Cell wall is the major barrier in the delivery of biomolecules such as nucleic acids into the plant cell. Biological (bacteria or viruses) and biolistic (particle-based) methods are used to deliver nucleic acids into the plant cell. However, these methods have significant limitations when it comes to species range, scalability, and field assays. In this work, we report the use of layered double hydroxide (LDH) topically applied to deliver RNA molecules into the plant cell. LDH were assembled by methanol-based co-precipitation of magnesium and aluminum nitrate solution with sodium hydroxide and finally dispersed in deionized water. The assembled LDH were physically characterized by AFM, zeta-sizer and their binding to RNA was confirmed by gel electrophoresis. LDH complexed with double stranded RNA (dsRNA) was topically applied to Nicotiana benthamiana leaves. As a model system, virus specific dsRNA-LDH complexes were used to activate cellular RNAi machinery against Tomato Yellow leaf Curl Virus (TYLCV) in N. benthamiana plants. Our results demonstrated that topical application of the TYLCV specific dsRNA-LDH complexes reduce viral genome accumulation and viral symptoms development. Similarly, dsRNA-LDH protected plants produce typical leaves, flowers, and seeds, confirming efficient virus resistance compared unprotected TYLCV infected plants. Topical application and noninvasive delivery of nucleic acid has several advantages, as these methods are specie independent, easy to scale up, applied with low-pressure spray, requires no tissue culture and no sophisticated equipment. The LDH based noninvasive delivery of nucleic acids has the capability to overcome the cell wall barrier limitations and will open new opportunities to exploit the full potential of cellular machinery to produce resilient plants and insure sustainable food production.

Among viral diseases affecting cultivated tomato, Tomato yellow leaf curl disease (TYLCD) is one of the most devastating. This disease is caused by a complex of viruses of which Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) is regarded as the most important species. Current control strategies to fight viral diseases in tomato are mainly based on genetic resistance derived from wild relatives. In the present thesis, resistance derived from S. chilense and S. peruvianum has been exploited in breeding for resistance to TYLCD. In a previous study, TYLCV-resistant breeding lines derived from LA1932, LA1960 and LA1971 S. chilense accessions were developed. Therefore, the first objective of this thesis was to study the genetic control of the resistance derived from these accessions. With this aim, response to viral infection was assayed in segregating generations derived from the aforementioned resistant lines. The results obtained were compatible with a monogenic control of resistance. Resistance levels were higher in LA1960- and LA1971-derived F2 generations, as shown by slighter symptoms in the resistant plants and a higher number of asymptomatic plants compared with the results obtained in the LA1932-derived F2 generation. It is noteworthy that the level of resistance present in our materials is comparable to or even higher than the levels found in tomato lines homozygous for Ty-1. The response in plants heterozygous for the resistance gene was comparable to the response in homozygous plants for all three sources employed. This implies that the resistance genes derived from all three sources seem to be almost completely dominant. This effect was stronger for LA1971-derived resistance. The results were similar when comparing viral accumulation, as was expected, since a positive correlation was found in these families between viral accumulation and symptom scores. This has important implications in breeding, since the resistance will be used mostly for hybrid development. Our second objective was to map the loci associated with the major resistance genes identified. A total of 263 markers were screened, 94 of them being polymorphic between both species. Recombinant analysis allowed the resistance loci to be localized on chromosome 6, in a marker interval of 25 cM. This interval includes the Ty-1/Ty-3 region, where two S. chilense-derived TYLCD resistance loci were previously mapped. In order to test if the resistance genes identified in our populations were allelic to Ty-1 and Ty-3, further fine mapping was carried out. A total of 13 additional molecular markers distributed on chromosome 6 allowed 66 recombinants to be identified, and the resistance region to be shortened to a marker interval of approximately 950 kb, which overlaps with the Ty-1/Ty-3 region described previously by other authors. Therefore, the results obtained indicate that closely linked