Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Jorge Mauricio Costa Mondego / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T09:29:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franco_SulamitadeFreitas_M.pdf: 9729318 bytes, checksum: 0c17aa7d5f8dfd63cbc8d23f9259fc83 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Moniliophthora perniciosa é um fitopatógeno de grande importância econômica no Brasil, em especial na região do sul da Bahia, por causar a doença do cacaueiro conhecida como Vassoura de Bruxa. Esse fungo possui um ciclo de vida hemibiotrófico, apresentando duas fases distintas: a primeira biotrófica/parasítica e a segunda saprotrófica/necrotrófica. O banco de dados gerados pelo projeto genoma Vassoura de Bruxa vem sendo estudado com o intuito de desvendar as vias metabólicas utilizadas pelo patógeno na colonização do cacaueiro. Curiosamente, foi verificada a expressão de um gene similar a taumatina pelo fungo. As taumatinas de plantas são expressas durante a resposta hipersensitiva (HR) em interações planta-patógeno, sendo classificadas como PR-5 (pathogenesis related protein). Taumatinas possuem atividade antifúngica e são capazes de clivar ß-glucanas. Uma nova função foi descrita para uma taumatina de trigo: a de inibição de xilanase. Recentemente, as taumatinas vêm sendo estudadas também em nematódeos, artrópodos e fungos. O trabalho aqui descrito visou à clonagem do gene de M. perniciosa similar a taumatinas MpTLP1 e a expressão da proteína recombinante MpTLP1, bem como o estudo da expressão desse gene durante o desenvolvimento de M. perniciosa. Análises de Northern blot mostram que esse gene é induzido quando o fungo é incubado com extrato de cacau e ácido salicílico. Dados de Real time PCR mostram que esse gene é mais expresso na fase biotrófica do fungo. Esses resultados sugerem a participação de MpTLP1 na interação planta-patógeno. MpTLP1 foi expressa em E.coli e renaturada a partir de corpos de inclusão. A proteína renaturada não apresentou atividades antifúngica e ß-glucanolítica. Esses resultados podem ser atribuídos a sua renaturação ineficiente, ou pelas suas diferenças estruturais com relação a outras TLPs com atividade antifúngica e ß-glucanolítica. Algumas características de MpTLP1 podem indicar que essa proteína possa ser um inibidor de xilanase ou de outras enzimas que clivam parede celular. / Abstract: Moniliophthora perniciosa is a phytopatogen that has economical importance in Brazil, particularly in the south of Bahia, because this fungus causes the disease in cacao known as Witches' Broom disease. This fungus is a hemibiotrofic pathogen that has two distinct stages: a biotrophic (or parasitic) and a necrotrophic (or saprotrophic). The database generated by the Witches' Broom genome project has been studied in order to unravel the metabolic pathways used by the pathogen during the colonization of cacao. Curiously, it was detected the expression of a gene similar to thaumatins in M. perniciosa. Plant thaumatins are expressed during hypersensitive responde (HR) in plant pathogen interactions, being classified as PR-5 (pathogenicity related protein class-5). Thaumatins have antifungal and ß-glucanolitic activities. Recently, a new wheat thaumatin-like protein was described as a xylanase inhibitor. Thaumatins from nematodes, arthropods and fungi have also been characterized. This work aimed the cloning of the M. perniciosa thaumatin like-gene MpTLP1, the expression of the recombinant protein MpTLP1, as well as at the characterization of its gene expression during the development of M. perniciosa. Northern blot analysis shows that MpTLP1 expression is induced when the fungus is incubated with cacao extract and salicylic acid. Real time-PCR data show that MpTLP1 is more expressed in the biotrophic stage of the fungus. These results suggest the participation of MpTLP1 in plant-pathogen interaction. MpTLP1 was expressed in E. coli and refolded from inclusion bodies. The refolded protein did not have antifungal or ß- glucanolytic activity. These results can be attributed to an inefficient refolding or to structural differences in relation to other TLPs that have antifungal and ß- glucanolytic activity. Some MpTLP1 features may indicate that this protein inhibits xylanases or other enzymes that cleave cell walls. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Jorge Maurício Costa Mondego / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:53:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franco_SulamitadeFreitas_D.pdf: 3383952 bytes, checksum: e4041edb080f1a645fcbd6eacdc51378 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A cultura do cacau é de grande importância econômica em países produtores da semente e produtores de chocolate, e move um mercado que alcança hoje ao redor de U$ 50 bilhões. As doenças fúngicas são um fator importante na redução de produção de cacau. No Brasil, o principal responsável pela perda na produção é o basidiomiceto Moniliophthora perniciosa, agente etiológico da doença conhecida como vassoura de bruxa, que arrasou a produção brasileira na década de 90. A doença tem como característica a não elicitação de resposta hipersensitiva (HR), o que permite a colonização de tecidos vegetais pelo fungo. HR é uma resposta que desencadeia a indução da expressão de proteínas denominadas PRs (pahtogenesis related), que agem contra patógenos. Entre as PRs encontram-se as PR5, conhecidas como taumatinas. Análise do genoma de M. perniciosa resultou na anotação de 13 genes que codificam proteínas Taumatina- like (MpTLPs). Apesar de serem bem descritas como proteínas antifúngicas em plantas, estudos em fungos basidiomicetos apontam seu envolvimento no remodelamento celular durante a formação cogumelos. M. perniciosa é a espécie de fungo com o maior número de TLPs descritos até o momento, tendo 6 deles organizados em clusters, indicando eventos de duplicação. Análise filogenética revelou uma maior quantidade de TLPs em basidiomicetos, quando comparado a ascomicetos, indicando sua participação na formação de cogumelos. No geral, MpTLPs são transcritas durante a fase de vassoura seca da doença, onde o galho seco está sujeito a infecção de fungos oportunistas, indicado a contribuição dessas proteínas no combate contra esses fungos, além de poder estar participando no desenvolvimento de sua parede para formação de basidiocarpo e na degradação da parede celular da planta. Além das MpTLPs, análise de transcriptoma revelou um total de 35 MpCSEPs (Proteínas Candidatas a Efetores de Patogenicidade Secretados pelo fungo) com valor de RPKM >50 foram identificadas em plantas de cacau infectadas. Esses genes são expressos preferencialmente na fase inicial da doença (Vassoura verde), onde encontramos o fungo ainda em fase biotrófica. Em geral, esses genes codificam proteínas pequenas e ricas em cisteínas que são características típicas de efetores de virulência (AVRs), podendo ser uma evidência de que esses genes codificam potenciais efetores. Após triagem, 16 desses genes foram escolhidos para a caracterização estrutural. Destes, sete foram clonados para expressão de proteína heteróloga, o que resultou ao final do estudo a cristalização de 2 proteínas (MpCSEP 5 e MpCSEP 14). Os cristais obtidos até o momento foram testados em linha de luz MX1 e MX2, mas não apresentou difração e os processos de refinamento dos cristais deverão ser continuados. As proteínas obtidas nesse estudo poderão ser utilizadas em testes enzimáticos em trabalhos futuros, para sua completa caracterização estrutural e funcional / Abstract: The cocoa cultivation have great economic importance in the seed and chocolate producing countries , moving a market that presently reaches around $50 billion. Fungal diseases are the major factor in reducing cocoa production. In Brazil, the main responsible for the production loss is the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, known as the etiological agent of witches' broom disease , which devastated the Brazilian production in the 90's disease. The disease is characterized by not eliciting a hypersensitive response (HR), which allows the plant tissue colonization by the fungus. HR is a response that triggers the induction of the expression proteins called PRs (pahtogenesis related), which act against pathogens. Among the PRs, PR5 are known as thaumatins. M. perniciosa genome analysis resulted in the annotation of 13 genes encoding proteins Thaumatin - like (MpTLPs). Despite being well described as antifungal proteins in plants, fungi basidiomycetes studies suggest its involvement in cellular remodeling during mushroom