Αντικείμενο μελέτης της παρούσας διπλωματικής ερευνητικής εργασίας αποτελεί η ταυτοποίηση και η διερεύνηση της βιολογικής δράσης του πεπτιδίου που αποκόπτεται από τον υποδοχέα PAR1 μετά την ενεργοποίηση του από την θρομβίνη. Το υπεύθυνο γονίδιο για την έκφραση του υποδοχέα PAR1 κωδικοποιεί μια πολυπεπτιδική αλυσίδα μήκους 425 αμινοξέων. Έχει προταθεί ότι τα πρώτα 21-23 αμινοξέα του αμινοτελικού άκρου του μορίου αυτού πιθανόν να αποτελούν σηματοδοτική αλληλουχία υπεύθυνη για την μεταφορά και τοποθέτηση του υποδοχέα στην κυτταρική μεμβράνη. Η σηματοδοτική αυτή αλληλουχία είναι άγνωστο προς το παρόν αν παραμένει στον ώριμο PAR1 υποδοχέα ή απομακρύνεται με πρωτεόλυση πριν την εμφάνιση του PAR1 στην κυτταρική μεμβράνη. Ο υποδοχέας PAR1 ανήκει στην μεγάλη οικογένεια υποδοχέων των επτά διαμεμβρανικών τμημάτων (seven transmembrane domain receptor family) που διασυνδέονται με G πρωτεΐνες (G protein-coupled receptors, GPCRs). Επιπλέον, επειδή η ενεργοποίηση του υποδοχέα απαιτεί την ενζυμική δράση της θρομβίνης, ορίζεται με αυτόν τον τρόπο μία νέα οικογένεια διαμεμβρανικών υποδοχέων που ενεργοποιούνται από πρωτεάσες (Proteinase-Activated Receptors, PARs). Η θρομβίνη αναγνωρίζει για πέψη μια θέση στην αλληλουχία του εξωκυττατικού αμινοτελικού άκρου μεταξύ των αμινοξέων Arg41-Ser42 του υποδοχέα PAR1. Η πέψη αυτού του πεπτιδικού δεσμού οδηγεί στην απελευθέρωση ενός πεπτιδίου (Thrombin Receptor Peptide, TR) και στην δημιουργία ενός νέου αμινοτελικού άκρου για τον υποδοχέα, που λειτουργεί ως αγωνιστής και ενεργοποιεί τον PAR1. Έχει δειχθεί ότι η θρομβίνη και ο υποδοχέας PAR1 εμπλέκονται σε αρκετές παθοφυσιολογικές καταστάσεις. Ωστόσο δεν υπάρχουν επαρκείς πληροφορίες για την δράση του πεπτιδίου που αποκόπτεται. Χρησιμοποιώντας την τεχνολογία HPLC/MS έγινε προσπάθεια για την ταυτοποίηση του πραγματικού μεγέθους του πεπτιδίου που αποκόπτεται από τον PAR1 υποδοχέα. Τα πρώτα αποτελέσματα της εφαρμογής αυτής 55 οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι κρίνεται απαραίτητη η περεταίρω βελτίωση των συνθηκών ανίχνευσης του πεπτιδίου, ώστε να επιτρέπεται η ανίχνευση του κατά την φόρτωση 1 ng στην στήλη της υγρής χρωματογραφίας. Πιο συγκεκριμένα η αντιμετώπιση της υψηλής πολικότητας του TR23-41 και η ενίσχυση ευαισθησίας του TR1-41 με την χρήση διαφορετικού διαλύτη ή με την χρήση διαφορετικής στήλης ή και ακόμα ο συνδυασμός διαφορετικού διαλύτη και στήλης, που αποτελεί και την μέχρι τώρα πιο πιθανή εκδοχή αντιμετώπισης των παραπάνω προβλημάτων, πιθανόν να δώσουν λύση στο πρόβλημα ανίχνευσης σε χαμηλές συγκεντρώσεις πεπτιδίου. Επιπλέον με την χρήση τεχνικής ελέγχου DNA σύνθεσης εξετάστηκε η επίδραση του TR1-41 πεπτιδίου σε HUVECs. Σκοπός αυτών των πειραμάτων δεν ήταν μόνο η εύρεση τυχόν βιολογικής δράσης του πεπτιδίου αλλά και η εύρεση ελάχιστης συγκέντρωσης του πεπτιδίου που προκαλεί αναστολή στην σύνθεση του DNA σε καλλιέργειες ενδοθηλιακών κυττάρων στις οποίες έχει προηγηθεί συνθήκες νηστείας. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι το TR1-41 πεπτίδιο προκαλεί αναστολή στην σύνθεση του DNA και μάλιστα σε ελάχιστη συγκέντρωση 30nM, παρουσία ή μη του αυξητικού παράγοντα VEGF. Μελλοντικές έρευνες με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα μπορούν να οδηγήσουν στην ταυτοποίηση του πραγματικού μεγέθους του πεπτιδίου που αποκόπτεται μετά την τοποθέτηση και ενεργοποίηση του PAR1 στην κυτταρική μεμβράνη και κατ’ επέκταση στην λεπτομερή διερεύνηση της βιολογικής δράσης του πεπτιδίου αυτού. Γνωρίζοντας την ανάμιξη της θρομβίνης και του υποδοχέα της σε παθοφυσιολογικές καταστάσεις η ταυτοποίηση του πεπτιδίου και η γνώση της βιολογικής του δράσης μελλοντικά θα αποτελέσει ένα χρήσιμο προγνωστικό και διαγνωστικό δείκτη. / In the context of the MSc dissertation described herein, the objective of the research work constitutes in the identification of the real number of amino acids of the peptide that is being released after the activation of PAR1 by thrombin and the examination of its biological action. The responsible gene for the PAR1 expression codifies a polypeptide chain of 425 amino acids. It is under