genes or alleles of the same gene govern TYLCV resistance in several S. chilense accessions. The third objective of the present thesis was to start the construction of a set of introgression lines (ILs) derived from Solanum peruvianum accession PI 126944 into the cultivated tomato genetic background. Once this collection of ILs is developed, it will represent a powerful tool for exploiting the resistance to different pathogens found in this particular accession in addition to other possible characters of interest. The starting plant material consisted of several segregating generations that were derived from two interspecific hybrids previously obtained by our group. Many crosses and embryo rescue were required to obtain subsequent generations due to the high sexual incompatibility that exists between tomato and PI 126944. Several mature fruits from the most advanced generations produced a few viable seeds, although embryo rescue was also employed to obtain progeny. As only a few plants were obtained by direct backcrossing, additional crosses were made in order to increase the number of descendants. A high degree of incompatibility was also found in crosses between sib plants. A total of 263 molecular markers were tested in some generations, 105 being polymorphic between tomato and PI 126944. Available generations were genotyped with these polymorphic markers in order to determine which alleles of S. peruvianum were already introgressed. On average, 79, 78 and 84 % of the S. peruvianum genome was represented in the pseudo-F2, pseudo-F4 and pseudo-F5 generations, respectively, for the markers analyzed. A reduction in the S. peruvianum genome was observed in more advanced generations, such as BC1 (56 %), pseudo-F2-BC1 (60 %) and pseudo-F3-BC1 (70 %). A greater reduction was observed in the pseudo-F3-BC2 generation (33 %). As a consequence of the reduction in the S. peruvianum genome, a loss of incompatibility was observed in some cases. The S. peruvianum genome was almost completely represented among the different plants of the most advanced generations. An evaluation for resistance to TYLCD and Tomato spotted wilt virus (TSWV) was carried out in some of the advanced generations, some of which were resistant to one or both viruses. In conclusion, we have conducted a successful and deeper exploitation of two wild species with proved resistance to TYLCD, S. chilense and S. peruvianum, identifying and fine mapping new genes of resistance. / Julián Rodríguez, O. (2014). Exploitation of Solanum chilense and Solanum peruvianum in tomato breeding for resistance to Tomato yellow leaf curl disease [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/36867 / TESIS

La entrada PI 126944 de S. peruvianum ha sido descrita como resistente a distintos estreses bióticos, entre ellos a la enfermedad del rizado amarillo del tomate (Tomato yellow leaf curl disease, TYLCD). En trabajos previos realizados en el Instituto Universitario para la Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana (COMAV) se obtuvieron tres híbridos interespecíficos entre esta entrada y el tomate cultivado, empleando el rescate de semillas inmaduras. En trabajos posteriores se desarrollaron generaciones más avanzadas a partir de estos materiales, incluyendo hasta las generaciones pseudo-F6 y retrocruces hacia la especie cultivada de algunas de las generaciones pseudo-Fn. Con objeto de aprovechar estos materiales en la mejora del tomate cultivado se inició, en trabajos anteriores del grupo, el desarrollo de un conjunto de líneas de introgresión (Introgression lines, ILs) que contengan el genoma de la entrada PI 126944 en el fondo genético de S. lycopersicum. Para tener correctamente representado el genoma de la especie donante en el fondo genético del tomate es necesario obtener un gran número de descendientes, por lo que es necesario optimizar los protocolos. El primer objetivo de esta tesis fue el estudio de distintos factores implicados en la superación de las barreras de incompatibilidad, con objeto de conseguir un elevado número de descendientes y maximizar la probabilidad de introgresar el genoma de PI 126944 en el conjunto de ILs. Se llevaron a cabo tres ensayos de retrocruce, iniciados con diferentes plantas de las generaciones pseudo-F4, pseudo-F5 y pseudo-F6. El genotipo de los parentales resultó ser un factor determinante en la obtención de descendencia, por lo que se recomienda utilizar el máximo número de genotipos distintos, con objeto de maximizar la probabilidad de obtener progenie. Se llevó a cabo una prueba de medios de cultivo que permitió seleccionar la combinación más adecuada de auxinas y citoquininas para el cultivo de semillas inmaduras y posterior regeneración de plantas. También se estudió el efecto