Le Lupus est une maladie systémique auto-immune complexe, caractérisée notamment par la perte de tolérance vis-à-vis d’antigènes nucléaires, qui affecte majoritairement les femmes à l’âge adulte. Cette maladie est hétérogène tant du point de vue clinique que génétique, ce qui a considérablement limité les progrès dans la compréhension de sa pathogénèse. Dans ce projet, nous avons mis à profit la technologie de séquençage de nouvelle génération de type « Whole Exome Sequencing (WES)» pour explorer la génétique du Lupus à l’échelle de familles individuelles. De plus, nous avons centré notre étude sur des formes à début pédiatrique qui sont cliniquement plus sévères que les formes adultes. Nous avons fait l’hypothèse que ce sous-groupe de patients devrait être enrichi en formes monogéniques. Nous avons ainsi inclus dans cette étude des cas familiaux de lupus ou des familles dans lesquelles il existait un patient lupique et des apparentés atteints de pathologies auto-immunes. Un séquençage WES a été réalisé dans ces familles et la validation des gènes identifiés par cette stratégie a fait l’objet de ce travail. Nous avons découvert une mutation hétérozygote gain de fonction du gène TMEM173 qui code STING, un adaptateur clé dans la signalisation de la détection des ADNs cytosoliques et la production d’interféron de type-I (IFN-I). Quatre membres de cette famille porteurs de la mutation présentent une pathologie auto-inflammatoire et auto-immune, dont un cas de Lupus, avec une expression clinique hautement variable. Une modélisation structurale in silico de la forme mutée prédisait initialement une stabilisation de la forme dimérique de STING avec pour conséquence possible une activation constitutive. En accord avec ces données, nous avons montré, en absence du ligand naturel, une activité constitutive de la forme mutée de STING exprimée dans une lignée cellulaire, ainsi qu’une localisation spontanée dans l’appareil de Golgi des fibroblastes de patients indiquant un état activé. Corrélativement, nous avons observé une concentration sérique élevée d’IFNa chez les patients ainsi qu’une signature transcriptionnelle fortement augmentée d’un panel de gènes induits par les IFN-I. A la suite de cette découverte, nous avons identifié de nouvelles mutations activatrices de STING chez des patients atteints de pathologies vasculaires et de fibroses pulmonaires sévères en relation avec un syndrome inflammatoire, et deux patients ont pu recevoir un traitement ciblant l’inhibition de la voie des IFN-I. Ce travail a permis de mettre en lumière le rôle clé de STING dans l’homéostasie du système immunitaire chez l’homme et de mieux comprendre la physiopathologie de maladies inflammatoires et auto-immunes, motivant la mise en place d’un traitement spécifique chez les patients. Au-delà de cette découverte importante pour ces malades, ce travail suggère que des variants rares et délétères permettent de décrire les causes génétiques de maladies auto-immunes dites complexes. / Lupus is a complex systemic autoimmune disease characterized by a loss of tolerance to nuclear antigens predominantly afflicting women of childbearing age. The disease is both clinically and genetically heterogeneous and this has greatly limited progress in understanding disease pathogenesis. In this project, we utilize next generation sequencing technology such as “Whole Exome Sequencing (WES)” to explore the genetics of lupus at the level of individual families. Furthermore, we focused on a rare subgroup of lupus patients, which develop the disease in childhood and usually present with a more severe clinical phenotype compared to the adult-onset form. We hypothesized that this subgroup would be enriched for monogenic forms of the disease. Thus, we recruited several families with early-onset in the proband and at least one other familial member presenting with lupus or associated autoimmune disease. WES was performed and the validation of the gene identified by this strategy is described. We identified a familial gain of function dominant mutation in TMEM173, encoding STING, a key adaptor molecule in the cytosolic DNA sensing pathway and Type-I interferon (IFN-I) production. The four affected family members demonstrate a systemic inflammatory and autoimmune condition, including lupus, with variable clinical expression. Structural modeling initially predicted a stabilized dimerization of the mutant STING and thereby a constitutive activation. In agreement with this, we found that the STING mutant spontaneously localizes in the Golgi of patient fibroblasts, and is constitutively active in the absence of its ligand in vitro. Accordingly, we observed elevated serum interferon activity and a IFN-I signature in peripheral blood. We have also identified several other patients with activating STING mutations presenting with vascular inflammation and or pulmonary fibrosis, and two patients received a treatment targeting the IFN-I signaling pathway. This discovery highlights the key role of STING in human immune homeostasis and its implication in severe inflammatory and autoimmune diseases, leading to new and more specific therapeutical approaches. Beyond these important findings with regards to patients, this work suggests that rare deleterious variants can describe the genetic cause of autoimmune pathologies previously defined as complex diseases.