consideration that the first 21-23 amino acids of the exodomain N-terminal sequence of the receptor may be a signaling sequence, responsible for the transfer and placement of the receptor to the cell membrane. It is not known so far if the signaling sequence remains on the receptor after its placement on the cell membrane. PAR1 belongs to the family of the seven transmembrane domain receptor, the G protein-coupled receptors (GPCRs). PAR1 requires the enzymic activity of thrombin for its activation, and so a new family of transmembrane receptors is being defined, the Proteinase-Activated Receptors (PARs). Thrombin recognizes and cleaves the N-terminal exodomain of PAR1 between Arg41-Ser42 amino acids. This cleavage event releases a peptide (Thrombin Receptor Peptide, TR) and so unmasks a new N-terminus of the receptor, which acts as PAR1 agonist and activates the receptor. It has been proved that thrombin and PAR1 are being involved in many pathophysiological situations. So far there isn’t enough information of the biological action of the peptide that is being realized from PAR1. The use of HPLC/MS technology wasn’t able to reveal the real number of this peptide because of the intensity of TR1-41 in 1ng on column and the extreme polarity of TR24-41. instead of these results we strongly believe that the use of different solvents will increase the intensity of TR1-41 in 1ng on column. Also the use of C8 column instead of C4 probably will contribute in the traceability of TR24-41. The biological action of TR1-41 was examined with the use of DNA synthesis control technique in HUVECs cultivation after starvation. These experiments showed that the use of TR1-41 caused reduction of the DNA synthesis in HUVECs. We also examined the lower concentration of TR1-41 57 that was able to reduce the DNA synthesis in HUVECs. TR1-41 was able to reduce DNA synthesis in minimum concentration of 30 nM even in the presence of VEGF. The above results in association with future research can constitute in the identification of the real size of the peptide that is being released after the activation of PAR1, as in the biological action of this peptide. Knowing so far that thrombin and PAR1 are being involved in pathophysiological situations this peptide will constitute in the future as a useful prognostic and diagnostic marker.

Η αγγειογένεση ρυθμίζει πολλές φυσιολογικές και παθολογικές διαδικασίες. Έτσι είναι μεγάλου ενδιαφέροντος να ανακαλυφθούν μηχανισμοί που συμμετέχουν. Στο πρώτο μέρος της μεταπτυχιακής εργασίας πραγματοποιήθηκε η σύνθεση των τριών πεπτιδίων, ανάλογα ΤR1-41). Στην συνέχεια μελετήθηκε ο βιολογικός ρόλος του ΤR1-41. Είναι γνωστό ότι η θρομβίνη, η πρωτεάση σερίνης, έχει κεντρικό ρόλο στην αιμόσταση, και έχει προταθεί για να διαδραματίσει έναν σημαντικό ρόλο στην έναρξη της αγγειογέννεσης μέσω της μεταγωγής σήματος από τους PARs υποδοχέων. Οι PARs αποτελούνται μια νέα οικογένεια πρωτεϊνικών υποδοχέων των επτά διαμεμβρανικών τμημάτων (seven transmembrane domain receptor family) που διασυνδέονται με G πρωτεΐνες. Mοριακές και δομικές μελέτες του υποδοχέα της θρομβίνης, PAR-1, έδειξαν ότι το εξωκυτταρικό αμινοτελικό άκρο του είναι μακρύ και αποτελείται από 75 αμινοξέα. Επιπλέον, στην αλληλουχία του αμινοτελικού άκρου εντοπίστηκε μία θέση θετική για πέψη από τη θρομβίνη στη θέση μεταξύ της Arg41 και Ser42. Πράγματι η σύνδεση της θρομβίνης με τον PAR-1 έχει ως συνέπεια την εκλεκτική υδρόλυση του πεπτιδικού δεσμού LDPR41- S42FLLRN. Το αποτέλεσμα από την υδρόλυση αυτή, είναι η δημιουργία ενός ελεύθερου πεπτιδίου 41 αμινοξέων( Thrombin Receptor Peptide 1-41, TR1-41), και ενός νέου αμινοτελικού άκρου για τον υποδοχέα. Σε αντίθεση με το νέο αμινοτελικό άκρο του υποδοχέα της θρομβίνης (PAR-1), ο ρόλος του πεπτιδίου των 41 αμινοξέων (TR1-41) που αποκόπτεται με τη πρωτεολυτική δράση της θρομβίνης μεταξύ των αμινοξέων Arg41-Ser42 είναι σχεδόν άγνωστος. