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Obwohl der Ca2+ permeable Ionenkanal TRPV2 in zahlreichen Immunzellen exprimiert wird, ist wenig über seine physiologische Funktion bekannt. Bisherige Studien verließen sich größtenteils auf die Anwendung von unspezifischen Modulatoren, TRPV2-defizienten Mäusen oder siRNA-vermittelten TRPV2-knockdown. Weder zelluläre Kompensationsmechanismen noch unspezifische Effekte können dabei ausgeschlossen werden. Daher haben wir eine etwa 5.500 Substanzen umfassende Substanzbibliothek auf niedermolekulare Modulatoren mit einer TRPV2-Aktivität untersucht. Mittels Fluoreszenz-basiertem Mediumdurchsatz-Screening und HEK293-Zellen, die stabil Ratten-TRPV2-Ionenkanäle exprimieren (HEKrTRPV2), konnten 3 strukturchemisch verwandte neuartige Inhibitoren ermittelt werden (IV2-1, IV2-2, IV2-3). Selektivitätsuntersuchen mit HEK293-Zellen, die stabil Ratten-TRPV1, Ratten-TRPV2, Maus TRPV3, Maus-TRPV4 oder Maus-TRPM3 exprimieren, zeigten, dass alle drei Substanzen eine TRPV2-Selektivität aufwiesen. Aufgrund des besseren IC50-Wertes wurde IV2-1 (IC50 = 6,3 ± 0.7 µM) als Leitstruktur ausgewählt und für weitere Untersuchungen verwendet. In Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Assays von HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen, welche TRPV2 endogen exprimieren, blockierte IV2-1 durch 2 APB oder 2 APB/Probenecid induzierte TRPV2-vermittelte Ca2+-Einströme. In elektrophysiologischen Patch-Clamp-Messungen konnten 2-APB-verursachte Ein- und Auswärtsströme des TRPV2-Kanals in HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen durch IV2-1 reversibel blockiert werden. MTT Assays zur Ermittlung zytotoxischer Effekte von IV2-1 auf HEK293-, HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen ergaben keine Minderung der Zellviabilität bis zu einer Konzentration von 50 µM. Somit konnte IV2 1 als neuer, nicht toxischer TRPV2-Inhibitor validiert werden. In Zellen des angeborenen Immunsystems wie z.B. Makrophagen könnten TRPV2-vermittelte Ca2+-Signale wichtige Mechanismen wie Phagozytose und Migration beeinflussen. Um den physiologischen Einfluss von TRPV2 in primären Makrophagen zu untersuchen, wurden aus Stammzellen des Knochenmarks von Mäusen primäre Makrophagen (BMDM) differenziert. Als Bestätigung der funktionellen Expression von TRPV2-Kanälen in BMDM konnten in Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Analysen mittels 2-APB Ca2+-Einströme ermittelt werden, welche durch Zugabe von IV2 1 blockiert wurden. Weiterhin wurde ein siRNA-vermittelter knockdown von TRPV2 in BMDM etabliert. Mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) konnte sowohl die Expression von TRPV2-mRNA als auch der knockdown um etwa 70 Prozent in BMDM beobachtet werden. Die Kombination 2 APB/Probenecid induzierte auch in moderaten Konzentrationen einen TRPV2-vermittelten Ca2+Einstrom in BMDM, ohne zytotoxische Effekte zu verursachen. Als nächstes sollte in BMDM der Einfluss der TRPV2-Aktivität auf die Phagozytose von Zymosan- und Staphylococcus aureus-Biopartikeln untersucht werden, welche mit einem pH-sensitiven Fluoreszenzindikator gekoppelt waren. Sowohl siRNA-vermittelter knockdown von TRPV2 als auch TRPV2-Inhibition durch IV2-1 oder Valdecoxib reduzierten die Phagozytoseaktivität der BMDM auf etwa 70 Prozent im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen. Diese Ergebnisse bestätigen eine Beteiligung von TRPV2 bei der Phagozytose. Anschließend wurden Transwell-Migrationsassays von BMDM in einem Gradienten aus Lipopolysacchariden (LPS) durchgeführt. Während die TRPV2-Inhibiton mit IV2 1, Valdecoxib oder ein TRPV2-knockdown die LPS-induzierte Migration von BMDM signifikant verringerte, steigerte die TRPV2-Aktivierung durch 2-APB/Probenecid die Anzahl migrierter BMDM im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen signifikant. Somit konnte ebenso eine