Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T08:30:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zaparoli_GustavoHenriqueAlcala_M.pdf: 1165845 bytes, checksum: 3216f460da7ecd604e45a6b880dd2d75 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O fungo basidiomiceto hemibiotrófico Monilophthora perniciosa é o agente causador da doença Vassoura-de-Bruxa em cacaueiros. A infecção é caracterizada pela hipertrofia e hiperplasia dos tecidos da planta durante a fase biotrófica do fungo, formando as denominadas vassouras-verdes, que sofrem necrose e completa degradação durante a fase saprotrófica do fungo, formando as vassouras-secas. Encontramos no genoma de M. perniciosa pelo menos cinco seqüências codificando possíveis proteínas similares aos membros da família Cerato-platanina, uma classe de proteínas inicialmente encontrada no fitopatógeno Ceratocystis fimbriata. Um dos genes de M. perniciosa cerato-platanina (MpCP1) foi expresso ¿in vitro¿ e mostrou ter capacidade de induzir necrose em folhas de tabaco e cacaueiro. A proteína apresenta-se em solução como um dímero e é capaz de recuperar a capacidade de necrose após tratamento de denaturação térmica. Análises de transcrição ¿ex planta¿ mostraram que MpCP1 é mais expresso no micélio biotrófico do que no saprotrófico. O perfil de necrose apresentado é diferente do causado pelas MpNEPs (outra família de elicitores presente em M. perniciosa), mas quando aplicadas em conjunto nas plantas, MpCP1 e MpNEP2 apresentam um efeito sinergético muito semelhante ao encontrado em plantas naturalmente infectadas pelo fungo / Abstract: The hemibiotrophic basidiomycete Moniliophthora perniciosa is the causal agent of the Witches¿ Broom Disease of cacao. The infection in pod is characterized by the formation of hypertrophic and hyperplasic tissues in the biotrophic phase, forming the green broom, which is followed by necrosis and complete degradation of the organ, causing the dry broom. We found in the fungus genome at least five sequences encoding putative proteins similar to cerato-platanin-like proteins, a class of proteins initially found in the phytopathogen Ceratocystis fimbriata. One M. perniciosa cerato-platanin gene (MpCP1) was expressed ¿in vitro¿ and proved to have necrosis inducing ability in tobacco and cacao leaves. The protein is present in solution as dimers and is able to recover necrosis activity after heat treatment. Transcription analysis ¿ex planta¿ showed that MpCP1 is more expressed in biotrophic-like mycelia in comparison to saprotrophic mycelia. The necrosis profile presented is different from that caused by MpNEPs (other family of elicitors also found in M. perniciosa). Most remarkable, mixture of MpCP1 with MpNEP2 led to a synergic necrosis effect very similar to that found in naturally infected plants / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Julio Cezar de Mattos Cascardo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T20:47:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pirovani_CarlosPriminho_D.pdf: 2183526 bytes, checksum: e9f5bfca7c6a1b7ac43410251e61f2d3 (MD5) Previous issue date: 2008 / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

A cultura do cacaueiro (Theobroma cacao L.) na região sul da Bahia foi dizimada com a introdução do fungo Moniliophthora perniciosa. Novas fontes de resistência têm sido buscadas e alternativas são necessárias para assegurar a produção de cultivares considerando a variabilidade genética do patógeno. A descoberta de genes de resistência e de defesa presumíveis a partir de abordagens genômicas impõe a necessidade de estabelecimento de uma plataforma de análise funcional para comprovar a função dos genes identificados e/ou esclarecimento dos mecanismos envolvidos; isto requer o desenvolvimento de métodos de manipulação e/ou inserção de genes, permitindo a superexpressão ou silenciamento de genes de interesse. Os primeiros cacaueiros transgênicos só foram desenvolvidos a poucos anos, e a eficiência do processo ainda é limitada. Há grande influência genotípica na capacidade embriogênica, que reduz a eficiência de obtenção de transgênicos. Micro-Tom tem sido considerado um modelo para pesquisas em tomateiro, sendo uma cultivar miniatura, ciclo de vida curto, porte reduzido e de fácil transformação. MT pode ser usada no estudo da interação com o fungo M. perniciosa, visto a disponibilidade de isolados do biótipo-S que infectam o tomateiro, assim disponibilizando informações dos mecanismos de defesa do T. cacao a M. perniciosa em um menor tempo, suprindo alguns obstáculos encontrados nas características biológicas do cacaueiro. Considerando que durante a patogênese do cacaueiro, M. perniciosa é capaz de desencadear a morte celular programada no tecido infectado, foi analisada a hipótese de que a expressão de genes anti-apoptóticos diminuiria ou minimizaria os efeitos da infecção, permitindo uma menor susceptibilidade. Para tal, foi clonado o gene da proteína Bax-inhibitor-1, que atua como atenuador basal para a progressão da morte celular, e desenvolvida uma construção. Esse gene havia sido detectado numa biblioteca da interação M. perniciosa x T. cacao e identificado com sequência completa, e foi re-introduzido em tomateiro e cacaueiro sob controle de promotor constitutivo. Para o modelo genético MT, plantas transgênicas contendo Bax-inhibitor-1, SKP1 e Cafeína sintase foram obtidas. Plantas transgênicas de tomateiro contendo o gene Bax-inhibitor-1 foram inoculadas com