del número de días transcurridos desde la polinización hasta la recolección de los frutos. Tal y como se ha comentado anteriormente, esta colección del ILs presenta interés por la resistencia del parental donante a TYLCD. Una vez se complete la colección, se evaluará por su resistencia a esta enfermedad. Los estudios previos han mostrado que se trata probablemente de una resistencia poligénica, cuya expresión a menudo es más dependiente de las condiciones ambientales y de otros factores. En estos casos, el empleo de un solo testigo resistente y otro susceptible no es suficiente para determinar con exactitud el nivel de resistencia de los materiales en estudio. La disponibilidad de controles con distintos niveles de resistencia permitiría realizar un fenotipado más preciso. Un grupo de investigadores del "Volcani Center" desarrollaron una escala compuesta por siete líneas con diversos niveles de resistencia a TYLCD, introgresada a partir de distintas especies silvestres. En el marco de esta tesis se evaluó el comportamiento de esta escala en siete ensayos distintos, cuatro de ellos llevados a cabo en el COMAV-UPV y los otros tres en el Instituto Nacional de Ciencias Hortícolas de Cuba. Se compararon dos aislados de TYLCV (Tomato yellow leaf curl virus), una de las especies causantes de TYLCD, diferentes métodos de inoculación, dos estados de desarrollo de la planta y distintas condiciones ambientales. Los síntomas fueron más leves que los obtenidos en las condiciones ensayadas por los autores que desarrollaron la escala, si bien el orden de las líneas en la escala se mantuvo, con pocas excepciones. Sin embargo, en la mayor parte de las condiciones, la respuesta obtenida no correspondió a una escala gradual, ya que se observó una gran diferencia entre los valores de síntomas de las líneas susceptibles y las resistentes, siendo muy pequeñas las difer / Accession S. peruvianum PI 126944 has been reported as resistant to several biotic stresses, among them to Tomato yellow leaf curl disease, (TYLCD). In previous works carried out in the "Instituto Universitario para la Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana" (COMAV) three interspecific hybrids between this accession and cultivated tomato were obtained, using immature seeds rescue. In subsequent works more advances generations from these materials were developed, including until the pseudo-F6 generations and backcrosses to the cultivated species of some of the pseudo-Fn generations. With the aim of taking advantage of these materials in the improvement of cultivated tomato, in previous works of the group, the development of a set of Introgression lines (ILs) that contain the genome of the accession PI 126944 in the genetic background of S. lycopersicum was initiated. The obtaining of a large number of descendants is necessary in order to have correctly represented the genome of the donor species, thus there is the need to optimize the protocols In this sense, the first aim of this work was the study of several factors involved in the overcoming of the incompatibility barriers, to obtain a high number of descendants and maximize the probability of introgressing the genome of PI 126944 in the set of ILs. Three backcross assays were carried out, initiated with different plants of the generations pseudo-F4, pseudo-F5 and pseudo-F6. The parental genotype resulted a determinant factor in the obtaining of descendants, so the recommendation is the use of the maximum number of different genotypes, in order to maximize the probability of obtaining progeny. A proof of different culture media was carried out, which allowed the selection of the better combination of auxins and cytokinins to grow immature seed and regenerate plants. The effect of the number of days from pollination to fruit harvest was also studied. As mentioned before, the collection of ILs results of interest, given the resistance of the donor parental to TYLCD, among others traits. Once the collection is completed, it will be evaluated for its resistance to this disease. The previous studies showed that it is probably a quantitative resistance, whose expression is often more dependent of the environmental conditions and of other factors. In these cases, the use of only one resistant and one susceptible control is not sufficient to determine with accuracy the level of resistance. Availability of controls with different levels of resistance would allow a more precise phenotyping. A group of researchers of the "Volcani Center" developed a scale that consisted of seven lines with different levels of resistance to TYLCD, introgressed from different wild species. In this work, the response of this scale in seven distinct assays was evaluated, four of them carried out in the COMAV-UPV