoforme long. L’hypothèse de recherche est que l’altération de l’épissage alternatif du gène TBC1D25 dans les ostéoclastes pagétiques explique en partie le phénotype de la cellule. Le changement dans le ratio de l’expression des isoformes affecterait le processus de l’autophagie, en plus d’affecter la principale fonction de l’ostéoclaste, la résorption osseuse. L’objectif principal de l’étude est de caractériser l’expression et la fonction de TBC1D25 dans les ostéoclastes humains. Des ostéoclastes humains différenciés à partir de monocytes fœtaux ont été utilisés pour l’étude de la fonction de TBC1D25 dans l’autophagie, l’apoptose et la résorption osseuse. Les travaux ont permis de localiser les protéines dans l’ostéoclaste dans des conditions maintenant un niveau basal de l’autophagie et dans des conditions induisant l’autophagie. L’interaction entre TBC1D25 et Rab34 a été confirmée pour la première fois dans les ostéoclastes. De plus, une variation de cette interaction a été observée dans les différentes conditions modulant le niveau d’induction de l'autophagie. Les résultats préliminaires montrent une augmentation du ratio LC3II/LC3I lors de la diminution de l’expression de TBC1D25 dans des conditions augmentant l’induction de l'autophagie. Par contre, aucun effet a été observé sur la résorption osseuse ou sur l'apoptose lors de la diminution de l’expression de TBC1D25. En conclusion, les résultats préliminaires montrent que TBC1D25 préviendrait l’augmentation du ratio LC3II/LC3I dans l’ostéoclaste soit en inhibant l’induction de l’autophagie ou en favorisant la dégradation des autophagosomes par l’entremise de son action sur Rab34. / Abstract : Paget’s disease of bone (PDB) is characterized by increases in bone turnover starting with excessive resorption followed by disorganized bone formation. Because the initial phase of PDB involves excessive bone resorption, osteoclasts have been identified as the cells primarily affected in PDB. Pagetic osteoclasts are overactive, resistant to apoptosis and exhibit defects in autophagy, but the mechanisms involved are still unclear. While genetic and environmental factors associated with PDB may partially account for the osteoclast phenotype, other genetic contributors have been identified. Recent work from our laboratory has identified six alternative splicing events associated with PDB. Among those genes, TBC1D25 and its two known isoforms have never been studied in osteoclasts. The two functional domains of TBC1D25 (TBC and LIR) are only present in the long isoform. The highly conserved TBC domain regulates small Rab GTPases in vesicular transport and the LIR domain interacts with LC3 during autophagy. Our research hypothesis is that altered alternative splicing of TBC1D25 in pagetic osteoclasts could contribute to phenotype. Differential isoform expression could affect osteoclast autophagy and bone resorption. The aim of the study is to characterize the expression and function of TBC1D25 proteins in human osteoclasts. Osteoclasts differentiated from cord blood monocytes were used to investigate the function of TBC1D25 in autophagy, apoptosis and bone resorption. First, the localization of the protein has been characterized in conditions maintaining basal autophagy and in rapamycin-induced autophagy. Interactions between TBC1D25 and Rab34 have been observed for the first time in osteoclasts. Moreover, changes in the interaction were observed with autophagy induction. Preliminary results suggest increases in LC3II/LC3I ratio with decreasing TBC1D25 expression when autophagy induction is stimulated. On the other hand, preliminary results showed that decreased expression of TBC1D25 did not affect bone resorption, nor apoptosis. In conclusion, preliminary results show that in osteoclasts, TBC1D25 could prevent the increase of LC3II/LC3I ratio by inhibiting autophagy induction or by promoting the clearance of autophagosomes through its action on Rab34.

