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Identifizierung und Charakterisierung eines neuen Clusters von T-Zell-Rezeptor Delta-RekombinationselementenWanzeck, Jens 11 August 2005 (has links)
Es konnte ein neuer Cluster von insgesamt sieben T-Zell-Rezeptor delta-Rekombinationselementen (deltaRec2.1-2.7), welcher sich innerhalb des TCRD-Gens, 2,6-5,2 kb strangabwärts des variablen Gensegments Vdelta2, befindet. Gezeigt wurde, dass diese isolierten recombination signal sequences sowohl mit Ddelta3- als auch mit Jdelta1-Segmenten des TCRD-Gens und pseudo joining-Gensegmenten des TCRA-Gens rearrangiert werden. Rearrangements, die deltaRec2-Elemente enthielten, wurden in allen zehn Proben peripherer Leukozyten gesunder Spender gefunden, obwohl sie hundertfach seltener sind als klassische deltaRec-Rearrangements. Die absolute Frequenz der deltaRec2-Rearrangements in PB-T-Zellen war, verglichen mit der in Thymozyten, niedriger, was nahe legt, dass sie während der T-Zell-Entwicklung deletiert werden. Am auffälligsten war das Verschwinden von deltaRec2-Ddelta3-Umlagerungen, deren Häufigkeit in PB-T-Zellen elffach niedriger als in Thymozyten war. Die überwiegende Mehrheit der deltaRec2-Jdelta1-Rearrangements enthielt das Ddelta3-Element an der Verknüpfungsstelle. Dies bedeutet, dass sie sich aus deltaRec2-Ddelta3-Rearrangements entwickelt haben könnten. Im Gegensatz dazu steht, dass die Mehrheit der deltaRec2-pseudoJalpha–Umlagerungen kein Ddelta3-Segment enthielt, was vermutlich daher rührt, dass sie direkte Rearrangements darstellen. Die Umlagerungen deltaRec2-Jdelta1 und deltaRec2-pseudoJalpha scheinen T-Zell-spezifisch zu sein, deltaRec2-Ddelta3-Rearrangements hingegen wurden auch in B-Lymphozyten und NK-Zellen in geringer Zahl nachgewiesen. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass deltaRec2-Rearrangements wahrscheinlich vorübergehende Schritte des Rekombinationsprozesses des TCRAD-Lokus sind und durch nachfolgende Valpha-Jalpha-Rearrangements deletiert werden können. Ähnlich wie die klassischen deltaRec-Umlagerungen, spielen vermutlich auch deltaRec2-Rearrangements eine Rolle auf dem Wege der Differenzierung von T-Lymphozyten hin zur reifen TCRalpha/beta-Zelle. Somit könnten die hier erstmals beschriebenen weiteren Rekombinationselemente in der MRD-Diagnostik maligner lymphatischer Erkrankungen die bisher genutzten Rearrangements ergänzen und ebenso als Verlaufsmarker genutzt werden. / A new cluster of 7 T-cell receptor delta recombining elements (deltaRec2.1-2.7) located within the T-cell receptor delta (TCRD) gene, 2.6-5.2 kb downstream from the variable region (Vdelta2) gene segment could be identified. The deltaRec2 elements are isolated recombination signal sequences to rearrange with the Ddelta3, Jdelta1 segments of the TCRD gene as well as with the pseudo joining segment of the TCRA gene. Rearrangements involving the deltaRec2 elements were found in all peripheral blood (PB) samples from 10 healthy individuals, although their frequency was about 100-fold lower than classical deltaRec rearrangements. Compared with thymocytes, the total frequency of deltaRec2 rearrangements was lower in PB T-cells, suggesting that they are deleted during T-cell development. The decrease in frequency of the deltaRec2-Ddelta3 rearrangements was most prominent: 11 times lower in PB T lymphocytes than in thymocytes. Since the deltaRec2-Jdelta1 rearrangements contained the Ddelta3 segment in the junctional region, it could be assumed that they are derived from the deltaRec2-Ddelta3 rearrangements. In contrast, the majority of deltaRec2-pseudoJalpha rearrangements did not contain the Ddelta3 segment, indicating that they are single step rearrangements. The deltaRec2-Jdelta1 and deltaRec2-pseudoJalpha rearrangements seem to be T-lineage specific, but the deltaRec2-Ddelta3 rearrangements were also found at very low frequencies in B-lymphocytes and NK-cells. The results suggest that deltaRec2 rearrangements are transient steps in the recombinatorial process of the TCRAD locus and are probably deleted by subsequent Valpha-Jalpha rearrangements. Similarly to the classical deltaRec rearrangements, also the deltaRec2 rearrangements most likely play a role in T-cell differentiation towards the TCRalpha/beta cell. These recombination elements could also complete the rearrangements used so far as marker in diagnosis of minimal residual disease of malignant lymphatic diseases.
