Mycobacterium tuberculosis infection is one of the leading causes of mortality worldwide. One third of the population is estimated to be infected, however only 5-10% of those individuals can transmit the disease. While T cell immunity initially limits mycobacterium growth, it is unclear why T cell immunity fails to sterilize the infection and prevent subsequent recrudescence. One hypothesis is T cell exhaustion is mediating the failure of T cell immunity late during infection. Here we show the development of T cell exhaustion during chronic infection, and that the inhibitory receptor T cell-immunoglobulin and mucin domain containing 3 (TIM3) mediates the development of T cell exhaustion. TIM3 accumulates on the surface of T cells throughout the course of infection and there is a subsequent decrease in effector cytokine production, such as IL-2, TNFα, and IFNγ. Furthermore, antibody blockade of TIM3 restores T cell function and improves bacterial control. Our results show that TIM3 is mediating T cell exhaustion during chronic TB infection and leading to suboptimal bacterial control.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第22341号 / 医博第4582号 / 新制||医||1042(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 髙折 晃史, 教授 羽賀 博典, 教授 伊藤 貴浩 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Immunotherapy, especially the adoptive transfer of T cells and immune checkpoint blockade therapy, have revolutionized cancer therapy. In particular, utilizing antigen-specific T cells for adoptive cell therapy has enabled the development of specific and effective strategies. It has paved the way for developing more accurate and personalized cancer immunotherapies. Adoptive cell therapy (ACT) results depend on the characteristics of ex vivo expanded T cells, such as their differentiation and clonal diversity. However, ex vivo expanded specific T cells often express several inhibitory receptors involved in T-cell exhaustion and markers of terminal effector differentiation. Accordingly, we hypothesized that blocking one or several inhibitory receptors during the ex vivo expansion could improve the expansion and differentiation of antigen-specific T cells. Preconditioning the ACT products and combinatorial immunotherapy approaches are newly developed concepts in cancer therapy to optimize cancer immunotherapy for a larger group of patients. To study the development of antigen-specific T-cells in combination with checkpoint blockade, we have adopted a method that allows the expansion of rare antigen-specific T cell precursors from PBMCs via multiple stimulations, using antigen-pulsed dendritic cells. In the current study, we utilized our protocol to generate and expand antigen-specific CD8+ T cells targeting the oncogenic Epstein-Barr virus (EBV)-LMP2 and a tumor-associated antigen (TAA) from the Wilms Tumor 1 (WT1) protein. We employed two approaches to abolish the negative regulatory receptors, antibody-mediated blockade and deletion via CRISPR/Cas9. We evaluated the impact of checkpoint blockade on antigen-specific T cells development, proliferation, and function. Additionally, TCR clonality and transcriptomic changes were assessed by genomic studies, including single-cell RNA (scRNA) sequencing and T-cell receptor sequencing. Supporting our hypothesis, we observed that blocking both PD-L1 and TIM3 (not any of them alone) significantly enhanced LMP2 and WT1-specific T cell generation and expansion. Additionally, checkpoint blockade resulted in higher specific T cell function, including cytokine production and in vitro targeted cytotoxicity. Using scRNA-seq and TCR sequencing approaches, we first remarked that the specific T cells are highly oligoclonal and identified a few dominant shared clones between donors. Immune checkpoint blockade did not confer consistent transcriptional signatures but may have a clonotype and donor-specific impact on the expression of activation and exhaustion-related genes. Overall, immune checkpoint blockade did not markedly alter the clonal composition of the T-cell product. We also evaluated the impact of CD5 deletion in antigen-specific T cell priming and expansion as an inhibitory receptor and a part of the immune response synapse. However, in a human ACT setting, our data show that the CRISPR/Cas9 