M. perniciosa e demonstraram redução no número de plantas sintomáticas (40%), quando comparadas as plantas de MT inoculadas com o mesmo patógeno (83%). Esses dados corroboram com resultados das inoculações com os fungos necrotróficos B. cinerea, S. sclerotium e S. rolfsii, sendo que as plantas transgênicas inoculadas também apresentaram contenção dos sintomas dessas doenças, uma redução de 40% da área de infecção em comparação as plantas de MT infectadas. Desse modo, pode-se concluir que o gene Bax-inhibitor-1 em MT agiu de forma basal na atenuação da progressão da morte celular, reduzindo os sintomas da vassoura-de-bruxa, da mesma forma que esse transgene contribuiu na redução dos sintomas do mofo cinza, mofo branco e murcha-de-esclerócio, por conter o crescimento e desenvolvimento dos fungos inoculados em tomateiro. Foi possível otimizar o protocolo de embriogênese somática e de transformação genética de cacaueiro, o que levou a obtenção de plantas transgênicas contendo a construção Bax-inhibitor-1, confirmadas por RTqPCR. Indicando que a abordagem de transformação de cacaueiro está implementada no laboratório, porém a baixa eficiência do processo e o tempo necessário ainda impedem seu uso em larga escala para análise funcional / The cultivation of cocoa (Theobroma cacao L.) in south Bahia was decimated by the introduction of the fungus Moniliophthora perniciosa. New sources of resistance have been sought and alternatives are needed to ensure the production of cultivars considering the genetic variability of the pathogen. The discovery of genes for resistance and defense presumed from genomic approaches makes it necessary the establishment of a platform to verify the function of identified genes and/or the elucidation of the mechanisms involved; this requires the development of methods for manipulating and/or insertion of genes, allowing overexpressing or silencing of genes of interest. The first transgenic cocoa were only developed a few years ago, and the efficiency of the process is still limited. There is an expressive influence of the embryogenic capacity, which reduces the efficiency of obtaining transgenic plants. The cultivar Micro-Tom (MT) is considered a model for research on tomato, since it has a miniature size, short life cycle, and facile genetic transformation. MT can be used to study the interaction with the fungus M. perniciosa, since isolates of biotype-S are able to infect tomato, thus provinding inferences about defense mechanisms of T. cacao to M. perniciosa in a short time, providing some obstacles encountered in biological characteristics of cocoa. Since during the pathogenesis of cocoa, M. perniciosa is able to trigger programmed cell death in infected tissue, it was analyzed the hypothesis that the expression of anti-apoptotic genes diminish or minimize the effects of infection, allowing less susceptibility. To this end, was cloned the protein Bax-inhibitor-1, which acts as a basal attenuator for the progression of cell death, was cloned engineered in a vector for genetic transformation. This gene was detected in a library of interaction M. perniciosa x T. cacao and identified with the complete sequence, and was re-introduced into tomato and cocoa under the control of a constitutive promoter. For the genetic model MT, transgenic plants containing Bax-inhibitor-1, SKP1 and Caffeine synthase were obtained. Transgenic tomato plants containing the gene Bax-inhibitor-1 were inoculated with M. perniciosa and demonstrated a reduction in the number of symptomatic plants (40%) compared MT plants inoculated with the same pathogen (83%). These data corroborate results of inoculations with the necrotroph fungi B. cinerea, S. sclerotium e S. rolfsii. Thus, when transgenic plants were inoculated, it was observed a reduction of 40% in the area of infection, compared to infected MT plants. Taken together, the results indicate that the gene Bax-inhibitor-1 acted in the basal attenuation of progression of cell death in MT, reducing the symptoms of the witches\' broom disease, as well as the symptoms of gray mold, white mold and wilt esclerotia. Moreover it was possible to optimize the protocol for somatic embryogenesis and genetic transformation of cocoa, which led to the production of transgenic plants containing the construct Baxinhibitor- 1, confirmed by RT-qPCR. Although, a protocol for cocoa transformation was implemented in the laboratory, its the low efficiency and the time required still prevent its widespread use for functional analysis

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Julio Cezar de Mattos Cascardo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T15:17:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pires_AcassiaBenjamimLeal_D.pdf: 65154157 bytes, checksum: c3cfcffdd310a1f346e0076668837389 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Moniliophthora perniciosa é um basidiomiceto hemibiotrófico patogênico ao cacaueiro e outras espécies vegetais. Sua ação na planta consiste em provocar superbrotamentos, epinastia, hiperplasia e, por fim, necrose de tecidos, que passam a ser a matéria prima para a produção de seus esporos, no interior de estruturas chamadas basidiomatas. A proposta deste trabalho foi entender como o fungo se prepara para a produção de basidiomatas e que genes podem estar relacionados a esse processo. Para isso, foram feitas análises morfológicas do micélio anterior à emergência de basidiomatas com o auxílio de estereomicroscopia, microscopia