and the others three in the "Instituto Nacional de Ciencias Hortícolas de Cuba". Two isolates of TYLCV (Tomato yellow leaf curl virus), one of the species causing TYLCD, different inoculation method, two development stages of the plant and several environmental conditions were evaluated. In general, the symptoms were more slight that the obtained in the conditions assayed by the authors that developed the scale, although the order of the lines in the scale were maintained, with few exceptions. However, in most of the conditions, the response obtained did not correspond to a graded scale, since there were high differences among the symptom scores of the susceptible and the resistant lines, with very small the differences among the resistant lines. These results suggest the possibility to reduce the number of lines to employ in each concrete condition, selecting the most susceptible, the most resistant and another with intermediate levels of resistance. / L'entrada PI 126944 de S. peruvianum ha sigut descrita com a resistent a diferents estresses biòtics, entre ells a la malaltia de l'arrissat groc de la tomaca (Tomato yellow leaf curl disease, TYLCD). En treballs previs realitzats en el "Instituto Universitario para la Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana" (COMAV) es van obtenir tres híbrids interespecífics entre aquesta entrada i la tomaca cultivada, emprant el rescat de llavors immadures. En treballs posteriors, es van desenvolupar generacions més avançades a partir d'aquests materials, incloent fins a les generacions pseudo-F6 i retrocreuaments cap a l'espècie cultivada d'algunes de les generacions pseudo-Fn. A fi de aprofitar aquests materials en la millora de la tomaca cultivada es va iniciar, en treballs anteriors del grup, el desenvolupament d'un conjunt de línies d'introgressió (Introgression lines, ILs) que continguen el genoma de l'entrada PI 126944 en el fons genètic de S. lycopersicum. Per a tenir correctament representat el genoma de l'espècie donant en el fons genètic de la tomaca és necessari obtenir un gran nombre de descendents, per la qual cosa és necessari optimitzar els protocols. El primer objectiu d'aquesta tesi va ser l'estudi de diferents factors implicats en la superació de les barreres d'incompatibilitat, a fi d'aconseguir un elevat nombre de descendents i maximitzar la probabilitat d'introgressar el genoma de PI 126944 en el conjunt de ILs. Es van dur a terme tres assajos de retrocreuament, iniciats amb diferents plantes de les generacions pseudo-F4, pseudo-F5 i pseudo-F6. El genotip dels parentals va resultar un factor determinant en l'obtenció de descendència, per la qual cosa es recomana utilitzar el màxim nombre de genotips diferents, a fi de maximitzar la probabilitat d'obtenir descendència. Es va dur a terme una prova de medis de cultiu que va permetre seleccionar la combinació més adequada d'auxines i citoquinines per al cultiu de llavors immadures i posterior regeneració de plantes. Es va estudiar l'efecte del nombre de dies transcorreguts des de la pol·linització fins a la recol·lecció dels fruits, havent-se obtingut resultats diferents. Tal com s'ha comentat anteriorment, aquesta col·lecció de ILs presenta interès per la resistència del parental donant a TYLCD. Una vegada es complete la col·lecció, s'avaluarà per la seua resistència a aquesta malaltia. Els estudis previs han mostrat que es tracta probablement d'una resistència quantitativa, l'expressió de la qual sovint és més depenent de les condicions ambientals i d'altres factors. En aquests casos, l'utilització d'un sol control resistent i un altre susceptible no és suficient per a determinar amb exactitud el nivell de resistència dels materials en estudi. La disponibilitat de controls amb diferents nivells de resistència permetria realitzar un fenotipat més precís. Un grup d'investigadors del "Volcani Center" van desenvolupar una escala composta per set línies amb diversos nivells de resistència a TYLCD, introgressada a partir de diferents espècies silvestres. En el marc d'aquesta tesi es va avaluar el comportament d'aquesta escala en set assajos diferents, quatre d'ells duts a terme en el COMAV-UPV i els altres tres en el "Instituto Nacional de Ciencias Hortícolas de Cuba". Es van comparar dos aïllats deTYLCV (Tomato yellow leaf curl virus), una de les espècies causants de TYLCD, diferents mètodes d'inoculació, dos estats de desenvolupament de la planta i diferents condicions ambientals. Els símptomes van ser més lleus que els obtinguts en les condicions assajades pels autors que van desenvolupar l'escala, si ben l'ordre de les línies en l'escala es va mantenir, amb poques excepcions. No obstant açò, en la major part de les condicions, la resposta obtinguda no va correspondre a una escala gradual, ja que es va observar una gran diferència entre els valors de símptomes de les línies susceptibles i les resiste / Campos, GN. (2018). Aprovechamiento de las especies Solanum peruvianum en la mejora del tomate [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/100858 / TESIS