mediated CD5 deletion only has modest effects on antigen-specific T-cell generation. However, future combinations with the blockade of other immune checkpoint may be warranted. Conclusion We demonstrated that blocking PD-L1 and TIM3 during the ex vivo expansion improves antigen-specific T-cell yield. We show that blocking multiple checkpoints can synergistically optimize specific T-cell production without compromising the response's specificity. It is a rapidly implementable strategy to enhance the number and quality of ex vivo expanded antigen-specific T cells for immunotherapy. / Le transfert adoptif de cellules T et le traitement par le blocage des points de contrôle immunologiques ont révolutionné le traitement du cancer. En particulier, l'utilisation de cellules T antigène-spécifiques en thérapie cellulaire adoptive a facilité le développement d'immunothérapies anticancéreuses plus précises et personnalisées. Les résultats de la thérapie cellulaire adoptive (TCA) sont liés à la qualité des cellules T spécifiques expansées ex vivo, telles que leur état de différenciation et leur diversité clonale. Cependant, le pré-conditionnement des produits de thérapie cellulaire adoptive et les traitements d'immunothérapie combinatoire sont de nouveaux concepts en développement de la thérapie du cancer pour optimiser l'immunothérapie du cancer dans un plus grand groupe de patients. Nous avons formulé l’hypothèse que le blocage d'un ou plusieurs récepteurs inhibiteurs au cours de l'expansion ex vivo favorise une meilleure expansion et une meilleure fonction des cellules T destinées à la TCA. Pour étudier l’expansion et la différenciation de cellules T antigène-spécifiques lors d’un blocage des points de contrôle, nous avons adopté une méthode qui nous permet de stimuler et expanser de rares cellules T antigène-spécifiques à partir de cellules mononuclées du sang périphérique (PBMCs) via de multiples stimulations utilisant des cellules dendritiques chargées avec l’antigène d’intérêt. Nous avons utilisé deux approches pour supprimer l’activité des récepteurs régulateurs négatifs, les anticorps bloquants des points de contrôle et la délétion génique via CRISPR/Cas9. Nous démontrons que le blocage combiné de PD-L1 et TIM3 améliore considérablement la l'expansion de cellules T CD8+ spécifiques à des antigènes viraux et tumoraux. De plus, le blocage des points de contrôle a entraîné la génération de cellules T spécifiques fonctionelles tel que démontré par la production de cytokines et la cytotoxicité in vitro. En utilisant de séquençage de l'ARN en cellule unique (scRNA-seq) et de séquençage des récepteurs des lymphocytes T (TCP-seq), nous avons remarqué que les cellules T spécifiques sont très fortment oligoclonales. Nous avons également identifié quelques clones dominants partagés entre les donneurs. L’application de l’inhibition des points de controles ne confère pas de signatures transcriptionelles particulières mais pourrait affecter certains clones provenant de certains donneurs davantage que d’autres. De plus, le peu de changements dans la composition clonale des cellules expandues suggèrent que le blocage de ces points de contrôle immunologiques n’altère pas de façon significative le produit cellulaire obtenu. Des données récentes soutiennent également un rôle du CD5 dans la régulation de l'activation des cellules T naïves et leur état fonctionnel. Cependant, dans un contexte compatible avec la TCA, nos données montrent que la suppression de CD5 via CRISPR/Cas9 n'a que des effets modestes sur la génération de cellules T antigène-spécifiques. Par contre, la combinaison éventuelle avec l’inhibition de d’autres points de contrôle immunologiques pourrait être envisagée. En conclusion, nos travaux fournissent une nouvelle méthode pour générer des cellules T spécifiques pour la TCA et la caractérisation à plus haute résolution de cellules T spécifiques expansées ex vivo. Nous avons donc démontré que le blocage combiné de plusieurs points de contrôle peut optimiser de manière synergique la production de cellules T spécifiques sans compromettre la spécificité de la réponse. Il s'agit là d'une stratégie rapidement applicable pour améliorer le nombre et la qualité des cellules T antigène-spécifiques expansées ex vivo pour l'immunothérapie.