de luz e microscopia de varredura. As modificações apresentadas pelo micélio antes de sua frutificação mostram um comportamento similar ao de outros Agaricales. Modificações e aspecto das hifas, e a formação de uma camada superficial a partir de fusão de hifas, foram correlacionadas à emergência de primórdios. As fases de nódulo hifal, agregado, primórdio inicial e primórdio diferenciado foram detectadas. A análise morfológica permitiu, também, inferir aspectos morfogenéticos. Para a análise dos genes envolvidos foi feita uma biblioteca de cDNA representativa de toda a fase de frutificação do fungo. Os 2759 ESTs (Expressed Sequence Tags) foram analisados in silico para a busca de genes candidatos. A expressão gênica foi avaliada para alguns ESTs selecionados. Um macroarranjo foi feito com 192 clones e hibridizado com cDNAs obtidos do micélio em momentos anteriores à formação dos basidiomatas. Adicionalmente, doze genes candidatos foram analisados por RT-qPCR. A análise in silico da biblioteca possibilitou a identificação de 1533 unigenes dos 2759 cromatogramas produzidos. Destes, 981 apresentaram similaridade a genes com funções conhecidas e 1374 foram presentes também no genoma de M. perniciosa, indicando que algumas das seqüências sem similaridade nos bancos de dados analisados podem ser genes ainda não descritos em outras espécies. Foram identificados prováveis genes que codificam para hemolisinas, hidrofobinas, citocromo p450 monoxigenase, ciclofilinas, o-merilstigmato oxigenase, dentre outros, comuns em basidiomicetos durante o desenvolvimento de basidiomatas. A análise da abundância de transcritos mostrou 25 genes que tiveram um pico de expressão no micélio com primórdios e 43 mais abundantes nesta mesma fase e também em basidiomatas maduros. Os doze genes analisados por RT-qPCR mostraram perfis mais detalhados de expressão e indicaram a ativação da produção inicial de basidiomatas ainda na fase de micélio rosa avermelhado, coincidindo com os dados morfológicos. As seqüências da biblioteca foram também utilizadas para a identificação de genes no genoma. Cerca de 14.000 genes foram preditos nesse fungo, sendo que os ESTs gerados neste trabalho contribuíram para essa identificação e também para a determinação do padrão de introns do fungo. A identificação de genes presentes nessa fase do ciclo de vida do M. perniciosa abre caminho para estudos genéticos de processos biológicos que levam à frutificação em basidiomicetos. Este é o primeiro estudo morfológico comparando o desenvolvimento inicial de basidiomatas in vivo e in vitro de M. perniciosa e a primeira descrição de genes expressos nessa fase do ciclo de vida fungo. / Abstract: Moniliophthora pemiciosa is a hemibiotrophic basidiomycete that infects cocoa and other plant species. The symptoms in the infected plants range from secondary growth, epinasty, hyperplasia and finally necrosis of tissues. The dead tissues are the raw material to produce spores within structures called basidiomatas. The purpose of this study was to understand how the fungus is preparing itself to produce the reproductive structures (basidiomatas) and which genes are related to that process. Morphological analysis of mycelium prior to emergence of basidiomatas was conduced by stereomicroscopy, light microscopy and scanning electron microscopy. To analyze the genes involved in basidiomata development, RNA from previous and fructification phases in artificial medium were used to create a representative cDNA library of the fungus. The 2759 ESTs (expressed sequence tags) obtained were analyzed in silico searching for candidate genes. The gene expression was evaluated for some selected ESTs. A macroarray analysis was performed with 192 selected clones and hybridized with RNAs extracted from mycelium in different phases during basidiomata formation. In addition, twelve candidate genes were analyzed by RT-qPCR. The morphological changes observed for the mycelium prior fructification show a pattern similar to other members of the order Agaricales. Changes and appearance of hyphae forming a surface layer from the fusion of hyphae were correlated with the emergence of primordia. The stages of nodule hifal, aggregate, initial primordium and differentiated primordium were detected. Morphological analysis has also inferred morphogenetic aspects. The in silico analysis of the library enabled the identification of 1,533 unigenes of 2,759 chromatograms produced. Of these 981 showed similarities to genes with known functions, and 1,374 were also present in the genome of M. perniciosa, indicating that some of the sequences without similarity in the databases can be analyzed genes not yet described. We identified candidate. genes that encode for hemolysin, hydrophobins, P450 monoxygenase, cyclophilin the merilstigmato-oxygenase, among others, also common in fungi during fruiting. The analysis of the abundance of transcripts showed that 25 genes had a peak of expression in mycelium with primordia with 43 and more abundant in this phase and also in mature basidiomatas. The twelve genes analyzed by RT-qPCR showed more detailed profiles of expression and indicated the activation of the initial production of basidiomatas still in reddish pink mycelium, correlates with the morphological data. The sequences of the library were also used to identify genes in the genome. Approximately 14,000 genes were predicted in this fungus, and the ESTs generated here contributed to this identification and also for