formation. M. perniciosa fungal is the species with the highest number of TLPs described so far, with 6 of them organized in clusters, indicating duplication events. Phylogenetic analysis revealed a greater number of TLPs in basidiomycetes when compared to ascomycetes, indicating their involvement in the formation of mushrooms. Overall, MpTLPs are transcribed during the dry broom disease, where the dead branch is subject to opportunistic fungal infection, indicating the contribution of these proteins in the fight against these fungi, and can be participating in the development of your wallpaper for training basidiocarp and in the cell wall degradation of the plant. Besides MpTLPs, transcriptome analysis revealed a total of 35 MpCSEPs (candidate secreted effectors of pathogenicity protein by the fungus) with RPKM value > 50 have been identified in infected cocoa plants. These genes are preferentially expressed in the early phase of the disease (Green Broom), where we found the fungus still in biotrophic phase. In general, these genes encode small and rich in cysteine that are typical characteristics of virulence effector (AVRs) proteins, which can be evidence that these genes encode potential effectors. After screening, 16 of these genes were chosen for structural characterization. Of these, seven were cloned for expression of heterologous protein, resulting at the end of the study the crystallization of 2 proteins (MpCSEP 5 and 14). The crystals obtained so far been tested in MX1 and MX2 light line, but showed no diffraction and processes of crystals refinement should continue. The proteins obtained in this study may be used in enzymatic assays in future work to its full structural and functional characterization / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Helena Maria André Bolini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-21T16:30:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cadena_RafaelSilva_D.pdf: 521247 bytes, checksum: 6926f96ecbac6ea3d9d78e69251418c3 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O consumo de frutas e vegetais tem sido associado com a baixa incidência de doenças degenerativas, pois efeitos protetores estão associados com componentes antioxidantes contidos nestes alimentos. Atrelado a isto, o mercado de sucos e néctares de frutas está sob um aumento significativo, o que tem atraído a atenção de agricultores, distribuidores e da indústria deste produto para saciar esta demanda. Entretanto, estes produtos estão associados à alta ingestão de sacarose proveniente da adição em sua elaboração, o que pode acarretar o desenvolvimento de doenças relacionadas ao consumo excessivo de calorias. A partir disto, este estudo objetivou analisar a aplicação de novos edulcorantes de em néctar de manga pelo estudo de perfil sensorial e físico-químico ao longo do tempo de estocagem. Neste estudo foram utilizadas amostras de néctar de manga elaboradas com polpa de manga congelada e água (1:1) adoçadas com sacarose, sucralose, estévia com 97% de rebaudiosídeo, neotame, blend acessulfame-K/sucralose/neotame (100:50:1) e blend taumatina/sucralose (1:1), totalizando 6 amostras. O perfil físico-químico foi determinado por meio da análise de pH, acidez titulável, cor (L*, a*, b*) e sólidos solúveis (ºBrix). A análise sensorial foi composta por testes descritivos, Análise Descritiva Quantitativa (ADQ) e Análise Tempo-intensidade, além de testes afetivos com escala hedônica e escala do ideal. Além destes, para o estabelecimento de equivalência de doçura foi utilizado o teste sensorial Estimação de Magnitude. A análise estatística foi composta por Análise de Variância (ANOVA), Teste de média de Tukey com nível de significância de 5% para as análises físico-químicas, ADQ, análise tempointensidade e teste afetivo com escala hedônica. O teste com escala do ideal foi analisado por distribuição em histogramas e os dados de estimação de magnitude utilizaram regressão linear em sua análise. Os provadores estabeleceram o valor de 6,8% de sacarose como a quantidade ideal para a intensidade de gosto doce. O neotame foi o edulcorante que apresentou maior poder adoçante, sendo 6026 mais doce que a sacarose, seguindo pela sucralose (627), blend taumatina/sucralose (549), blend acessulfame-K/sucralose/neotame (259) e estévia (134). Os testes