Cryphonectria parasitica is the causal agent of chestnut blight, which devastated the American Chestnut tree population in the early 20th century. The discovery of hypoviruses that reduce the severity of the chestnut blight infection offers the potential for biological control. However, the spread of the hypoviruses is hampered by a diverse genetically controlled nonself-recognition system, vegetative incompatibility (vic). CPVIB-1 was identified as a transcription regulator playing an important role in the programmed cell death response to this stimulus. In this study, we have found that CPVIB-1 is ubiquitin-decorated which might lead to its degradation in the proteasome pathway. RNA-Seq and ChIP-Seq were used to further explore the downstream targets of CPVIB-1 that mediate the various metabolic changes that lead to the altered phenotype of the Δcpvib-1 mutant. Due to inaccuracies in the prior annotation, we performed a genome re-annotation to improve the accuracy using a MAKER2-two-pass pipeline. To validate the improvement a second pipeline, PEPA, was developed to compare quality metrics between the old and new annotations. Approximately 1/3 of the original annotations from 2009 were found to be inaccurate. Experimental confirmation by testing 27 predicted genes using a diagnostic PCR protocol to differentiate between prior and new transcript structures showed that over 80 % of tested genome locations supported for the new annotation. Using rapamycin treatment to mimic stimulation of the vic response and applying the RNA-seq and ChIP-seq data to this new information, we found that CPVIB-1 is related to TOR signaling pathways, promoting autophagy and the proteasome pathway, but repressing carbon metabolism, protein and lipid biosynthesis. In depth analysis of CPVIB-1-bound DNA targets showed that this protein is a member of the GAGA regulator family, a group of multifaceted transcription factors with diverse roles in gene activation and repression, maintenance of mitosis, and cell development. Following treatment with rapamycin the recognition sequence bound by CPBVIB-1 was altered leading to the regulation of different suite of genes with diverse metabolic functions. Ultimately, we have developed a revised model of TOR signaling pathway where TORC1 and TORC2 signaling pathways are connected by the action of CPVIB1.

La réinitiation de la traduction est un mécanisme permettant de traduire des ORF qui sont présents dans la région leader de différents ARNm cellulaires (uORF). La majorité des cas de réinitiation de la traduction chez les eucaryotes concerne des uORF de petite taille. Des stratégies alternatives ont été développées, entre autres par les virus, afin de réinitier la traduction après un long uORF. Le virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) exprime un ARNm polycistronique codant la totalité des protéines virales. L’une d’entre elle, la protéine TAV (TransActivateur/Viroplasmine) est un facteur essentiel qui rend possible la réinitiation de la traduction après de longs ORF et qui, de plus, active la protéine kinase TOR. La sous-unité h du facteur d’initiation de la traduction eIF3, requise pour promouvoir la reinitiation après un petit ORF chez les plantes, a été identifiée comme étant une nouvelle cible de phosphorylation de la voie de signalisation de TOR. L’objectif principal de ma thèse a été d’élucider la fonction de la protéine eIF3h dans la réinitiation après un petit ORF ainsi que dans la réinitiation de la traduction, assurée par TAV, après un long ORF. Nous avons exploité les lignées transgéniques eif3h-1 d’Arabidopsis exprimant la protéine eif3h tronquée de son extrémité C-terminale, qui sont déficientes pour la réinitiation mais pas pour l’initiation de la traduction. Nous avons montré que la phosphorylation de eIF3h est essentielle pour stabiliser eIF3 au niveau des ribosomes durant l’élongation, ce qui favorise la ré-acquisition par le ribosome de facteurs nécessaires à la réinitiation de la traduction, et que la délétion de sa région Ct abolit son intégration dans le complexe eIF3. De plus, nous avons montré que eIF3h, la cible de la voie de signalisation de TOR, interagit avec S6K1. Des protoplastes préparés à partir des plantes mutantes eif3h-1 sont incapables de promouvoir la réinitiation après de longs ORF en présence de TAV. La surexpression de eIF3h, indifféremment de son état de phosphorylation, est indispensable pour restaurer la reinitiation assurée par TAV dans les protoplastes eif3h-1. Par ailleurs, les plantes eif3h-1 déficientes dans la réinitiation, sont