[EN] Tomato yellow leaf curl disease (TYLCD) causes great damage in tomato (Solanum lycopersicum L.) crops in south-eastern Spain and in many tropical and subtropical areas in the world. The disease is caused by a complex of viruses, all belonging to the genus Begomovirus, family Geminiviridae. Nine species have been reported causing TYLCD and six more have been proposed as tentative species. Four viral species associated with TYLCD are present in Spain. Preventive measures to fight the disease, as well as measures based on controlling the insect vector (Bemisia tabaci Gen.) are not effective, so the development of resistant varieties seems the best long term strategy. Given that resistance has not been reported in the cultivated species, screening for resistance has been focused on wild tomato relatives. Resistance has been found in different wild species and some resistant breeding lines and commercial varieties have been developed. Ty-1, derived from S. chilense LA1969, is the most frequently used gene. Advances in genetic engineering techniques have also been exploited in developing plant material with pathogen derived resistance. However, resistant varieties currently available are not a solution, as with high inoculum pressure conditions and early infections, plants still develop symptoms and yield losses are caused. For that reason, many research groups continue working worldwide to obtain plants with high levels of resistance to TYLCD. Current breeding objectives are the development of broad spectrum resistance to several begomovirus, the accumulation of resistance genes from different sources to increase the levels of resistance and the identification of molecular markers tightly linked to resistance genes, which allows shortening breeding programmes and accumulating different resistance genes in the same plant material. This work has been developed in the research group ‘Breeding for resistance to Tomato yellow leaf curl disease’ of the Institute for Conservation and Improvement of Agrodiversity (COMAV). When this project was initiated, several resistant plant materials had been developed from previous works of the group. Twelve breeding lines derived from S. chilense LA1932 and LA1938 were available. These lines were resistant to Tomato yellow leaf curl Sardinia virus (TYLCSV), the first viral species described in Spain causing TYLCD. It was of interest the evaluation of resistance in these lines to Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), introduced later in Spain and spread worldwide. Six breeding lines showed high levels of partial resistance to TYLCSV and TYLCV. The resistance consisted on attenuation and delay in symptom development, as well as reduction in viral accumulation. Significant yield losses due to viral infection were not observed in these lines. These lines also show good horticultural traits which make them appropriate to be base material for developing commercial hybrids resistant to both, TYLCSV and TYLCV. High levels of resistance have also been identified in S. pimpinellifolium UPV16991. The resistance has already been fixed in the genetic background of S. lycopersicum. It was convenient to determine the genetic control of the resistance and the expression in tomato background, before using it in breeding programmes. For these purposes L102 was selected. L102 belongs to the F6 generation, after the initial cross S. lycopersicum NE-1 x S. pimpinellifolium UPV16991. Resistance to TYLCV in L102 is controlled by one gene, with partial recessiveness and incomplete penetrance. Moreover, the expression of resistance strongly depends on S. lycopersicum background in which it is introgressed. The highest levels of resistance are obtained when crossing L102 with vigorous lines. So, we recommend to use UPV16991-derived resistance in the development of vigorous hybrids in homozygosis or combined with resistance from other sources. To exploit resistance derived from UPV16991, L102 and some other lines with the same origin were crossed with a breeding line homozygous for Ty-1. Resistance was then evaluated in several plant material heterozygous for both, Ty-1 and the resistance gene from UPV16991. These plant materials showed higher levels of resistance than heterozygotes for each of the genes. Resistance in one of the hybrids was even higher than in homozygotes for each of the genes. These results show that combining resistance from UPV16991 with Ty-1 is the most