Die Photodynamische Therapie (PDT) hat sich zunehmend als vielversprechende Methode zur Behandlung von verschiedenen malignen Neubildungen gezeigt. Die photodynamische Zerstörung der Tumore wird erreicht indem zunächst ein Photosensibilisator entweder lokal oder systemisch appliziert wird und im Anschluss an eine gewisse Inkubationszeit die Tumormasse mittels einer Lichtquelle mit einer spezifischen Wellenlänge durchleuchtet wird. Aufgrund der bevorzugten Anreicherung des Photosensibilisators in Tumorzellen, erlaubt diese Methode eine selektive Abtötung des malignen Tumors, während das umliegende Gewebe weitestgehend verschont wird. Diese Eigenschaften und Anforderungen machen die PDT, insbesondere in den Fällen, wo die chirurgische Enukleation als kurative Option erwogen wird, zu einer attraktiven Therapieoption in der Behandlung von Retinoblastomen (Rb). Die extreme Methode der Enukleation wird noch immer angewendet, wenn die Tumoren nicht ausreichend chemosensibel sind, oder wenn sich die Erkrankung aufgrund von unzureichendem Zugang zu medizinischer Versorgung bereits in einem fortgeschrittenen Stadium befindet. In dieser Studie haben wir zunächst In-Vitro-Untersuchungen mit dem neuen kationischen wasserlöslichen Photosensibilisator Tetrahydroporphyrin-Tetratosylat (THPTS) bezüglich seiner photodynamischen Wirkung auf WERI Rb-1 und Y79-Retinoblastomzellen durchgeführt. Dabei konnten wir zeigen, dass weder die Inkubation mit THPTS ohne anschließende Beleuchtung, noch die alleinige Beleuchtung zu einem signifikanten Effekt auf die Proliferation der Rb-Zellen führte. Die Kombination von THPTS mit anschließender Beleuchtung hingegen führte zu einem maximal zytotoxischen Effekt in den Tumorzellen. Darüber hinaus war die Phototoxizität in normalen Primärzellen des Pigmentepithels der Retina geringer, wodurch ein erhöhter phototoxischer Effekt von THPTS in Krebszellen gegenüber diesem normalen Zelltyp der Retina gezeigt werden konnte. Die vorliegenden Ergebnisse bilden eine ermutigende Grundlage für weiterführende in-vivo-Untersuchungen zum therapeutischen Potential dieses vielversprechenden Photosensibilisators mit der Aussicht auf eine potentiell kurative Therapie des Retinoblastoms unter Erhalt von Augapfel und Visus.

Die Photodynamische Therapie (PDT) hat sich zunehmend als vielversprechende Methode zur Behandlung von verschiedenen malignen Neubildungen gezeigt. Die photodynamische Zerstörung der Tumore wird erreicht indem zunächst ein Photosensibilisator entweder lokal oder systemisch appliziert wird und im Anschluss an eine gewisse Inkubationszeit die Tumormasse mittels einer Lichtquelle mit einer spezifischen Wellenlänge durchleuchtet wird. Aufgrund der bevorzugten Anreicherung des Photosensibilisators in Tumorzellen, erlaubt diese Methode eine selektive Abtötung des malignen Tumors, während das umliegende Gewebe weitestgehend verschont wird. Diese Eigenschaften und Anforderungen machen die PDT, insbesondere in den Fällen, wo die chirurgische Enukleation als kurative Option erwogen wird, zu einer attraktiven Therapieoption in der Behandlung von Retinoblastomen (Rb). Die extreme Methode der Enukleation wird noch immer angewendet, wenn die Tumoren nicht ausreichend chemosensibel sind, oder wenn sich die Erkrankung aufgrund von unzureichendem Zugang zu medizinischer Versorgung bereits in einem fortgeschrittenen Stadium befindet. In dieser Studie haben wir zunächst In-Vitro-Untersuchungen mit dem neuen kationischen wasserlöslichen Photosensibilisator Tetrahydroporphyrin-Tetratosylat (THPTS) bezüglich seiner photodynamischen Wirkung auf WERI Rb-1 und Y79-Retinoblastomzellen durchgeführt. Dabei konnten wir zeigen, dass weder die Inkubation mit THPTS ohne anschließende Beleuchtung, noch die alleinige Beleuchtung zu einem signifikanten Effekt auf die Proliferation der Rb-Zellen führte. Die Kombination von THPTS mit anschließender Beleuchtung hingegen führte zu einem maximal zytotoxischen Effekt in den Tumorzellen. Darüber hinaus war die Phototoxizität in normalen Primärzellen des Pigmentepithels der Retina geringer, wodurch ein erhöhter phototoxischer Effekt von THPTS in Krebszellen gegenüber diesem normalen Zelltyp der Retina gezeigt werden konnte. Die vorliegenden Ergebnisse bilden eine ermutigende Grundlage für weiterführende in-vivo-Untersuchungen zum therapeutischen Potential dieses vielversprechenden Photosensibilisators mit der Aussicht auf eine potentiell kurative Therapie des Retinoblastoms unter Erhalt von Augapfel und Visus.:Inhaltsverzeichnis Einleitung 1 Hintergrund und Bedeutung 1 Pathophysiologie 2 Diagnostik und Symptome 3 Klassifizierung 4 Therapie und Prognose 5 Enukleation 5 Perkutane Radiotherapie 6 Brachytherapie 6 Intravenöse Chemotherapie 6 Intraarterielle Chemotherapie 6 Laser-gestützte Verfahren 7 Photodynamische Therapie 7 Mechanismus 7 Eigenschaften von Photosensibilisatoren 8 THPTS-PDT 9 Fragestellung 9 THPTS-PDT on Human Retinoblastoma Cell Lines 11 Zusammenfassung 24 Einleitung 24 Methode 25 Zellkultur primärer humaner Pigmentepithelzellen der Retina (RPE) 25 Photodynamische Therapie von Retinoblastomzellen und RPE-Zellen 25 Clearance von THPTS 25 Real-Time RT-PCR 25 Immunzytochemie und Live-Videoaufnahmen 26 Ergebnisse 26 Effekt der THPTS-PDT auf Retinoblastom-Zelllinien 26 Effekt in Abhängigkeit von Dosis und Einwirkzeit 26 Wirkung der THPTS-PDT auf nicht-maligne Netzhautzellen im Vergleich zu Rb-Zellen 27 Verstoffwechselung von THPTS 27 Genexpression 27 Immunzytochemie und Live-Videoaufnahmen 28 Subzelluläre Anreicherung von THPTS 28 Diskussion 28 ii Literaturverzeichnis vi Anhang x Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit x Wissenschaftliche Publikationen xi