determining the pattern of the fungus introns. The identification of genes present in this phase of the life cycle of M. perniciosa opens for new possibilities to control the spread of the fungus and also for genetic studies of biological processes that lead to fruiting in basidiomycetes. This is the first morphologic study of comparing both in vivo and in vitro early development of basidiomatas of M. perniciosa and the first description of genes expressed at that stage of the life cycle of this fungus. / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Michel Georges Albert Vincentz, Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Bologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T17:33:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alvim_FatimaCerqueira_D.pdf: 16832247 bytes, checksum: aa55ec0b542b8e84b76a0875bf6604df (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O fungo basidiomiceto hemibiotrófico Moniliophthora perniciosa, agente causal da doença vassoura-de-bruxa (VB) em Theobroma cacao, é o principal patógeno da lavoura cacaueira nas Américas e no Caribe. O presente trabalho apresentou como objetivo primordial identificar proteínas relacionadas com a patogenicidade deste fungo. No primeiro capítulo desta tese foi demonstrado o efeito de diferentes fontes de carbono sobre a morfologia e fisiologia do M, perniciosa. O fungo foi crescido em fontes de carbono fermentáveis e/ou não-fermentáveís. Foram observadas diferenças significativas na morfologia do micélio que se correlacionaram com a fonte de carbono utilizada. Foram observadas também diferenças qualitativas e quantitativas marcantes para as proteínas secretadas (secretoma) pelo micélio. O ensaio biológico efetuado em folhas de Nicotiana tabacum revelou que a capacidade do secretoma em induzir necrose nos tecidos vegetais também diferia em função da fonte de carbono utilizada pelo fungo durante o seu crescimento. O glicerol, como fonte única de carbono, foi identificado como o composto que mais induziu a atividade necrótica do secretoma do patógeno. O nível do chaperone molecular BiP (Binding Protein) em meristema de cacau aumentou em resposta à infiltração do secretoma de M. perniciosa, indicando uma resposta fisiológica do hospedeiro às proteínas secretadas in vitro pelo patógeno. Foi sugerido então que o metabolismo energético de M. perniciosa, dependendo das fontes de carbono aplicadas, resulta em alterações fisiológicas na expressão e secreção de proteínas e que esses efeitos atuam, não apenas afetando o crescimento do fungo, mas também, na capacidade de expressar proteínas de patogenicidade. No segundo capítulo investigamos mais detalhadamente as modificações induzidas por glicerol em M. perniciosa. Inicialmente demonstramos que glicerol induz a secreção de proteínas relacionadas com indução de morte celular especificamente no M. perniciosa dicariótico, tipo celular característico da fase necrotrófica do patógeno. O secretoma induzido por glicerol foi o único capaz de induzir necrose em meristemas de cacau do genótipo resistente a M. perniciosa. Simultaneamente, o glicerol induziu alterações na composição/estrutura da parede celular do micélio tomando-a mais resistente a agentes indutores de estresse em parede celular, como o SDS e vermelho congo. Adicionalmente, o micélio apresentou maior nível de transcritos de catalases, indicando uma maior resistência a estresse oxidativo. Análises em géis bi-dimensionais e fracionamento das amostras em HPLC de alta capacidade, ligados a espectrometria de massas, resultaram na identificação de proteínas secretadas que acumularam especificamente em resposta ao glicerol. Proteases e lipases, enzimas hidrolíticas relacionadas com a patogenicidade em outros fungos hemibiotrdfícos, também apresentaram aumento de atividade em resposta a glicerol. Essas alterações correlacionaram com um aumento no nível de transcritos do gene Rholp-gef, um elemento chave da rota RHOlp GTPase, a qual sabidamente está relacionada a virulência de fungos fitopatogênicos. Análises conduzidas com isolados de M. perniciosa, que apresentaram diferentes graus de patogenicidade em ensaios conduzidos em casa de vegetação, demonstraram que a sensibilidade a glicerol é maior nos genótipos mais patogênicos. Esse estudo ressalta a importância do glicerol como uma molécula chave na interação cacau: M. perniciosa. tipo celular característico da fase necrotrófica do patógeno. O secretoma induzido por glicerol foi o único capaz de induzir necrose em meristemas de cacau do genótipo resistente aM perniciosa. Simultaneamente, o glicerol induziu alterações na composição/estrutura da parede celular do micélio tomando-a mais resistente a agentes indutores de estresse em parede celular, como o SDS e vermelho congo. Adicionalmente, o micélio apresentou maior nível de transcritos de catalases, indicando uma maior resistência a estresse oxidativo. Análises em géis bi-dimensionais e fracionamento das amostras em HPLC de alta capacidade, ligados a espectrometria de massas, resultaram na identificação de proteínas secretadas que acumularam especificamente em resposta ao glicerol. Proteases e lipases, enzimas hidrolíticas relacionadas com a patogenicidade em outros fungos hemibiotróficos, também apresentaram aumento de atividade em resposta a glicerol. Essas alterações correlacionaram com um aumento no nível de transcritos do gene Rholp-gef, um elemento chave da rota RHOlp GTPase, a qual sabidamente está relacionada a virulência de