Among viral diseases affecting cultivated tomato, Tomato yellow leaf curl disease (TYLCD) is one of the most devastating. This disease is caused by a complex of viruses of which Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) is regarded as the most important species. Current control strategies to fight viral diseases in tomato are mainly based on genetic resistance derived from wild relatives. In the present thesis, resistance derived from S. chilense and S. peruvianum has been exploited in breeding for resistance to TYLCD. In a previous study, TYLCV-resistant breeding lines derived from LA1932, LA1960 and LA1971 S. chilense accessions were developed. Therefore, the first objective of this thesis was to study the genetic control of the resistance derived from these accessions. With this aim, response to viral infection was assayed in segregating generations derived from the aforementioned resistant lines. The results obtained were compatible with a monogenic control of resistance. Resistance levels were higher in LA1960- and LA1971-derived F2 generations, as shown by slighter symptoms in the resistant plants and a higher number of asymptomatic plants compared with the results obtained in the LA1932-derived F2 generation. It is noteworthy that the level of resistance present in our materials is comparable to or even higher than the levels found in tomato lines homozygous for Ty-1. The response in plants heterozygous for the resistance gene was comparable to the response in homozygous plants for all three sources employed. This implies that the resistance genes derived from all three sources seem to be almost completely dominant. This effect was stronger for LA1971-derived resistance. The results were similar when comparing viral accumulation, as was expected, since a positive correlation was found in these families between viral accumulation and symptom scores. This has important implications in breeding, since the resistance will be used mostly for hybrid development. Our second objective was to map the loci associated with the major resistance genes identified. A total of 263 markers were screened, 94 of them being polymorphic between both species. Recombinant analysis allowed the resistance loci to be localized on chromosome 6, in a marker interval of 25 cM. This interval includes the Ty-1/Ty-3 region, where two S. chilense-derived TYLCD resistance loci were previously mapped. In order to test if the resistance genes identified in our populations were allelic to Ty-1 and Ty-3, further fine mapping was carried out. A total of 13 additional molecular markers distributed on chromosome 6 allowed 66 recombinants to be identified, and the resistance region to be shortened to a marker interval of approximately 950 kb, which overlaps with the Ty-1/Ty-3 region described previously by other authors. Therefore, the results obtained indicate that closely linked genes or alleles of the same gene govern TYLCV resistance in several S. chilense accessions. The third objective of the present thesis was to start the construction of a set of introgression lines (ILs) derived from Solanum peruvianum accession PI 126944 into the cultivated tomato genetic background. Once this collection of ILs is developed, it will represent a powerful tool for exploiting the resistance to different pathogens found in this particular accession in addition to other possible characters of interest. The starting plant material consisted of several segregating generations that were derived from two interspecific hybrids previously obtained by our group. Many crosses and embryo rescue were required to obtain subsequent generations due to the high sexual incompatibility that exists between tomato and PI 126944. Several mature fruits from the most advanced generations produced a few viable seeds, although embryo rescue was also employed to obtain progeny. As only a few plants were obtained by direct backcrossing, additional crosses were made in order to increase the number of descendants. A high degree of incompatibility was also found in crosses between sib plants. A total of 263 molecular markers were tested in some generations, 105 being polymorphic between tomato and PI 126944. Available generations were genotyped with these polymorphic markers in order to determine which alleles of S. peruvianum were already introgressed. On average, 79, 78 and 84 % of the S. peruvianum genome was represented in the pseudo-F2, pseudo-F4 and pseudo-F5 generations, respectively, for the markers analyzed. A reduction in the S. peruvianum genome was observed in more advanced generations, such as BC1 (56 %), pseudo-F2-BC1 (60 %) and pseudo-F3-BC1 (70 %). A greater reduction was observed in the pseudo-F3-BC2 generation (33 %). As a consequence of the reduction in the S. peruvianum genome, a loss of incompatibility was observed in some cases. The S. peruvianum genome was almost completely represented among the different plants of the most advanced generations. An evaluation for resistance to TYLCD and Tomato spotted wilt virus (TSWV) was carried out in some of the advanced generations, some of which were resistant to one or both viruses. In conclusion, we have conducted a successful and deeper exploitation of two wild species with proved resistance to TYLCD, S. chilense and S. peruvianum, identifying and fine mapping new genes of resistance. / Julián Rodríguez, O. (2014). Exploitation of Solanum chilense and Solanum peruvianum in tomato breeding for resistance to Tomato yellow leaf curl disease [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/36867 / TESIS

The domesticated tomato Solanum lycopersicum (L.), formerly known as Lycopersicon esculentum is a genetically well-studied crop species with high-density linkage and molecular maps based on crosses done between cultivated tomato and its distant related wild species. Wild tomato species harbor a wealth of resistance to many pathogens that have been introgressed into domesticated tomato for genetic control of diseases and pests and for improvement of many agronomic traits. The wild tomato S. peruvianum (L.) is the source of the Sw-5 gene, characterized and mapped to chromosome 9 of the tomato genome and introgressed into elite tomato germplasm, providing resistance to the tospovirus Tomato spotted wilt virus (TSWV). TSWV has been reported to be a major problem for tomato growers in many parts of the world, which in some cases, has resulted in tomato fields having been abandoned for some time. Additionally, there are reports that new races of TSWV have evolved that overcome Sw-5. TSWV replicates in both, plant cells and in the alimentary canal cells of thrips and then transmitted to plants by this insect acting as a vector. Both, TSWV and thrips have co-evolved to infest and infect more than 1090 plants species in over 100 families, thrips becoming resistant to pesticides and easily escaping by hiding deep in plant parts. World trade has disseminated thrips all over the world and environmental pressures have forced TSWV to recombine its RNA to overcome new resistance.

Se determinó la respuesta de resistencia de 10 patrones de tomate a una población avirulenta de Meloidogyne javanica en maceta. Los ensayos se realizaron en primavera, cuando las temperaturas permitían la expresión fenotípica de la resistencia del gen Mi-1 (28˚C), en verano sometidos a altas temperaturas y en campo, exponiéndolos a altas densidades poblacionales del nematodo. A temperaturas inferiores a 28˚C los patrones mostraron gran variabilidad en la respuesta de resistencia que osciló entre alta y moderadamente resistente (PG-76, Gladiator, MKT-410; Brigeor, 42851, 43965, Big Power y He-man), hasta susceptible (Beaufort, Maxifort). Por encima de 28˚C, sólo dos patrones (PG-76 y He-man) inhibieron la reproducción del nematodo. Frente a distintas poblaciones de M. arenaria, M. incognita y M. javanica, el patrón PG-76, fue altamente resistente a todas las poblaciones, Brigeor osciló entre altamente resistente y moderadamente resistente, mientras que Beaufort y Maxifort mostraron menor resistencia o fueron totalmente susceptibles; además ésta varió en función de la población analizada. Se caracterizó molecularmente el locus Mi-1 en los patrones híbridos y cultivares de tomate estudiados. Se emplearon los marcadores moleculares PM3, PMi y Mi23, específicos para la caracterización del locus Mi en patrones híbridos de tomate (S. lycopersicum × S. habrochaites; S. lycopersicum × S. chilense), mediante PCR. También se realizaron análisis bioinformáticos con marcadores específicos (Mint-up/do, C172, C2S4, IMO-F1/R1, y VIGS) para determinar la presencia del gen Mi-1.2 en dichos patrones. Los resultados mostraron que los marcadores PMi y Mi23 amplifican homólogos del gen Mi-1 en S. chilense, S. habrochaites y S. peruvianum y también en S. lycopersicum (marcador Mi23). El marcador PM3 amplificó el gen Mi-1.2 en Beaufort y Maxifort (S. lycopersicum × S. habrochaites) pero no fue efectivo para los híbridos de S. chilense. El marcador molecular PM3, no pudo determinar la expresión de del gen Mi-1.2 en Beaufort y Maxifort por hallarse fuera de la secuencia codificadora (CDS) del gen. Análisis bioinformáticos indicaron que ningún marcador específico