practical approach to exploiting this resistance, since it allows the development of hybrids without the need of fixing the resistance gene in both parents. Finally, availability of molecular markers tightly linked to the resistance genes is essential to accumulate resistance from different sources. Some molecular markers tightly linked to Ty-1 have been reported. However, in all cases, S. peruvianum-derived Mi gene interferes with these markers, causing false positive results. In this work, a molecular marker, JB-1, tightly linked to Ty-1 has been identified. This is a CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic DNA) marker. The presence of Mi, as well as introgressions from other wild tomato relatives such as S. lycopersicum (formerly Lycopersicon esculentum var. cerasiforme), S. habrochaites and S. pimpinellifolium do not interfere with the results for this marker. In addition, the analysis of several plant material with introgressions from different wild tomato relatives has allowed the location of CT21, the RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) marker from which JB-1 was designed. / [ES] La enfermedad del rizado amarillo del tomate (Tomato yellow leaf curl disease, TYLCD) causa graves daños en los cultivos de tomate (Solanum lycopersicum L.) del sudeste español y de la mayor parte de las zonas tropicales y subtropicales de todo el mundo. La enfermedad está causada por un complejo de virus pertenecientes al género Begomovirus, familia Geminiviridae. Se han descrito nueve especies causantes de TYLCD y otras seis han sido propuestas. En España están presentes cuatro de las especies virales asociadas a TYLCD. Las medidas preventivas de lucha contra la enfermedad, así como las basadas en el control del insecto vector transmisor (Bemisia tabaci Gen.) no resultan efectivas por si mismas, de forma que el desarrollo de materiales resistentes supone la mejor estrategia de lucha a largo plazo. Dado que en la especie cultivada no se han descrito entradas resistentes, la búsqueda de fuentes de resistencia se ha centrado en las especies silvestres del género relacionadas con el tomate. Se ha encontrado resistencia en distintas entradas de algunas de estas especies y se han desarrollado líneas de mejora y materiales comerciales con resistencia procedente de algunas de ellas. El gen Ty-1, derivado de la entrada LA1969 de S. chilense, ha sido el más empleado para la obtención de líneas e híbridos comerciales resistentes. Por otra parte, haciendo uso de los avances en las técnicas de ingeniería genética, también se han desarrollado materiales con resistencia derivada del patógeno. Sin embargo, los materiales resistentes disponibles hasta el momento no suponen una solución definitiva al problema, ya que, con presiones fuertes de inóculo o infecciones tempranas, las plantas desarrollan síntomas de la enfermedad, produciéndose pérdidas de producción. Por este motivo, numerosos grupos de investigación continúan trabajando a nivel mundial con la finalidad de obtener materiales con niveles elevados de resistencia a TYLCD. Entre los objetivos actuales de mejora se incluyen el desarrollo de resistencia de amplio espectro a varios begomovirus, la combinación de genes de distinta procedencia para conseguir mayores niveles de resistencia y la identificación de marcadores moleculares ligados a los genes de resistencia que permitan acortar los programas de mejora y acumular en un mismo material genes de resistencia de distintas fuentes. El grupo de “Mejora para la resistencia a la enfermedad del rizado amarillo del tomate”, del Instituto de Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana (COMAV), en el que se ha realizado la presente tesis doctoral, disponía al inicio de la misma de distintos materiales con resistencia a TYLCD, desarrollados en trabajos previos. Entre estos materiales se encontraban 12 líneas de mejora derivadas de la entradas LA1932 y LA1938 de S. chilense, seleccionadas por su resistencia a la especie Tomato yellow leaf curl Sardinia virus (TYLCSV), la primera especie viral causante de TYLCD detectada en España. Resultaba de interés evaluar la respuesta de estos materiales a la especie Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), introducida posteriormente en España y más extendida a nivel mundial. Seis de las líneas evaluadas han mostrado niveles elevados de resistencia parcial a TYLCSV y TYLCV, consistente en la atenuación en la manifestación de síntomas y retraso en el momento de aparición de los mismos, además de en la reducción de la acumulación viral. Además, no se han observado en estas líneas pérdidas significativas en el rendimiento como consecuencia de la infección por TYLCV. Las características agronómicas las hacen apropiadas como