fungos fltopatogênicos. Análises conduzidas com isolados de M. perniciosa, que apresentaram diferentes graus de patogenicidade em ensaios conduzidos em casa de vegetação, demonstraram que a sensibilidade a glicerol é maior nos genótipos mais patogênicos. Esse estudo ressalta a importância do glicerol como uma molécula chave na interação cacau: M. perniciosa / Abstract: The basidiomycete hemibiotrophic fungus Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witches' broom disease in Theobroma cacao, is the major cacao disease pathogen present in the Americas and the Caribbean. A compatible interaction of this fungus with its host comprehends a series of concerted biochemical and molecular events. In the first chapter of the thesis, we performed analyses where quantitative and qualitative relationships were found between secreted proteins and their activity, and the hyphal morphology of Moniliophthora perniciosa. This fungus was grown on fermentable and non-fermentable carbon sources; significant differences in mycelial morphology were observed and correlated with the carbon source. A biological assay performed with Nicotiana tabacum leaves revealed that the necrosis-related activity of extracellular fungal proteins also differed with carbon source. There were clear differences in the type and quantity of the secreted proteins. In addition, the expression of the cacao molecular chaperone BiP (HSP 70) increased after treatment with secreted proteins, suggesting a physiological response to the fungus secretome. We suggest that the carbon source-dependent energy metabolism of M. perniciosa results in physiological alterations in protein expression and secretion; these may affect not only M. perniciosa growth, but also its ability to express pathogenicity proteins. In the second chapter, we showed that glycerol efficiently triggers the production of secreted pathogenicity proteins by M. perniciosa, as revealed by the increased ability of the secreted proteins (secretome) in promoting cell death on Nicotiana benthamiana cell suspensions, N. tabacum leaves and meristems of a resistant cacao genotype, when compared to other carbon sources such as glucose. Simultaneously, glycerol induces cell wall modifications turning hyphae more resistant to inducers of cell wall stress and increasing the resistance of the fungus to oxidative stress. These modifications correlated with the up-regulation of RhoJp-gef, a key element of the RHOlp GTPase pathway that is known to be related to fungal virulence in plants. Two-dimensional gel electrophoresis and high throughput HPLC coupled with mass spectrometry resulted in the identification of secreted proteins that specifically accumulated in response to glycerol. This study highlights the importance of glycerol as a key molecule modulating the fungus-induced pathogenicity / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

A cultura do cacaueiro (Theobroma cacao L.) na região sul da Bahia foi dizimada com a introdução do fungo Moniliophthora perniciosa. Novas fontes de resistência têm sido buscadas e alternativas são necessárias para assegurar a produção de cultivares considerando a variabilidade genética do patógeno. A descoberta de genes de resistência e de defesa presumíveis a partir de abordagens genômicas impõe a necessidade de estabelecimento de uma plataforma de análise funcional para comprovar a função dos genes identificados e/ou esclarecimento dos mecanismos envolvidos; isto requer o desenvolvimento de métodos de manipulação e/ou inserção de genes, permitindo a superexpressão ou silenciamento de genes de interesse. Os primeiros cacaueiros transgênicos só foram desenvolvidos a poucos anos, e a eficiência do processo ainda é limitada. Há grande influência genotípica na capacidade embriogênica, que reduz a eficiência de obtenção de transgênicos. Micro-Tom tem sido considerado um modelo para pesquisas em tomateiro, sendo uma cultivar miniatura, ciclo de vida curto, porte reduzido e de fácil transformação. MT pode ser usada no estudo da interação com o fungo M. perniciosa, visto a disponibilidade de isolados do biótipo-S que infectam o tomateiro, assim disponibilizando informações dos mecanismos de defesa do T. cacao a M. perniciosa em um menor tempo, suprindo alguns obstáculos encontrados nas características biológicas do cacaueiro. Considerando que durante a patogênese do cacaueiro, M. perniciosa é capaz de desencadear a morte celular programada no tecido infectado, foi analisada a hipótese de que a expressão de genes anti-apoptóticos diminuiria ou minimizaria os efeitos da infecção, permitindo uma menor susceptibilidade. Para tal, foi clonado o gene da proteína Bax-inhibitor-1, que atua como atenuador basal para a progressão da morte celular, e desenvolvida uma construção. Esse gene havia sido detectado numa biblioteca da interação M. perniciosa x T. cacao e identificado com sequência completa, e foi re-introduzido em tomateiro e cacaueiro sob controle de promotor constitutivo. Para o modelo genético MT, plantas transgênicas contendo Bax-inhibitor-1, SKP1 e Cafeína sintase foram obtidas. Plantas transgênicas de tomateiro contendo o gene Bax-inhibitor-1 foram inoculadas com M. perniciosa e demonstraram redução no número de plantas sintomáticas (40%), quando comparadas as plantas de MT inoculadas com o mesmo patógeno (83%). Esses dados corroboram com resultados das inoculações com os fungos necrotróficos B. cinerea, S. sclerotium e S. rolfsii, sendo que as plantas