TRPV2-Beteiligung bei der Migration von Makrophagen gezeigt werden. Da Phagozytose und Migration zielgerichtete Prozesse darstellen, sollten auch die Ca2+-Signale räumlich und zeitlich koordiniert auftreten. Solche lokal begrenzten, kurzen Ca2+-Fluktuationen können durch Ca2+-Mikrodomänen verursacht werden, welche der Aktivität einzelner oder weniger Kanäle entsprechen. Mittels TIRF-Mikroskopie und eines niederaffinen Ca2+-Indikators können hohe Ca2+-Fluktuationen in unmittelbarer Nähe zur Zellmembran selektiv detektiert und somit potenzielle durch TRPV2 generierte Ca2+ Mikrodomänen in Makrophagen untersucht werden. Nach der TRPV2-Aktivierung mit 2 APB/Probenecid konnten punktuelle, hohe Ca2+ Fluktuationen in BMDM ermittelt werden, welche nach Zugabe von IV2-1 inhibiert wurden. Unter physiologischeren Bedingungen wurden zudem basal aktive Ca2+ Mikrodomänen beobachtet, welche durch IV2 1 inhibiert wurden. Dementsprechend scheint TRPV2 in BMDM basal aktive Ca2+-Mikrodomänen ausbilden zu können. Bisher konnte nur die Kombination aus 2-APB und Probenecid in moderaten Konzentrationen genutzt werden, um TRPV2-Ionenkanäle ohne zytotoxische Effekte durch hohe Konzentrationen der Einzelsubstanzen zu aktivieren. Allerdings zeigt 2-APB keine Wirkung auf humane TRPV2 Kanäle, weshalb neue Möglichkeiten der TRPV2-Aktivierung essentiell sind. Um weitere potenzierende Effekte zu untersuchen, wurde Cannabidiol (CBD) als potentester TRPV2-Aktivator aus der Gruppe der Cannabinoide in Kombination mit Probenecid untersucht. In einer zweidimensionalen Analyse von CBD- und Probenecid-Verdünnungsreihen konnte eine potenzierende Wirkung der Kombination festgestellt werden, die sowohl humane als auch Ratten TRPV2-Kanäle superadditiv aktivierte. Mittels Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Analysen sowie elektrophysiologischen Patch-Clamp-Messungen von HEKrTRPV2- und HEKhuTRPV2-Zellen konnte dieser superadditive Effekt von CBD/Probenecid bestätigt werden. Die CBD/Probenecid-induzierte Aktivität humaner oder Ratten TRPV2-Kanäle konnte durch IV2-1 inhibiert werden, wohingegen Valdecoxib zwar Ratten-TRPV2 blockierte, jedoch humanen TRPV2 nicht vollständig inhibieren konnte. Mastzellen sind maßgeblich an der Freisetzung von allergischen und inflammatorischen Mediatoren beteiligt und stellen somit einen wichtigen Bestandteil des angeboren Immunsystems dar. Während die Ausschüttung von Leukotrienen, β-Hexosaminidase oder Histamin größtenteils IgE-vermittelt stattfindet, können davon unabhängig auch andere Signalkaskaden, wie z.B. durch MRGPRX2-vermittelt, die Degranulation von Mastzellen induzieren. Da Mastzellen ebenfalls TRPV2-Ionenkanäle exprimieren, könnte ein TRPV2-vermittelter Ca2+ Einstrom die Freisetzung von Mediatoren beeinflussen. Mit Hilfe der neuen TRPV2-Modulatoren und Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Analysen wurde zunächst die endogene TRPV2-Expression in basophilen RBL-2H3-Zellen als alternatives Zellmodell zu Mastzellen bestätigt. Zudem konnten keine zytotoxischen Effekte bis zu Konzentrationen von 50 µM IV2-1 oder Valdecoxib sowie einer Kombination aus 12.5 µM CBD und 500 µM Probenecid festgestellt werden. In Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Analysen konnte nach physiologischer Stimulation der Fcε-Rezeptoren ein Anstieg der intrazellulären Ca2+ Konzentration gemessen werden, der durch TRPV2-Inhibition mit IV2-1 oder Valdecoxib nicht blockiert wurde. In Untersuchungen zur Freisetzung von β-Hexosaminidase steigerte die Kombination CBD/Probenecid die Mediatorausschüttung hingegen deutlich. Dieser Effekt konnte durch TRPV2-Inhibition mit IV2-1 oder Valdecoxib inhibiert werden. Eine Kombination des TRPV2-vermittelten sowie des IgE-induzierten Stimulus führte zu einer additiv gesteigerten Freisetzung. Somit könnte TRPV2 unabhängig von der IgE-Signalkaskade eine wichtige physiologische