parentales para el desarrollo de híbridos con elevada resistencia a TYLCSV y TYLCV. Por otra parte, se habían identificado niveles elevados de resistencia en la entrada UPV16991 de S. pimpinellifolium. Una vez fijada la resistencia en el fondo genético de S. lycopersicum, y como paso previo al empleo en programas de mejora, era conveniente determinar el control genético de la misma, así como conocer su expresión en el fondo genético de la especie cultivada. Para ello se ha empleado la línea L102, que corresponde a la quinta generación de autofecundación a partir del cruce inicial S. lycopersicum NE-1 x S. pimpinellifolium UPV16991. Se ha comprobado que la resistencia parcial a TYLCV de la línea L102 está controlada por un gen con recesividad parcial y penetración incompleta. Además, la expresión de la misma depende considerablemente del fondo genético de S. lycopersicum en el que se introgresa, obteniéndose los mayores niveles de resistencia en cruces con líneas vigorosas. Por todo esto, se recomienda el uso de esta resistencia bien en homocigosis en el desarrollo de híbridos vigorosos, bien en combinación con resistencia procedente de otras fuentes. En este sentido, se decidió evaluar la resistencia en materiales que combinaban el gen Ty-1 y el gen derivado de UPV16991, ambos en heterocigosis. El nivel de resistencia en estos materiales ha sido superior al mostrado por los heterocigotos para cada uno de los genes, e incluso en algún caso se ha superado la resistencia de los homocigotos para cada uno de los genes. Esto indica que la combinación de la resistencia derivada de UPV16991 con el gen Ty-1 es la aproximación más práctica para la utilización de esta resistencia, ya que evita la necesidad de fijar el gen de resistencia en ambos parentales. Por último, para la acumulación de resistencia de distinta procedencia en un mismo material, resulta imprescindible disponer de marcadores moleculares ligados a los genes de resistencia. Se han descrito algunos marcadores ligados al gen Ty-1, sin embargo, la presencia del gen Mi, derivado de S. peruvianum, interfiere con los resultados para estos marcadores, obteniéndose falsos positivos. En este trabajo se ha identificado un marcador molecular, JB-1, tipo CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic DNA) ligado al gen de resistencia Ty-1. La presencia del gen Mi, así como introgresiones de otras especies como S. lycopersicum (antes Lycopersicon esculentum var. cerasiforme), S. habrochaites y S. pimpinellifolium, no interfieren con los resultados para este marcador. Además, el análisis de materiales con introgresiones de distintas especies silvestres relacionadas con el tomate para varios marcadores de la región del Ty-1 ha permitido localizar el marcador CT21, el RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) a partir del cual se desarrolló JB-1. / [CA] La malaltia de l’arrissat groc de la tomaca (Tomato yellow leaf curl disease, TYLCD) causa greus danys als cultius de tomaca (Solanum lycopersicum L.) del sud-est espanyol i de la major part de les zones tropicals i subtropicals de tot el món. La malaltia està causada per un complex de virus pertanyents al gènere Begomovirus, família Geminiviridae. S’han descrit nou espècies causants de TYLCD i altres sis han sigut proposades. A Espanya estan presents quatre de les espècies virals associades a TYLCD. Les mesures preventives de lluita contra la malaltia, així com les basades en el control de l’insecte vector transmissor (Bemisia tabaci Gen.) no resulten efectives per si mateixes, de manera que el desenvolupament de materials resistents suposa la millor estratègia de lluita a llarg termini. Atés que en l’espècie cultivada no s’han descrit entrades resistents, la recerca de fonts de resistència s’ha centrat en les espècies silvestres del gènere relacionades amb la tomaca. S’ha trobat resistència en distintes entrades d’algunes d’estes espècies i s’han desenvolupat línies de millora i materials comercials amb resistència procedent d’algunes d’elles. El gen Ty-1, derivat de l’entrada LA1969 de S. chilense, ha sigut el més utilitzat per a l’obtenció de línies i híbrids comercials resistents. D’altra banda, fent ús dels avanços en les tècniques d’enginyeria genètica, també s’han desenvolupat materials amb resistència derivada del patogen. No obstant, els materials resistents disponibles fins al moment no suposen una solució definitiva al problema, ja que, amb pressions fortes d’inòcul o infeccions primerenques, les plantes desenvolupen símptomes de la malaltia, produint-se pèrdues de producció. Per este motiu, nombrosos grups d’investigació continuen treballant a nivell mundial amb la finalitat d’obtindre materials amb nivells elevats de resistència a TYLCD. Entre els objectius actuals de