résistantes à l’infection par le CaMV démontrant l’importance de eIF3h pour la réplication du CaMV. En revanche, ces plantes eif3h-1 peuvent être infectées par d’autres virus dont la traduction de l’ARN génomique est coiffe- ou IRES-dépendante. Ainsi, nos résultats suggèrent que eIF3h est un facteur de reinitiation important aussi bien pour la reinitiation après un petit qu’après un long ORF (controlée par TAV), et que TAV exploite cette machinerie cellulaire, et plus particulièrement TOR et eIF3h, pour exprimer ses propres protéines par réinitiation de la traduction. / Translation of mRNAs that harbor upstream open reading frames (uORFs) within their leader regions operates via a reinitiation mechanism. In plants, reinitiation is up regulated by the target of rapamycin (TOR) signaling via phosphorylation of the subunit h of initiation factor 3 (eIF3). The eif3h-1 mutant expressing the C-terminally truncated eIF3h while maintaining high translation initiation efficiency is not active in reinitiation. Cauliflower mosaic virus (CaMV) pregenomic polycistronic RNA is translated via an exceptional mechanism of reinitiation after long ORF translation under control of CaMV protein TAV, which ensures activation of TOR. To find the link between underlying mechanisms, we examined eIF3h function in cellular and viral context. Here we show that eIF3h, if phosphorylated, has a role in recruitment of eIF3 into actively translating ribosomes that is a prerequisite for formation of reinitiation-competent ribosomal complexes. C-terminal truncation of eIF3h abolished its integration into the eIF3 complex and eIF3 loading on polysomes as manifested by the eIF3 core subunit c. We also show that eIF3h as a putative target of TOR/S6K1 binds S6K1 in vitro. eIF3h phosphorylation is not required for eIF3 complex formation. We demonstrated that eIF3h is essential for TAV to activate reinitiation after long ORF translation. Protoplasts derived from eif3h-1 mutant failed to support TAV function in reinitiation, which is restored only upon overexpression of recombinant eIF3h indifferent to its phosphorylation status. eif3h-1 mutant defective in reinitiation was found resistant to CaMV infection suggesting that eIF3h is critical for virus amplification. In contrast, viruses that evolve translation initiation dependent on either cap or the internal ribosome entry site infect reinitiation deficient mutant. Thus, we conclude that TAV exploits the basic cell reinitiation machinery, particularly TOR and eIF3h, to overcome cellular barriers to reinitiation after long ORF translation.

Chez Arabidopsis, la protéine RISP est détournée par le virus CaMV pour assurer, ensemble avec la protéine virale TAV, la traduction de son ARN polycistronique. RISP a été identifiée comme une cible de la voie de signalisation de TOR et il a été montré que sa phosphorylation est requise pour promouvoir la réinitiation de la traduction activée par TAV. Les résultats que j’ai obtenus suggèrent que RISP, lorsqu’elle n’est pas phosphorylée, intervient ensemble avec eIF3, au niveau du complexe de pré-initiation 43S pour recruter le complexe ternaire grâce à l’interaction entre RISP et la sous-unité b du facteur eIF2. Il s’est avéré que RISP a la capacité, lorsqu’elle est phosphorylée, d’interagir non seulement avec la protéine ribosomique eL24 mais également avec eS6. Nos résultats indiquent que la liaison entre les sous-unités ribosomiques 60S et 40S sous l’effet de RISP, est régulée par la voie de TOR et qu’elle joue un rôle important dans le contrôle de la réinitiation de la traduction. / Many factors are required to recruit the tRNAi and a 60S ribosomal subunit to the 40S ribosomal subunit preinitiation complex. This recruitment is normally strictly limited during reinitiation of translation if factors recruited during the primary translation event are shed from 40S. However, factor retention can occur during long ORF translation if the CaMV viral factor TAV is present. RISP is a downstream target of TOR and found either within the 43S preinitiation complex, if bound to eIF3, and/or attached to 60S, if phosphorylated by TOR. We show here that RISP interacts with subunit b of eIF2 before phosphorylation. Critically, TOR activation up-regulates phosphorylation of both RISP and eS6 as well as the binding of both factors. Importantly, eS6-deficient plants are less active in TAV-mediated reinitiation and are thus less susceptible to CaMV infection. It is attractive to propose that eS6 phosphorylation contributes to retention and re-use of 60S during 40S scanning.