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Analyse de la régulation des réarrangements précoces du TCRδ dans la lymphopoïèse normale et les anomalies oncogéniques associées dans les leucémies aiguës lymphoblastiques TLe Noir, Sandrine 02 October 2012 (has links) (PDF)
La maturation des cellules lymphoïdes T est un processus thymique hautement régulée où se mettent en place de manière ordonnée et successive les réarrangements des loci du TCRδ, γ, β et enfin α. Ceci nécessite des événements de recombinaisons somatiques V(D)J qui font intervenir les protéines RAG1/2, les séquences RSS jouxtant les segments V, D et J et des éléments régulateurs (enhancers) assurant une cis-régulation de ce processus. Le contrôle de la recombinaison V(D)J se fait grâce à divers mécanismes incluant des mécanismes épigénétiques, l'intervention de facteurs de transcription et la conformation/séquence des RSS (la règle 12/23 et la restriction B12/23). Les leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T) sont des proliférations malignes de blastes de phénotype thymique immature. Elles présentent des caractéristiques communes avec les progéniteurs T dont elles dérivent. Les anomalies cytogénétiques les plus fréquentes sont des translocations chromosomiques avec les loci TCRα/δ et TCRβ. La dérégulation, par translocation chromosomique, de nombreux oncogènes, comme le gène à homéodomaine TLX, ont été décrits dans les LAL-T. Les mécanismes moléculaires de ces anomalies, et notamment le rôle joué par la machinerie V(D)J ainsi que les mécanismes moléculaires intimes du blocage de différenciation observé restent cependant peu connus. Les leucémies, TLX1 ou TLX3 positive, se caractérisent par un blocage de maturation au stade cortical. Celui-ci se définit notamment par la présence de réarrangements complets du TCRβ, mais sans réarrangement du TCRα ni expression détectable du récepteur membranaire TCRαβ. Par un système de gène rapporteur, nous avons mis en évidence l'action répressive des protéines à homéodomaines TLX1 et TLX3 sur l'Enhancer Alpha (Eα). Puis l'interaction protéique entre ETS1 et TLX1/3 a été mise en évidence in vivo dans des lignées TLX positives. Enfin, nous montrons le recrutement des protéines TLX1/3, via ETS1, sur l'Eα. De manière intéressante, l'inactivation directe (knock-down par shRNA TLX1) ou indirecte (surexpression d'un TCRαβ exogène) de cette répression a pour conséquence une reprise de la différenciation T suivie d'une mort cellulaire par apoptose. De manière notable, cette apoptose est observé uniquement en condition de culture sur OP9DL1. Les cellules restent ainsi dépendantes du blocage de maturation dont la levée semble incompatible avec leur survie malgré l'accumulation de nombreux évènements oncogéniques. Parallèlement, en analysant les translocations TCRα/δ-TLX1 dans les LAL-T et dans le thymus d'individus sains, nous avons identifié un mécanisme d'auto-sélection clonal par addiction oncogénique. L'étude des translocations TCR-oncogènes sur une série de 280 LAL-T, nous a permis de confirmer la survenue des translocations TCRα/δ-oncogènes dans 19% de cas et TCRβ-oncogènes dans 14% des cas de LAL-T. Ce travail descriptif a permis l'identification de quatre nouveaux oncogènes impliqués dans les translocations TCR dans les LAL-T (LEF1, GNAQ, NKX2.4, IL2RB). Le clonage moléculaire des points de cassure a permis de mettre en évidence une absence d'intervention de la machinerie RAG au niveau de la cassure double brin de l'oncogène, soit une translocation de type 2. De façon intéressante, nous montrons un découplage entre le moment de survenue de la translocation (stade DN) et l'activation de l'oncogène (cortical, pré-αβ). Enfin nous avons mise en évidence un mécanisme de dérégulation oncogénique sensiblement différent en fonction du locus du TCR (α/δ ou β) impliqué dans la translocation. Cette étude descriptive, a permis de pointer l'implication fréquente des segments Dδ2 et Dδ3 dans les translocations chromosomiques et nous a amené à analyser les étapes les plus précoces de la thymopoïèse humaine. Nous avons pu mettre en évidence un ordonnement strict des réarrangements précoces de ce locus : Dδ2-Dδ3 précédant toujours les réarrangements impliquant les segments Jδ1. Le premier réarrangement Dδ2-Dδ3 à s'effectuer est détectable au stade de maturation Early Thymic Precursor ETP (CD34+ /CD1a-/CD7+/dim). De façon importante, nous montrons que le facteur de transcription RUNX1 est directement impliqué dans ce remaniement par sa fixation sur le Dδ2-23RSS et son interaction avec RAG1. Ainsi l'inactivation de RUNX1 dans des CD34+ de sang cordon, cultivés en condition de différenciation T a pour conséquence une absence totale de réarrangement Dδ2-Dδ3. L'ensemble de ces données met bien en évidence le rôle majeur de RUNX1 dans l'ordonnement précoce des réarrangements du TCRδ et pointe pour la première fois que ce locus, comme celui du TCRβ, est contrôlé par la restriction B12/23 chez l'Homme contrairement à ce qui est décrit chez la souris. Au final l'ensemble de ces expériences montre que l'oncogenèse et l'ontogénie T sont étroitement liées et qu'ainsi le blocage du processus de maturation physiologique T est un élément central du processus oncogénique dont les cellules leucémiques restent dépendantes pour leur survie. Ces résultats soulignent le potentiel de l'étude des LAL-T pour une meilleure compréhension de l'ontogénie T et ouvrent des perspectives originales de thérapie ciblée " différenciante ".
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