L’autophagie est un processus de dégradation et de recyclage des composés cellulaires. Ce mécanisme est nécessaire que ce soit à l’état basal pour éliminer des agrégats protéiques ou des organites endommagés ou en condition de stress, tels que la carence nutritionnelle, l’hypoxie ou encore des traitements anticancéreux. De ce fait, l’autophagie est un processus essentiel à la survie ainsi qu’au maintien de l’homéostasie cellulaire. Connaître les joueurs et comprendre les mécanismes de régulation de l’autophagie sont donc importants. Les GTPases RABs sont des régulateurs importants de ce processus. Celles-ci agissent comme des interrupteurs moléculaires permettant d’exécuter rapidement des fonctions dans la cellule. Les RABs sont activées par des Guanine Nucleotide Exchange Factors (GEF) alors que les GTPase Activating Proteins (GAP) accélèrent la désactivation de la RAB. RAB21 est essentielle dans les étapes tardives de l’autophagie. En effet, RAB21 est activée par la carence nutritionnelle, via sa GEF MTMTR13, et permet le trafic d’une SNARE requise pour le flux autophagique. Lors d’une carence prolongée, l’activité de RAB21 diminue rapidement, suggérant ainsi le rôle d’une GAP dans cette régulation négative. Toutefois, aucune GAP pour RAB21 n’a été identifiée jusqu’à maintenant. Un criblage génétique chez la drosophile a permis d’identifier quelques candidats. Suite à des essais d’interactions protéiques, il s’est avéré que seule la GAP TBC1D25 interagissait avec RAB21. De plus, cette interaction est augmentée en fonction de la carence nutritionnelle. Des immunofluorescences par microscopie confocale ont révélé que l’interaction RAB21-TBC1D25 était située en partie au niveau des endosomes précoces. Par ailleurs, une activation prolongée de RAB5, située sur les endosomes précoces, inhibe l’interaction RAB21-TBC1D25. De plus amples expériences devront être réalisées afin d’expliquer ces résultats. Dans un autre ordre d’idée, RAB21 est surexprimée dans les cellules ayant un flux autophagique élevé ainsi que dans certaines tumeurs de cancer du côlon (données non publiées du laboratoire). L’expression de Tbc1d25 dans ces mêmes tumeurs ne semble pas augmentée, indiquant que TBC1D25 pourrait être un inhibiteur autophagique spécifique aux cellules ayant un flux autophagique élevé. À la lumière des résultats obtenus, TBC1D25 semble être une GAP pour RAB21 qui permet sa régulation négative suivant l’activation de l’autophagie induite par la carence nutritionnelle. / Abstract : Autophagy is defined as the lysosomal degradation and recycling of cellular constituents. At basal levels, autophagy eliminates protein aggregates or damaged organelles. In condition of stress, such as in condition of nutritional deficiency, hypoxia or cancer treatments, autophagy allow cells to adapt and survive. Therefore, autophagy is an essential system required for survival and maintenance of cellular homeostasis. It is thus essential to identify the cellular entities and mechanisms regulating this process. RAB GTPases were identified as master regulators of autophagy. These particular proteins act as molecular switches for the rapid execution of cellular responses. RABs are activated by Guanine Nucleotide Exchange Factors (GEF) whereas GTPase Activating Proteins (GAP) accelerates RAB deactivation. RAB21 is essential in the late stages of autophagy. Indeed, RAB21 is activated by nutritional deficiency, via its GEF MTMTR13, to allow trafficking of a SNARE required for autophagic flux. During starvation, RAB21 is deactivated which suggest that a GAP could negatively regulate RAB21 activity. However, to date no GAP for RAB21 has been identified. An eye modifier genetic screen in Drosophila was performed to identify potential RAB21 GAPs and some candidates were identified. As a result of this screen, the GAP TBC1D25 was identified as interacting with RAB21. Moreover, this interaction was increased by starvation. Proximity ligation assays revealed that the RAB21-TBC1D25 interaction partially localized at early endosomes. Moreover, prolonged activation of RAB5, located at early endosomes, inhibited RAB21-TBC1D25 interaction. Further experiments will be carried out to explain these results. With respect to the roles of autophagy in cancer, RAB21 was shown to be overexpressed in cells with high autophagic flux as well as in some colon cancer tumors. Importantly, the expression of Tbc1d25 in these same tumors does not appear to be increased, indicating that TBC1D25 could be an autophagic inhibitor specific to cells with a high autophagic flow. My work suggests that TBC1D25 could function as a GAP to negatively regulate RAB21 activity in condition of prolonged starvation.