diseñado para el gen Mi-1.2, podía este gen de otros homólogos presentes en S. lypcopersicum y S. peruvianum. El nuevo marcador Pau-Do en combinación con el primer C2S4, amplificaron un fragmento de 1.494 pb en la CDS del gen Mi-1.2 en raíces y hojas de Beaufort y Maxifort. La durabilidad de la resistencia del gen Mi-1 después del cultivo reiterado de patrones de tomate se determinó en ensayos de campo durante tres años consecutivos, empleando PG-76 y Brigeor. El patrón PG-76 fue muy resistente después del 1er ciclo de cultivo, pero mostró resistencia intermedia y suscetibilidad al finalizar el 2o y el 3er año de cultivo, respectivamente. El patrón Brigeor y el cultivar de tomate resistente Monika (control) mantuvieron un nivel de resistencia intermedio al final del 3er cultivo, aunque ensayos posteriores confirmaron la aparición de virulencia. Los resultados mostraron que el cultivo reiterado de patrones de tomate resistentes seleccionó rápidamente aislados virulentos de M. javanica. El fenotipo virulento de estas poblaciones se analizó molecularmente con el marcador MVC, diseñado para distinguir las poblaciones virulentas seleccionadas de Meloidogyne de los aislados naturalmente virulentos. Se analizaron dos poblaciones japonesas seleccionadas de M. incognita y M. javanica, tres poblaciones españolas virulentas seleccionadas, una población naturalmente virulenta y una avirulenta (todas M. javanica). Las muestras de ADN se obtuvieron de individuos juveniles o de hembras adultas y se incluyeron muestras de agua sin nematodos (5 µm filtrada) procedentes del drenaje de una maceta con una planta infectada por una población virulenta japonesa. El marcador MVC amplificó ADN en las muestras de agua pero no en las que sólo contenían ADN de nematodos. Las secuencias de ADN mostraron una estrecha correlación con diversas proteínas de especies de betaproteobacterias. Los experimentos revelaron que el marcador de MVC no está relacionado con un gen de virulencia del nematodo (avr) sino con betaproteobacterias. Finalmente, se estudió la existencia de homólogos del gen Mi en las especies de tomate silvestre Solanum chilense, S. habrochaites, S. peruvianum y S. huaylasense. La respuesta de resistencia de la variedad LA-1358 de S. huaylasense varió en función de la especie del nematodo estudiada: fue resistente frente a M. arenaria y susceptible frente a M. javanica. La reproducción de M. incognita fue muy variable y no difirió de la reproducción alcanzada en los dos cultivares empleados como controles. / The response of 10 Mi-1 tomato rootstocks to a Mi-avirulent population of M. javanica was determined in pot tests conducted in a greenhouse in spring when temperatures remained below the Mi-1 functionality resistance threshold (28 ˚C), and in summer when daily temperatures exceeded the Mi-1 expression threshold. Rootstocks were also evaluated in the field exposing them to high population densities of the nematode. Results on infectivity and reproduction below 28 ˚C indicated a wide variability in the resistance response of the rootstocks ranging from highly or intermediate resistance (PG-76, Gladiator, MKT-410; Brigeor, 42851, 43965, Big Power and He-man) to fully susceptible (Beaufort and Maxifort). At high temperature conditions, only PG-76 and He-man inhibited the reproduction of M. javanica. Rootstocks PG-76, Brigeor, Beaufort and Maxifort were challenged to different populations of M. arenaria, M. incognita and M. javanica. Rootstock PG-76 was highly resistant to all the populations tested, whereas the response of Brigeor ranged from highly to moderate resistance; the resistance response of rootstocks Beaufort and Maxifort varied according to the population tested. Molecular characterization of the resistance phenotype was performed for all the tomato hybrid rootstocks and cultivars tested. The markers PM3, PMi, Mi23, for the characterization of the Mi-locus of hybrid tomato rootstocks (S. lycopersicum × S. habrochaites and S. lycopersicum × S. chilense) were used for PCR reactions. In silico analyses were done with specific markers for the Mi-1.2 gene (Mint-up/do, C1/2, C2S4, IMO-F1/R1, and VIGS). Markers PMi and Mi23 were polymorphic for the Mi-1 locus in wild Solanum species (S. chilense, S. habrochaites, and S. peruvianum) and for S. lycopersicum (marker Mi23). Marker PM3 detected the Mi-1.2 gene in S. lycopersicum × S. habrochaites hybrid rootstocks, but not in the S. chilense hybrids. As marker PM3 is located outside the coding sequence of the Mi-1.2 gene, expression of this homolog could not be determined in Beaufort and Maxifort. In silico results