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την επίδραση αυτού του πεπτιδίου (MGPRRLLLVAACFSLCGPLLSARTRARRPESKATNATLDPR) στα καλλιεργημένα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η έκθεση των ενδοθηλιακών κυττάρων στο πεπτίδιο οδήγησε σε μια δοσοεξαρτώμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, καθώς επίσης και της δράσης των bFGF και VEGF. Επίσης υπήρχε η ένδειξη ότι το πεπτίδιο TR1-41 αναστέλλει σε συνθήκες ορού 5% FBS, τη δράση bFGF μέσω του μονοπατιού της MAP-κινάσης και μέσω του Erk1/2. Αντίθετα, καμία επίδραση δεν παρατηρήθηκε στα κύτταρα στα οποία χορηγήθηκε το scrambled peptide (πεπτίδιο 41 αμινοξέων με αναγραμματισμένη σειρά αμινοξέων) ή και μικρότερα πεπτίδια αυτού (TRARRPESKATNATLDPR). Επίσης το πεπτίδιο TR1-41 παρουσιάζει ανασταλτική δράση στον πολλαπλασιασμό των HUVECs και άλλων κυτταρικών σειρών. Τέλος, το πεπτίδιο TR1-41 εμπόδισε τον σχηματισμό αγγείων στο in vitro σύστημα της αγγειογέννεσης με υπόστρωμα Matrigel. Tο δεύτερο μέρος του μεταπτυχιακού μελετήθηκε ο βιολογικός ρόλος της ορμόνης μελατονίνης. Η μελατονίνη είναι το σημαντικότερο εκκριτικό προϊόν του κωνοειδούς αδένα και σε γενικές γραμμές εμφανίζει ογκοστατικές, αντιγηραντικές, αντιοξειδωτικές, νευροπροστατευτικές, υπνωτικές, ορεξιογόνες, αναλγητικές, θερμορυθμιστικές,και καρδιαγγειακές ιδιότητες, ενώ παρουσιάζει ανασταλτική δράση στη διαδικασία της αναπαραγωγής και μετατοπίζει τις φάσεις του «βιολογικού ρολογιού». Από τα πειράματά μας στα πρωτογενή ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVECs) η επίδραση της μελατονίνης φαίνεται διφασική. Στις χαμηλές συγκεντρώσεις μελατονίνης αυξάνεται ο πολλαπλασιασμός των HUVECς. Στις υψηλές συγκεντρώσεις αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των HUVECς. / Angiogenesis regulates many physiological and pathological processes, so it is of great interest to find out which mechanisms that are involved. In the first part of the project we synthesised three peptides, analogs of ΤR1-41 and we studied the biological role of the ΤR1-41. It is known that thrombin, the serine proteinase, best known for its pivotal role in haemostasis, has been proposed to play an important role in the initiation of angiogenesis by a mechanism most likely independent of its coagulant activity and more dependent on signaling via the protease-activated receptors (PARs). PARs consists a novel family of G protein-coupled receptors, which can be activated by proteolytic cleavage of their N-terminal extracellular domain. PAR-1 is the first member of this family to be cloned in which proteolytic cleavage at the R41/S42 bond by thrombin releases a 41 aminoacid peptide and unveils a tethered peptide ligand with the recognition sequence SFLLRN. Despite the wealth of information relating to the role of thrombin and PAR-1 innormal and disease states, a potential biological role of cleaved peptide remains unknown. In the present study, we evaluated the effect of the 41-amino-acid cleaved peptide, (MGPRRLLLVAACFSLCGPLLSARTRARRPESKATNATLDPR) in cultured human endothelial cells. Exposure of endothelial cells to this peptide resulted in a concentration-dependent inhibition of serum-mediated proliferation, as well as of bFGF- and VEGF-induced cell growth. There was the suspicion that the peptide blocked the serum, bFGF-triggered Erk1/2 activation. In contrast, no effect was observed in cells treated with a scramble peptide or with a shorter derivative of parstatin (TRARRPESKATNATLDPR). Finally, ΤR1-41 peptide abrogated tube formation in vitro Matrigel angiogenesis model. These results provide a plausible evidence for a negative role of PAR-1 cleaved peptide in angiogenic cascade and suggest parstatin as target for developing anti-angiogenic agents with potential therapeutic application in cancer and other angiogenesis-related diseases. The second part of the project was the biological role of melatonin. Melatonin is the major secretory product of the pineal gland and is considered an important natural oncostatic agent. From our experiments in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) the effect of melatonin seems to be biphasic. In low concentrations melatonin increased HUVEC proliferation, but in higher concentrations significantly decreased cell proliferation.