transgênicas inoculadas também apresentaram contenção dos sintomas dessas doenças, uma redução de 40% da área de infecção em comparação as plantas de MT infectadas. Desse modo, pode-se concluir que o gene Bax-inhibitor-1 em MT agiu de forma basal na atenuação da progressão da morte celular, reduzindo os sintomas da vassoura-de-bruxa, da mesma forma que esse transgene contribuiu na redução dos sintomas do mofo cinza, mofo branco e murcha-de-esclerócio, por conter o crescimento e desenvolvimento dos fungos inoculados em tomateiro. Foi possível otimizar o protocolo de embriogênese somática e de transformação genética de cacaueiro, o que levou a obtenção de plantas transgênicas contendo a construção Bax-inhibitor-1, confirmadas por RTqPCR. Indicando que a abordagem de transformação de cacaueiro está implementada no laboratório, porém a baixa eficiência do processo e o tempo necessário ainda impedem seu uso em larga escala para análise funcional / The cultivation of cocoa (Theobroma cacao L.) in south Bahia was decimated by the introduction of the fungus Moniliophthora perniciosa. New sources of resistance have been sought and alternatives are needed to ensure the production of cultivars considering the genetic variability of the pathogen. The discovery of genes for resistance and defense presumed from genomic approaches makes it necessary the establishment of a platform to verify the function of identified genes and/or the elucidation of the mechanisms involved; this requires the development of methods for manipulating and/or insertion of genes, allowing overexpressing or silencing of genes of interest. The first transgenic cocoa were only developed a few years ago, and the efficiency of the process is still limited. There is an expressive influence of the embryogenic capacity, which reduces the efficiency of obtaining transgenic plants. The cultivar Micro-Tom (MT) is considered a model for research on tomato, since it has a miniature size, short life cycle, and facile genetic transformation. MT can be used to study the interaction with the fungus M. perniciosa, since isolates of biotype-S are able to infect tomato, thus provinding inferences about defense mechanisms of T. cacao to M. perniciosa in a short time, providing some obstacles encountered in biological characteristics of cocoa. Since during the pathogenesis of cocoa, M. perniciosa is able to trigger programmed cell death in infected tissue, it was analyzed the hypothesis that the expression of anti-apoptotic genes diminish or minimize the effects of infection, allowing less susceptibility. To this end, was cloned the protein Bax-inhibitor-1, which acts as a basal attenuator for the progression of cell death, was cloned engineered in a vector for genetic transformation. This gene was detected in a library of interaction M. perniciosa x T. cacao and identified with the complete sequence, and was re-introduced into tomato and cocoa under the control of a constitutive promoter. For the genetic model MT, transgenic plants containing Bax-inhibitor-1, SKP1 and Caffeine synthase were obtained. Transgenic tomato plants containing the gene Bax-inhibitor-1 were inoculated with M. perniciosa and demonstrated a reduction in the number of symptomatic plants (40%) compared MT plants inoculated with the same pathogen (83%). These data corroborate results of inoculations with the necrotroph fungi B. cinerea, S. sclerotium e S. rolfsii. Thus, when transgenic plants were inoculated, it was observed a reduction of 40% in the area of infection, compared to infected MT plants. Taken together, the results indicate that the gene Bax-inhibitor-1 acted in the basal attenuation of progression of cell death in MT, reducing the symptoms of the witches\' broom disease, as well as the symptoms of gray mold, white mold and wilt esclerotia. Moreover it was possible to optimize the protocol for somatic embryogenesis and genetic transformation of cocoa, which led to the production of transgenic plants containing the construct Baxinhibitor- 1, confirmed by RT-qPCR. Although, a protocol for cocoa transformation was implemented in the laboratory, its the low efficiency and the time required still prevent its widespread use for functional analysis

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Jorge Mauricio Costa Mondego / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T09:29:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franco_SulamitadeFreitas_M.pdf: 9729318 bytes, checksum: 0c17aa7d5f8dfd63cbc8d23f9259fc83 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Moniliophthora perniciosa é um fitopatógeno de grande importância econômica no Brasil, em especial na região do sul da Bahia, por causar a doença do cacaueiro conhecida como Vassoura de Bruxa. Esse fungo possui um ciclo de vida hemibiotrófico, apresentando duas fases distintas: a primeira biotrófica/parasítica e a segunda saprotrófica/necrotrófica. O banco de dados gerados pelo projeto genoma Vassoura de Bruxa vem sendo estudado com o intuito de desvendar as vias metabólicas utilizadas pelo patógeno na colonização do cacaueiro. Curiosamente, foi verificada a expressão de um gene similar a taumatina pelo fungo. As taumatinas de plantas são expressas durante a resposta hipersensitiva (HR) em interações planta-patógeno, sendo classificadas como PR-5 (pathogenesis related protein). Taumatinas possuem atividade antifúngica e são capazes de clivar ß-glucanas. Uma nova função foi descrita para uma taumatina de trigo: a de