Les interférons de type I (IFN I) sont des cytokines antivirales aux propriétés puissantes. L’induction, la transmission et la résolution de la réponse immunitaire engendrée par les IFN I est minutieusement régulée. Le concept d’interféronopathie de type I, récemment individualisé par notre équipe, repose sur l’hypothèse que certaines pathologies seraient secondaires au déséquilibre de ces voies de signalisation complexes et à la sécrétion excessive et inappropriée d’IFN I. L’inhibition de celle-ci par des thérapeutiques ciblées permettrait de valider cette hypothèse, si les symptômes allégués s’amélioraient, voire disparaissaient. Ce travail de thèse s’est initialement concentré sur la caractérisation clinique et biologique des interféronopathies monogéniques et polygéniques, et secondairement sur l’identification moléculaire de nouvelles mutations du gène TMEM173 à l’origine de l’interféronopathie liée à STING, également appelée SAVI (STING associated vasculopathy with onset in infancy), syndrome auto-inflammatoire associant une atteinte sévère cutanée et pulmonaire. De nouvelles techniques ont permis la sélection de patients présentant une augmentation de l’IFN I en comparaison à des contrôles sains : la signature IFN I, qPCR de 6 gènes stimulés par l’IFN (IFN stimulated genes – ISGs) et le dosage d’IFN alpha sérique ou plasmatique par méthode du SIMOA (single molecule array) permettant la détection de molécules d’IFN de l’ordre du femtogramme (10-18g). Ces méthodes nous ont ainsi permis d’élargir le spectre clinique phénotypique des interféronopathies de type I, initialement considéré comme essentiellement neurologique. Les patients atteints du syndrome d’Aicardi-Goutières, première interféronopathie monogénique décrite, présentaient les signes suivants : dystonie, spasticité, décalage des acquisitions, calcifications intra-cérébrales et anomalies de la substance blanche. Cependant, l’utilisation systématique de nos méthodes de criblage associée à l’avènement des technologies de séquençage à haut débit (next generation sequencing – NGS) a permis de révéler un phénotype plus large, caractéristique des interféronopathies de type I : sur le plan cutané (engelures, vascularite nécrosante des extrémités, sclérodermie), pulmonaire (pneumopathie interstitielle isolée ou non), musculo-squelettique (arthralgies, arthrites, arthropathie de Jaccoud, myalgies et myosites), ophtalmologique (glaucome), néphrologique (néphropathies lupiques), gastro-entérologique (maladies inflammatoires chroniques intestinales précoces), associées à de l’auto-immunité ou un déficit immunitaire inconstants. Notre méthode de sélection nous a notamment permis d’identifier des patients présentant de manière variable des signes cardinaux de SAVI et une de trois nouvelles mutations activatrices dans une région spécifique du gène TMEM173 (codant pour STING). Ces mutations circonscrivent une région de la protéine à ce jour encore jamais impliquée dans le contrôle de la voie de l’IFN I. STING est une protéine du réticulum endoplasmique qui agit comme adaptateur cytosolique de senseurs intracellulaires d’ADN viral dans une voie de signalisation de l’IFN I. STING active TBK1 (TANK-binding kinase) et permet la transcription des IFN I par la phosphorylation d’IRF3. La Janus Kinase 1 (JAK1) et la tyrosine kinase 2 (TYK2) sont activées suite à la stimulation des récepteurs de l’IFN I et phosphorylent les facteurs de transcription STAT1 et STAT2, conduisant à l’expression de nombreux ISGs. Les analyses génétiques, de conformation tridimensionnelle, sur un modèle cellulaire in vitro (HEK293T) et ex vivo sur cellules mononuclées périphériques des patients nous ont ainsi permis de mettre en évidence pour ces mutations un caractère constitutionnellement activé, indépendant de la