Funktion bei der Degranulation von Mastzellen spielen. Daher wurden im nächsten Schritt primäre Mastzellen aus dem Knochenmark von Mäusen differenziert (BMMC) und die mRNA- sowie funktionelle Expression von TRPV2 durch qPCR und Fluoreszenz-basierte Ca2+-Assays bestätigt. Die verwendeten Modulatoren induzierten auch in BMMC in gleichen Konzentrationen wie in RBL 2H3-Zellen keine zytotoxischen Effekte. Die vorherigen Ergebnisse des Einflusses der TRPV2-Aktivität auf die Ausschüttung von β-Hexosaminidase konnten mit BMMC ebenso bestätigt werden. Mittels ELISA wurde zuletzt ein TRPV2-vermittelter Effekt auf die Histaminfreisetzung aus BMMC untersucht. Demnach steigerte die Kombination CBD/Probenecid die Histaminausschüttung deutlich, was durch TRPV2-Inhibition mit IV2 1 blockiert werden konnte. Auch hier hatte IV2-1 keinen Effekt auf die IgE-induzierte Histaminfreisetzung. Die simultane Stimulation der Fcε-Rezeptoren und der TRPV2-Kanäle resultierte in einer additiv gesteigerten Histaminausschüttung. Folglich scheint TRPV2-Aktivität die Freisetzung von Mediatoren wie Histamin oder β-Hexosaminidase unabhängig von der klassischen IgE-vermittelten Signalkaskade zu beeinflussen, was TRPV2 zu einer vielversprechenden Zielstruktur zur weiteren Erforschung im pathophysiologischen Kontext von entzündlichen und allergischen Reaktionen macht.

Transient receptor potential vanilloid 2 channel (TRPV2) is a Ca2+-permeable ion channel that is highly expressed in leukocytes but is also present in skeletal and cardiac muscle and endocrine cells. The TRPV2 function is implicated in a number of physiological processes, including bacterial phagocytosis, pro-inflammatory cytokine production, cardiac hypertrophy, and cancer development. TRPV2 knockout mice exhibit a high incidence of perinatal mortality, arguing that the channel plays essential roles in physiology. Despite the importance of TRPV2 for normal homeostasis, the mechanisms that control TRPV2 gating in response to pharmacological agonists, heating, membrane stretch, bioactive lipids and reactive oxygen species (ROS) remain poorly understood. Here we demonstrate that TRPV2 is functionally expressed in microglia (i.e., ‘brain macrophages’) and the microglia-like BV-2 cell line, and demonstrate that the gating of an endogenous TRPV2-like conductance is positively modulated by the bacterial toxin lipopolysaccharide (LPS), which is known to cause pro-inflammatory (M1) activation and increase ROS production by NADPH oxidase. To determine how TRPV2 gating is modulated by ROS, we recorded single channel activity in inside-out patches excised from HEK-293 cells expressing GFP-rTRPV2. Unitary currents elicited by the TRPV2 agonist 2-aminophenyl borinate (2-APB) or cannabidiol (CBD) are linear in monovalent recording solutions and give rise to an estimated unitary conductance of ~100pS, which is similar to TRPV1 but significantly smaller than TRPV3. Intriguingly, we find that although TRPV2 is insensitive to ROS (in the form of exogenously applied H2O2) alone, apparent open probability is synergistically enhanced when H2O2 is applied together with CBD. We identify two intracellular Cys residues that are necessary for TRPV2 responses to H2O2 sensitivity and find that these residues are located close to one another, albeit in different subunits, in the TRPV2 structure, suggesting that ROS promote the formation of an inter-subunit disulfide bond that alters sensitivity to pharmacological agonists. We hypothesize that ROS-dependent modulation of TRPV2 activity may be an important contributor to pro-inflammatory activation of microglia underline central nervous system diseases and that TRPV2 antagonism could be a useful therapeutic strategy in the treatment of neuroinflammation.