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So far, glioblastomas cannot be cured by standard therapy and have an extremely poor median survival of about 15 months. The photodynamic therapy (PDT) with next generation photosensitizers, reaching a higher therapeutic depth, might offer a new, adjuvant treatment strategy in brain cancer therapy. Here, we investigated the effect of THPTS-PDT combined with ionizing irradiation (IR) on glioblastoma cells in vitro and in vivo. Results: THPTS colocalized to mitochondria and was not found in the nucleus. THPTS (2–20 μg/ml)-PDT significantly reduced the proliferation, metabolic activity and clonogenic survival and induced cell death mainly through apoptosis and autophagy. THPTS-PDT combined with IR decreased the clonogenicity significantly compared to single treatments. THPTS (≤ 300 μg/ml) alone showed no dark toxicity. The maximum therapeutic depth of THPTS-PDT in C6 glioblastomas was 13 mm. Materials and Methods: Three human glioblastoma cell lines (U-87 MG, A-172, DBTRG-05MG) were incubated with THPTS (1–300 μg/ml) 3–24 hours before laser treatment (760 nm, 30 J/cm²). THPTS localization and effects on metabolic activity, proliferation, cell death mechanisms and long-term reproductive survival were assessed. IR was conducted on an X-ray unit (0.813 Gy/min). Results were verified in vivo on a subcutaneous C6 glioblastoma model in Wistar rats. Conclusions: This study demonstrated efficient THPTS-PDT in glioblastoma cells, in vitro and in vivo. The combinatorial effects of THPTS-PDT and IR are of specific clinical interest as enhanced eradication of infiltrating glioblastoma cells in the tumor surrounding tissue might possibly reduce the commonly occurring local relapses.

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Multimodal treatment adding immunotherapy and photodynamic treatment (PDT) to standard therapy might improve the devastating therapeutic outcome of glioblastoma multiforme patients. As a first step, we provide investigations to optimize dendritic cell (DC) vaccination by using PDT and ionizing radiation (IR) to achieve maximal synergistic effects. In vitro experiments were conducted on murine glioblastoma GL261 cells, primary DCs differentiated from bone marrow and T cells, isolated from the spleen. Induction of cell death, reactive oxygen species, and inhibition of proliferation by tetrahydroporphyrin-tetratosylat (THPTS)-PDT and IR were confirmed by WST-1, LDH, ROS, and BrdU assay. Tumor cargo (lysate or cells) for DC load was treated with different combinations of THPTS-PDT, freeze/thaw cycles, and IR and immunogenicity analyzed by induction of T-cell activation. Cellular markers (CD11c, 83, 86, 40, 44, 69, 3, 4, 8, PD-L1) were quantified by flow cytometry. Cytotoxic T-cell response was evaluated by calcein AM assay. Immunogenicity of THPTS-PDT-treated GL261 cells lysate was superior to IR-treated lysate, or treated whole cells proven by increased DC phagocytosis, T-cell adhesion, proliferation, cytolytic activity, and cytokine release. These data strongly support the application of PDT together with IR for optimal immunogenic cell death induction in tumor cell lysate used to pulse DC vaccines.