indicated that none of the available markers for the Mi-1.2 gene could distinguish this homolog from the other Mi-homologs from S. lypcopersicum and S. peruvianum species. A new marker Pau-Do, in combination with C2S4, was designed to amplify in CDS of the Mi-1.2 gene. Amplification with these primers of cDNA from Beaufort and Maxifort indicated that the Mi-1.2 gene was expressed in both rootstocks, despite their susceptible phenotypic response to some Meloidogyne populations. The durability of the Mi-1 gene after repeated cultivation of resistant tomato rootstocks (PG-76 and Brigeor) was determined through field trials during three consecutive years. Rootstock PG-76 responded as highly resistant after the first cropping cycle, although it became fully susceptible after the second and the third cropping cycles. Rootstock Brigeor and the resistant tomato cultivar Monika (control), retained intermediate resistance levels at the end of the third year. Bioassays confirmed that selection of virulence occurred more rapidly in plots with rootstock PG-76 followed by Brigeor and the resistant tomato cultivar Monika. The virulent phenotype of the selected M. javanica populations in the field experiments was determined with MVC molecular marker, designed to distinguish selected from naturally virulent populations of Meloidogyne spp. The populations analyzed included two Japanese selected virulent populations, and the three virulent populations selected in the field trials, and one naturally virulent population and one avirulent population from Spanish. DNA samples were obtained from individual juveniles (J2) or adult females from all the selected virulent populations. Experiments included water samples free of nematodes (5-µm filtered), obtained from the draining-water of a plant infected by a Japanese selected virulent population. Amplification of DNA only occurred in samples of filtered water, but not in those containing only nematode genetic material. Sequencing and BLAST of the DNA fragments amplified by the MVC molecular marker, established a strong correlation of the amplified bands with proteins from betaproteobacteria species Overall, these results showed that the MVC marker is not related to a nematode virulence gene (avr) but to betaproteobacteria. New root-knot nematode resistant Mi-homologs were searched in accessions of the wild Solanum species. The S. huaylasense accession LA-1358 reduced reproduction of a population of M. arenaria to similar levels than the resistant tomato cultivar Anairis. Nevertheless, the resistance response of S. huaylasense accession LA-1358 was also nematode-species specific.

La regeneración de plantas a partir de explantes es la base de partida para poder aplicar tecnologías tales como la obtención de plantas haploides o la transformación genética. Este carácter presenta una amplia variabilidad inter e intraespecífica. Así, incluso dentro de la misma especie, podemos encontrarnos genotipos recalcitrantes cuya falta o escasa regeneración limita la aplicación de estas técnicas. Además del componente genético, otros factores que condicionan el éxito de la regeneración son: las condiciones fisiológicas del material de partida, los componentes del medio de cultivo, los reguladores de crecimiento, la temperatura, la luz, etc¿ La falta de información acerca de qué factores determinan que este proceso se produzca por una u otra vía morfogenética (la vía organogénica o la embriogénica) y la incertidumbre de cuantos genes están implicados, indica la necesidad de investigación básica de este proceso. El objetivo principal de este trabajo se centra en incrementar el conocimiento de la base genética así como la localización de QTLs implicados en la regeneración por la vía organogénica que es la predominante en tomate. Para ello, se han utilizado dos poblaciones de mapeo (F2, BC1) obtenidas por la Dra. Gisbert. La población F2 se obtuvo a partir de la autofecundación de una planta F1, resultante del cruce de una planta de tomate (S. lycopersicum L.) seleccionada por su escasa capacidad regenerativa (Anl27) y la accesión PE-47 de S. pennellii Correll. con alta capacidad de regeneración. Por su parte, la población BC1 se obtuvo a partir del cruce (Anl27 x F1). Con estos materiales se ha realizado una caracterización fenotípica y genotípica en clones de cada genotipo, que se han mantenido en cultivo in vitro. Utilizando el programa informático MapQTL¿ se han identificado seis QTL implicados en la regeneración localizados en los cromosomas 1, 3, 4, 7 y 8. Cinco de los QTLs (SpRg-1, Rg-3, SpRg-4a, SpRg- 4b, SpRg-7) proceden del tomate silvestre