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la conséquence de la perte de la dystrophine, protéine sous membranaire indispensable au maintien mécanique et fonctionnel du sarcolemme. Cette déficience augmenterait les influx cationiques par des microruptures de la membrane ou par la dérégulation de canaux tels que les canaux activés par l'étirement (SACs: Stretch-activated channel). Dans ce travail, les effets d'une stimulation mécanique ont été explorés sur des cardiomyocytes dans le contexte pathologique de la cardiomyopathie dilatée associée à la DMD. L'utilisation de fibres de carbone a permis de réaliser un étirement axial similaire aux conditions physiologiques de remplissage ventriculaire. Dans ces conditions, l'exploration de la topographie membranaire par la microscopie de conductance ionique à balayage n'a montré aucune évolution de la surface ni de lésion du sarcolemmel dans les conditions d'étirement. L'étude s'est donc focalisée sur l'activité de candidats moléculaires des SACs et plus particulièrement ceux appartenant à la famille des TRPs (Transient Receptor Potential) dans le dérèglement de l'homéostasie calcique induite par l'étirement. Les influx cationiques évalués par la technique d'extinction de fluorescence et l'étude de la concentration intracellulaire de Ca2+ ([Ca2+]i) grâce à la sonde Fluo8 montrent une implication des canaux TRPV2 et TRPCs. Les premiers semblent responsables d'une entrée cationique et d'une augmentation de [Ca2+]i importante dans les cardiomyocytes mdx. Les seconds, bien que responsables d'un influx, ne participeraient pas à l'augmentation de [Ca2+]i. Ces résultats révèlent que les canaux TRPV2 pourraient jouer un rôle important dans la dérégulation calcique observée dans les cardiomyocytes déficients en dystrophine. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the consequence of the loss of dystrophin, a subsarcolemmal protein essential for mechanical and functional maintenances of the sarcolemma. This deficiency could increase cationic influxes by membrane microruptures or by dysregulation of channels such as stretch-activated channels (SACs). In this work, the effects of a mechanical stretch were explored on cardiomyocytes in the pathological context of dilated cardiomyopathy associated with DMD. Using carbon fibers, an homogenous axial stretch was performed to mimic physiological conditions of ventricular filling. In these conditions, exploration of membrane topography using the scanning ion conductance microscopy did not show any surface evolution or sarcolemma disruption in stretch condition. The study was thus focused on activity and identification of molecular candidates for SACs, especially the TRPs (Transient Receptor Potential) channels in the stretch-induced. Ca2+ homeostasis dysregulation. Cationic influxes assessed by Mn2+-quenching and assessment of the intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i) using fluo-8 fluorescence demonstrated an involvement of TRPV2 and TRPCs channels. The first ones seem to be responsible for cationic entry and [Ca2+]i increase in mdx cardiomyocytes. The latter, though responsible for an influx, do not contribute to [Ca2+]i increase. These findings reveal that TRPV2 channels could play an important role in calcium dysregulation observed in dystrophin-deficient cardiomyocytes.

Die Ionenkanäle TRPV2, TRPV3 und TRPV4 sind an diversen physiologischen und pathologischen Vorgängen beteiligt, wodurch sie zu einer potentiellen pharmakologischen Zielstruktur werden. Zur Identifikation von Modulatoren mit einer erwünschten Wirkung an diesen Zielstrukturen, hat sich das Screening von Substanzbibliotheken bewährt, sodass auch wir auf diese Methode zurückgriffen. Die Substanzbibliothek Spectrum Collection umfasst neben 800 Naturstoffen und 160 Toxinen auch 1040 zugelassene oder klinisch geprüfte Medikamente, welche den Vorteil bieten, dass bereits Daten zur Pharmakokinetik und -dynamik vorhanden sind. Für die Untersuchungen entstanden mittels