físico-químicos e, em especial, a ADQ identificaram a sucralose como o edulcorante que melhor substituiu a sacarose, pois foi o aditivo que apresentou o menor número de diferenças em relação à amostra controle. A análise tempo-intensidade e os testes afetivos também identificaram a amostra sucralose com o melhor perfil relacionado ao estímulo gosto doce, com grande semelhança ao ocorrido com a sacarose e sendo esta a amostra com maior grau de aceitação no tempo zero e a única que se manteve desta forma após os 120 dias de estocagem. Em conclusão, a estévia apresentou melhorias em seu perfil quando comparadas a outros estudos, mas ainda abaixo do esperado para um substituinte de sacarose. A taumatina, uma proteína de origem vegetal apresentou bom perfil e é um aditivo que necessita de maiores estudos para melhoria de sua tecnologia. E, por fim, a sucralose, como já afirmado em outros trabalhos, é o edulcorante que melhor substitui a sacarose em sucos tropicais, sem sofrer alterações significativas após processamento térmico e ao longo do tempo de estocagem / Abstract: The consumption of fruits and vegetable has been associated with low incidence of degenerative diseases, because protective effects has been linked with antioxidant compounds contained in these foods. Attached to this, the consumer market of fruit juices and nectars under a significant increase, which has attracted the attention of producers of these products to satisfy this demand. However, these products are associated with the high ingestion of sucrose from de addition in the elaboration, which may result in the development of diseases associated with the high consumption of calorie. From that, this study aimed to analyze the application of high intensity sweeteners in mango nectar by the sensory and physical-chemical profile during the storage time. Mango nectar samples were prepared with unsweetened mango frozen pulp and water (1:1). The samples were sweetened with different high intensity sweeteners and sucrose. The sweeteners were: Neotame; Sucralose; Stevia with 97% of Rebaudioside; 1:1 Thaumatin/Sucralose blend; 100:50:1 Acesulfame-K/Sucralose/Neotame blend. The physical-chemical profile was determined by: pH, titratable acidity, color (L*, a*, b*), solids soluble (ºBrix). The sensory analysis was composed by descriptive analysis, Quantitative Descriptive Analysis (QDA) and Time-intensity Analysis (T-I), also consumer test with hedonic scale e just-about-right (JAR) scale. Magnitude estimation method was applied to establish the relative sweetness with sucrose. Statistical analysis was composed by analysis of variance and Tukey means test with 5% of significant level to physical-chemical, QDA, T-I analysis, and consumer test. The JAR scale test was analyzed by histograms distribution and the results of magnitude estimation method through linear regression. The ideal sweetness analysis revealed that 6.8% was the ideal concentration of sucrose in the mango nectar. The relative sweetness analysis showed that Neotame presented the highest sweetening power, being 6026 times sweeter than sucrose, followed by Sucralose (627), Thaumatin/Sucralose blend 1:1 (549), Acesulfame-K/Sucralose/Neotame blend 100:50:1 (259) and Stevia (134). The physical-chemical analysis and, in special, the QDA identified sucralose as the best sweetener which best sucrose substitutes, since this additive presented less differences in relation to control sample. T-I analysis and consumers test also identified the sample sucralose with best profile in relation to the sweet stimulus, with great similarity to control sample and being the sample with higher acceptability in initial time and the only one that has remained this way after 120 days of storage. In conclusion, the stevia presented improvements in its sensory profile when compared with others studies,although still lower than expected to a sucrose substitute. The thaumatin, a vegetal protein, presented good sensory profile and is a additive that requires more studies to improve its knowledges. The sucralose, as founded in other studies, is the sweetener that best replace sucrose in tropical fruit juice, with no significant change after heat treatment and during the storage time / Doutorado / Consumo e Qualidade de Alimentos / Doutor em Alimentos e Nutrição