S. pennellii y uno (SlRg-8) procede de S. lycopersicum. El porcentaje de varianza explicada por cada QTL va desde el 7,4% al 27%, dentro del rango común (6-26%) registrado en el mapeo genético de QTLs relacionados con la regeneración in vitro en otros cultivos. SpRg-1 es el mayor responsable de la respuesta morfogenética mientras que SpRg-7 promueve el desarrollo del brote hacia una planta completa. Por otra parte los QTLs detectados en los cromosomas 8 (SlRg-8) y 4 (SpRg-4a, SpRg-4b) podrían contener genes que influyen en la formación de yemas y su desarrollo, respectivamente. Finalmente Rg-3, situado en la mitad del cromosoma 3 y ligado al gen de la invertasa ácida, se presenta como un alelo putativo del gen Rg detectado en S. peruvianum (Rg-1) y S. chilense (Dunal) Reiche. (Rg-2). Además del genotipo, el tipo y combinación de reguladores de crecimiento son importantes para el éxito de los protocolos de regeneración. En tomate, los reguladores de crecimiento más utilizados son las citoquininas, o la combinación de estas con auxinas. Otros reguladores como el etileno se han estudiado poco y los trabajos publicados muestran conclusiones dispares. Con el fin de estudiar la influencia del etileno en la regeneración se han realizado ensayos con dos compuestos liberadores de etileno (Ácido 1-aminociclopropano-1- carboxílico ¿ACC¿ y ácido 2-Cloroetil fosfónico ¿Ethephon¿) y dos inhibidores de etileno: AgNO3, que inhibe la acción del etileno; y CoCl2, que inhibe la producción de etileno. Los resultados obtenidos muestran que la concentración y el momento de la aplicación son dos factores fundamentales a tener en cuenta para el éxito de la respuesta organogénica. En concreto, la aplicación de inhibidores de etileno y su consecuente disminución tiene un efecto negativo sobre la regeneración en tomate ya que se disminuye y se retrasa la respuesta. Así mismo, las plantas regenerantes obtenidas presentan tamaño reducido, pudiendo aparecer vitrificación y malformaciones. Por otra parte, la suplementación de etileno puede mejorar la regeneración. Así, el número de plantas regeneradas a partir de explantes de S. pennellii se duplicó en los medios con ACC respecto al medio control. Si la aplicación de ACC se realiza tras la inducción de las yemas, pasados 10 días, el rendimiento total será mayor. Este resultado indica que éste compuesto podría ser utilizado para mejorar la regeneración en aquellos genotipos donde una vez formadas las yemas, el desarrollo de estas hacia plantas es el paso limitante. Por otra parte, las plantas regenerantes obtenidas muestran buen desarrollo, por lo que la suplementación de etileno no afecta al posterior crecimiento de las plantas regeneradas. Finalmente se ha estudiado la capacidad organogénica de las especies silvestres de tomate derivadas del complejo S. peruvianum L. sensu lato (s.l.): Solanum arcanum Peralta., Solanum huaylasense Peralta., Solanum corneliomulleri J. F. Macbr. y Solanum peruvianum L. sensu stricto (s.s.). Estas especies pueden tener un papel fundamental en la mejora, sobre todo de resistencias a factores bióticos. Sin embargo, debido a las barreras de hibridación que existen entre éstas y el tomate cultivado, no se han explotado en su totalidad en la mejora del cultivo. Para realizar cruces se ha recurrido a la fusión de protoplastos y el rescate de embriones. Sin embargo, no se ha estudiado la capacidad organogénica de las especies derivadas del complejo Peruvianum, lo que limita la aplicación de estas técnicas. En este trabajo se ha encontrado variabilidad intra e interespecífica en la capacidad organogénica de las especies silvestres derivadas de este complejo. En general, todas las accesiones ensayadas de S. corneliomulleri y S. huaylasense mostraron una elevada capacidad regenerativa y se han identificado accesiones recalcitrantes en S. arcanum (LA-2185) y S. peruvianum s.s (ECU-106 y CH-20). En este trabajo, también se ha realizado un análisis morfológico de las hojas que ha determinado que el número de foliolos y el nivel de dentición de los mismo pueden ser utilizados en la identificación in vitro de las especies del complejo. Sin embargo, el área de foliolo solo permite distinguir a S. arcanum del resto de especies del complejo. Finalmente se ha observado que las accesiones cuyas hojas tienen mayor número de foliolos y mayor nivel de dentición tienen una mayor regeneración. / Trujillo Moya, C. (2013). Estudio de la Capacidad Organogénica en tomate y especies relacionadas: Localización de QTLS implicados y estudio de la influencia del Etileno [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/31665 / TESIS