Transfektion murine TRPV2-, TRPV3- und TRPV4-über¬exprimierende humane embryonale Nierenzelllinien (HEK293-Zellen). In die Parentalzelllinie wurden Vektoren eingebracht, welche neben einer für das jeweilige Kanalprotein codierenden Sequenz u.a. auch einen CFP oder YFP Tag aufwiesen. Diese Markierung ermöglichte eine Kontrolle der Expression und der subzellulären Lokalisation. Das Screening der Spectrum Collection lieferte 61 (TRPV2), 68 (TRPV3) und 28 (TRPV4) Substanzen mit aktivierendem bzw. inhibitorischem Effekt. Im Anschluss an das Primärscreening war die Durchführung eines Sekundärscreenings notwendig. Am Ende dieses Selektionsprozesses standen Alverincitrat, Valdecoxib und Maprotilin. Es folgten weitere Untersuchungen zur Selektivität innerhalb der TRPV-Subfamilie. Alverincitrat ist ein nichtatropinerges Relaxans der glatten Muskulatur, welches in Großbritannien als Spasmolytikum u.a. zur Behandlung des Reizdarmsyndroms sowie der Dysmenorrhoe zugelassen ist. Alverincitrat zeigte einen blockierenden Effekt auf TRPV2 und TRPV4. Valdecoxib, welches als COX-2-Hemmer verbreitet als Analgetikum und Antiphlogistikum eingesetzt wird, fiel durch eine Blockierung des TRPV2-vermittelten intrazellulären Calciumionenanstiegs auf. Für Valdecoxib wurde eine halbmaximale inhibitorische Konzentration von 43,5 µM bestimmt. An TRPV3-Ionenkanälen hingegen zeigte sich eine Potenzierung des aktivatorinduzierten [Ca2+]i -Signals durch Valdecoxib. Aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit prüften wir, ob dieser konzentrationsabhängige Effekt auch durch andere COX-2-Hemmer, konkret Deracoxib und Rofecoxib, hervorgerufen werden kann. Für Rofecoxib wurde kein Einfluss auf TRPV3-Ionenkanäle detektiert. Deracoxib führte zu einer im Vergleich zu Valdecoxib sogar noch stärkeren Potenzierung des 2-APB-getriggerten, TRPV3-vermittelten Anstiegs der [Ca2+]i. Als nichtselektiver Monamin-Wiederaufnahme-Hemmer ist das tetrazyklische Anti-depressivum Maprotilin seit ca. 30 Jahren zur Behandlung depressiver Erkrankungen zugelassen. Wir beobachteten eine Inhibierung der GSK1016790A-induzierten TRPV4-Aktivierung durch Maprotilin. Die Ionenkanäle TRPV2, TRPV3 und TRPV4 sind von physiologischer bzw. pathophysiologischer Relevanz für den menschlichen Organismus und stellen somit eine geeignete pharmakologische Zielstruktur dar. Es sind zwar einige teils spezifische Aktivatoren und Blocker für TRPV2, TRPV3 und TRPV4 bekannt, diese sind jedoch bisher nicht zugelassen und damit nicht therapeutisch einsetzbar Neben dem therapeutischen Einsatz könnten die identifizierten Modulatoren auch zum Erstellen von Struktur-Wirkungsbeziehungen genutzt werden, durch die chemische Substrukturen ermittelt werden, welche für gewünschte sowie unerwünschte Wirkungen essentiell sind. Des Weiteren ist ein Einsatz der Modulatoren als zellbiologische Werkzeuge denkbar, wodurch neue Erkenntnisse über die physiologische und pathophysiologische Relevanz von TRPV2, TRPV3 und TRPV4 sowohl auf zellulärer als auch auf systemischer Ebene gewonnen werden könnten.:Inhaltsverzeichnis 1 Abkürzungsverzeichnis 3 1 Einführung 5 1.1 Die Familie der TRP-Ionenkanäle 5 1.2 Die TRPV-Subfamilie 8 1.3 TRPV2 8 1.4 TRPV3 12 1.5 TRPV4 15 2 Aufgabenstellung 20 3 Material und Methoden 21 2.1 Zellkultur 21 2.2 Laser-Scanning-Mikroskopie 22 2.3 Ca2+ -Assays 22 2.4 Spectrum Collection 26 4 Ergebnisse 28 3.1 Subzelluläre Lokalisation von TRPV2, TRPV3 und TRPV4 28 3.2 Funktionelle Expression 29 3.3 Screening der Spectrum Collection 31 3.4 Alverincitrat 36 3.5 Valdecoxib 39 3.6 Maprotilin 44 5 Diskussion 48 4.1 TRPV4 48 4.2 TRPV2 53 4.3 TRPV3 55 4.4 Ausblick 59 6 Zusammenfassung der Arbeit 61 7 Literaturverzeichnis 66 8 Curriculum vitae Fehler! Textmarke nicht definiert. 9 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 79 10 Danksagung 80

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