liaison au ligand cGAMP, mais transmettant ce signal à travers la voie d’aval par TBK1. (...) / Type I interferons (IFN I) are antiviral cytokines with potent properties. Hence, the induction, transmission and resolution of the immune response generated by IFN I is tightly regulated. The concept of the type I interferonopathies, recently formulated by our team, rests on the assumption that some diseases arise from a disturbance of this complex signalling pathway, leading to excessive and inappropriate IFN I secretion. On this basis, targeted therapeutics should improve or cure features of such type I interferonopathies, thereby providing a validation of the underlying hypothesis. This PhD project initially focused on the clinical and biological characterisation of monogenic and polygenic interferonopathies, and secondarily on the molecular identification of novel mutations in the gene TMEM173 causing the interferonopathy called STING associated vasculopathy with onset in infancy (SAVI), an auto-inflammatory syndrome with severe cutaneous and pulmonary features. Our selection of patients in comparison to healthy controls was made possible through the use of novel screening tools: IFN signature (qPCR of 6 IFN stimulated genes – ISGs), and measurement of IFN alpha protein levels in serum or plasma (SIMOA-single molecule array - enabling the detection of molecules of IFN in the femtogram [10-18g]) range. In this way, we have been able to expand the phenotypic spectrum of the interferonopathies, which was initially considered as primarily neurological. Patients with Aicardi-Goutières syndrome (AGS), the first described of the monogenic interferonopathies, exhibit dystonia, spasticity, developmental delay, intra-cranial calcifications and white matter abnormalities. However, the systematic use of our interferon screening assays, plus the advent of next-generation sequencing technology, has revealed a much broader set of features relevant to this novel disease grouping – involving the skin (chilblains, necrotising vasculitis, scleroderma), lungs (isolated lung interstitial disease or associated with other signs), musculoskeletal system (joint pain, arthritis, Jaccoud’s arthropathy, muscle pain and myositis), eyes (glaucoma), kidneys (lupus nephritis) and gastro-intestinal tract (early inflammatory bowel disease), as well features of autoimmunity and immunodeficiency. Using our screening assays enabled us to identify three patients variably exhibiting the core features of SAVI, all of whom were found to harbour distinct novel activating mutations in STING. These mutations highlight a protein domain not previously implicated in the control of IFN I signalling. STING is an endoplasmic reticulum protein, acting as a cytosolic adaptor of intracellular sensors of viral DNA in the type I IFN signalling pathway. STING activates TANK-binding kinase (TBK1), allowing transcription of IFN I through phosphorylation of IRF3. Janus kinase 1 (JAK1) and tyrosine kinase 2 (TYK2) are activated following stimulation of the IFN I receptor, leading to phosphorylation of the transcription factors STAT1 and STAT2 and the subsequent induction of a large number of ISGs. Genetic analysis, conformational studies, an in vitro cellular model (HEK293T) and ex vivo experimental data (using patient peripheral blood mononuclear cells - PBMCs) enabled us to confirm the constitutive activating nature of these variants, and show that this activation did not require binding with cGAMP, but was dependent on signalling through TBK1. Ruxolitinib, a JAK1/2 inhibitor, could antagonise this constitutive activation ex vivo. These results indicate a promising therapeutic approach in such patients, and more widely in the monogenic, and perhaps even, polygenic, interferonopathy context.