inibição de xilanase. Recentemente, as taumatinas vêm sendo estudadas também em nematódeos, artrópodos e fungos. O trabalho aqui descrito visou à clonagem do gene de M. perniciosa similar a taumatinas MpTLP1 e a expressão da proteína recombinante MpTLP1, bem como o estudo da expressão desse gene durante o desenvolvimento de M. perniciosa. Análises de Northern blot mostram que esse gene é induzido quando o fungo é incubado com extrato de cacau e ácido salicílico. Dados de Real time PCR mostram que esse gene é mais expresso na fase biotrófica do fungo. Esses resultados sugerem a participação de MpTLP1 na interação planta-patógeno. MpTLP1 foi expressa em E.coli e renaturada a partir de corpos de inclusão. A proteína renaturada não apresentou atividades antifúngica e ß-glucanolítica. Esses resultados podem ser atribuídos a sua renaturação ineficiente, ou pelas suas diferenças estruturais com relação a outras TLPs com atividade antifúngica e ß-glucanolítica. Algumas características de MpTLP1 podem indicar que essa proteína possa ser um inibidor de xilanase ou de outras enzimas que clivam parede celular. / Abstract: Moniliophthora perniciosa is a phytopatogen that has economical importance in Brazil, particularly in the south of Bahia, because this fungus causes the disease in cacao known as Witches' Broom disease. This fungus is a hemibiotrofic pathogen that has two distinct stages: a biotrophic (or parasitic) and a necrotrophic (or saprotrophic). The database generated by the Witches' Broom genome project has been studied in order to unravel the metabolic pathways used by the pathogen during the colonization of cacao. Curiously, it was detected the expression of a gene similar to thaumatins in M. perniciosa. Plant thaumatins are expressed during hypersensitive responde (HR) in plant pathogen interactions, being classified as PR-5 (pathogenicity related protein class-5). Thaumatins have antifungal and ß-glucanolitic activities. Recently, a new wheat thaumatin-like protein was described as a xylanase inhibitor. Thaumatins from nematodes, arthropods and fungi have also been characterized. This work aimed the cloning of the M. perniciosa thaumatin like-gene MpTLP1, the expression of the recombinant protein MpTLP1, as well as at the characterization of its gene expression during the development of M. perniciosa. Northern blot analysis shows that MpTLP1 expression is induced when the fungus is incubated with cacao extract and salicylic acid. Real time-PCR data show that MpTLP1 is more expressed in the biotrophic stage of the fungus. These results suggest the participation of MpTLP1 in plant-pathogen interaction. MpTLP1 was expressed in E. coli and refolded from inclusion bodies. The refolded protein did not have antifungal or ß- glucanolytic activity. These results can be attributed to an inefficient refolding or to structural differences in relation to other TLPs that have antifungal and ß- glucanolytic activity. Some MpTLP1 features may indicate that this protein inhibits xylanases or other enzymes that cleave cell walls. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Jorge Maurício Costa Mondego / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:53:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franco_SulamitadeFreitas_D.pdf: 3383952 bytes, checksum: e4041edb080f1a645fcbd6eacdc51378 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A cultura do cacau é de grande importância econômica em países produtores da semente e produtores de chocolate, e move um mercado que alcança hoje ao redor de U$ 50 bilhões. As doenças fúngicas são um fator importante na redução de produção de cacau. No Brasil, o principal responsável pela perda na produção é o basidiomiceto Moniliophthora perniciosa, agente etiológico da doença conhecida como vassoura de bruxa, que arrasou a produção brasileira na década de 90. A doença tem como característica a não elicitação de resposta hipersensitiva (HR), o que permite a colonização de tecidos vegetais pelo fungo. HR é uma resposta que desencadeia a indução da expressão de proteínas denominadas PRs (pahtogenesis related), que agem contra patógenos. Entre as PRs encontram-se as PR5, conhecidas como taumatinas. Análise do genoma de M. perniciosa resultou na anotação de 13 genes que codificam proteínas Taumatina- like (MpTLPs). Apesar de serem bem descritas como proteínas antifúngicas em plantas, estudos em fungos basidiomicetos apontam seu envolvimento no remodelamento celular durante a formação cogumelos. M. perniciosa é a espécie de fungo com o maior número de TLPs descritos até o momento, tendo 6 deles organizados em clusters, indicando eventos de duplicação. Análise filogenética revelou uma maior quantidade de TLPs em basidiomicetos, quando comparado a ascomicetos, indicando sua participação na formação de cogumelos. No geral, MpTLPs são transcritas durante a fase de vassoura seca da doença, onde o galho seco está sujeito a infecção de fungos oportunistas, indicado a contribuição dessas proteínas no combate contra esses fungos, além de poder estar participando no desenvolvimento de sua parede para formação de basidiocarpo e na degradação da parede celular da planta. Além das MpTLPs, análise de transcriptoma revelou um total de 35 MpCSEPs (Proteínas Candidatas a Efetores de Patogenicidade Secretados pelo fungo) com valor de RPKM >50 foram identificadas em plantas de cacau infectadas. Esses genes são expressos preferencialmente na fase inicial da doença (Vassoura verde), onde