millora s’inclouen el desenvolupament de resistència d’ampli espectre a diversos begomovirus, la combinació de gens de distinta procedència per a aconseguir majors nivells de resistència i la identificació de marcadors moleculars lligats als gens de resistència que permeten acurtar els programes de millora i acumular en un mateix material gens de resistència de distintes fonts. El grup de “Millora per a la resistència a la malaltia de l’arrissat groc de la tomaca”, de l’Institut de Conservació i Millora de l’Agrodiversitat Valenciana (COMAV), en el que s’ha realitzat la present tesi doctoral, disposava a l’inici de la mateixa, de distints materials amb resistència a TYLCD, desenvolupats en treballs previs. Entre estos materials es trobaven 12 línies de millora derivades de l’entrades LA1932 i LA1938 de S. chilense, seleccionades per la seua resistència a l’espècie Tomato yellow leaf curl Sardinia virus (TYLCSV), la primera espècie viral causant de TYLCD detectada a Espanya. Resultava d’interés avaluar la resposta d’estos materials a l’espècie Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), introduïda posteriorment a Espanya i més estesa a nivell mundial. Sis de les línies avaluades han mostrat nivells elevats de resistència parcial a TYLCSV i TYLCV, consistent en l’atenuació en la manifestació de símptomes, retard en el moment d’aparició dels mateixos i reducció de l’acumulació viral. A més, no s’han observat en estes línies pèrdues significatives en el rendiment com a conseqüència de la infecció per TYLCV. Les característiques agronòmiques les fan apropiades com a parentals pel desenvolupament d’híbrids amb elevada resistència a TYLCSV i TYLCV. D’altra banda, s’havien identificat nivells elevats de resistència en l’entrada UPV16991 de S. pimpinellifolium. Una vegada fixada la resistència en el fons genètic de S. lycopersicum, i com a pas previ a l’ús en programes de millora, era convenient determinar el control genètic de la mateixa, així com conéixer la seua expressió en el fons genètic de l’espècie cultivada. Per a això s’ha emprat la línia L102, que correspon a la quinta generació d’autofecundació a partir del creuament inicial S. lycopersicum NE-1 x S. pimpinellifolium UPV16991. S’ha comprovat que la resistència parcial a TYLCV de la línia L102 està controlada per un gen amb recessivitat parcial i penetració incompleta. A més, l’expressió de la mateixa depén considerablement del fons genètic de S. lycopersicum en el que s’introgresa, obtenint-se els majors nivells de resistència en creuaments amb línies vigoroses. Per tot açò, es recomana l’ús d’esta resistència bé en homozigosis en el desenvolupament d’híbrids vigorosos, bé en combinació amb resistència procedent d’altres fonts. En este sentit, es va decidir avaluar la resistència en materials que combinaven el gen Ty-1 i el gen derivat d’UPV16991, ambdós en heterozigosis. El nivell de resistència en estos materials ha sigut superior al mostrat pels heterozigots per a cada un dels gens, i fins i tot en algun cas s’ha superat la resistència dels homozigots per a cada un dels gens. Açò indica que la combinació de la resistència derivada d’UPV16991 amb el gen Ty-1 és l’aproximació més pràctica per a la utilització d’esta resistència, ja que evita la necessitat de fixar el gen de resistència en ambdós parentals. Finalment, per a l’acumulació de resistència de distinta procedència en un mateix material, resulta imprescindible disposar de marcadors moleculars lligats als gens de resistència. S’han descrit alguns marcadors lligats al gen Ty-1, no obstant, la presència del gen Mi, derivat de S. peruvianum, interferix amb els resultats per a estos marcadors, obtenint-se falsos positius. En este treball s’ha identificat un marcador molecular, JB-1, tipus CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic DNA) lligat al gen de resistència Ty-1. La presència del gen Mi, així com introgresions d’altres espècies com S. lycopersicum (abans Lycopersicon esculentum var. cerasiforme), S. habrochaites i S. pimpinellifolium, no interferixen amb els resultats per a este marcador. A més, l’anàlisi de materials amb introgresions de distintes espècies silvestres relacionades amb la tomaca per a diversos marcadors de la regió del Ty-1 ha permés localitzar el marcador CT21, el RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) a partir del qual es va desenvolupar JB-1. / This research was supported by the “Ministerio de Ciencia y Educación”, project number AGL2001-1857-C04-03. / Pérez De Castro, AM. (2007). Mejora genética para la resistencia a los geminivirus tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) y tomato yellow leaf curl sardinia virus (TYLCSV) en tomate [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/135825 / TESIS