encontramos o fungo ainda em fase biotrófica. Em geral, esses genes codificam proteínas pequenas e ricas em cisteínas que são características típicas de efetores de virulência (AVRs), podendo ser uma evidência de que esses genes codificam potenciais efetores. Após triagem, 16 desses genes foram escolhidos para a caracterização estrutural. Destes, sete foram clonados para expressão de proteína heteróloga, o que resultou ao final do estudo a cristalização de 2 proteínas (MpCSEP 5 e MpCSEP 14). Os cristais obtidos até o momento foram testados em linha de luz MX1 e MX2, mas não apresentou difração e os processos de refinamento dos cristais deverão ser continuados. As proteínas obtidas nesse estudo poderão ser utilizadas em testes enzimáticos em trabalhos futuros, para sua completa caracterização estrutural e funcional / Abstract: The cocoa cultivation have great economic importance in the seed and chocolate producing countries , moving a market that presently reaches around $50 billion. Fungal diseases are the major factor in reducing cocoa production. In Brazil, the main responsible for the production loss is the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, known as the etiological agent of witches' broom disease , which devastated the Brazilian production in the 90's disease. The disease is characterized by not eliciting a hypersensitive response (HR), which allows the plant tissue colonization by the fungus. HR is a response that triggers the induction of the expression proteins called PRs (pahtogenesis related), which act against pathogens. Among the PRs, PR5 are known as thaumatins. M. perniciosa genome analysis resulted in the annotation of 13 genes encoding proteins Thaumatin - like (MpTLPs). Despite being well described as antifungal proteins in plants, fungi basidiomycetes studies suggest its involvement in cellular remodeling during mushroom formation. M. perniciosa fungal is the species with the highest number of TLPs described so far, with 6 of them organized in clusters, indicating duplication events. Phylogenetic analysis revealed a greater number of TLPs in basidiomycetes when compared to ascomycetes, indicating their involvement in the formation of mushrooms. Overall, MpTLPs are transcribed during the dry broom disease, where the dead branch is subject to opportunistic fungal infection, indicating the contribution of these proteins in the fight against these fungi, and can be participating in the development of your wallpaper for training basidiocarp and in the cell wall degradation of the plant. Besides MpTLPs, transcriptome analysis revealed a total of 35 MpCSEPs (candidate secreted effectors of pathogenicity protein by the fungus) with RPKM value > 50 have been identified in infected cocoa plants. These genes are preferentially expressed in the early phase of the disease (Green Broom), where we found the fungus still in biotrophic phase. In general, these genes encode small and rich in cysteine that are typical characteristics of virulence effector (AVRs) proteins, which can be evidence that these genes encode potential effectors. After screening, 16 of these genes were chosen for structural characterization. Of these, seven were cloned for expression of heterologous protein, resulting at the end of the study the crystallization of 2 proteins (MpCSEP 5 and 14). The crystals obtained so far been tested in MX1 and MX2 light line, but showed no diffraction and processes of crystals refinement should continue. The proteins obtained in this study may be used in enzymatic assays in future work to its full structural and functional characterization / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Odalys Garcia Cabrera / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T12:21:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zaparoli_GustavoHenriqueAlcala_D.pdf: 22559337 bytes, checksum: f8c948505b53f1b1be80dd4146ce6a2b (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Moniliophthora perniciosa e Moniliophthora roreri são dois fungos basidiomicetos hemibiotróficos que causam as doenças Vassoura-de-Bruxa e Monilíase, respectivamente, em cacaueiros da América Central e do Sul. M. perniciosa ataca meristemas de ramos e frutos em desenvolvimento enquanto M. roreri é capaz de infectar unicamente os frutos, sendo ambas as doenças devastadoras nas plantações afetadas. Nos genomas de M. perniciosa e M. roreri foram encontrados genes que codificam pequenas proteínas secretadas, descritas como efetores, com potencial importância nas interações patógenos- planta, entre eles estão membros das famílias de proteínas NEP-1 like proteins (NLPs) e Ceratoplataninas (CP). As NLPs causam necrose após contato com as células planta e em M. perniciosa identificamos uma cópia (MpNEP2) expressa simultaneamente com os sintomas de necrose da doença. MpNEP2 teve sua estrutura resolvida por cristalografia e apresenta semelhanças com citotoxinas. Identificamos aminoácidos essenciais à atividade de necrose de MpNEP2, e analisamos sua possível dependência de íons. As CPs são proteínas descritas como elicitores de resposta de defesa em plantas, e nas espécies de Moniliophthora parecem ter uma função relacionada à proteção estrutural durante a doença. Análises de expressão mostraram grande diferença entre as cópias identificadas em M. perniciosa. Através da obtenção e análises das estruturas cristalográficas de quatro cópias de MpCPs sugerimos possíveis funções a essa família durante ambas as doenças. O objetivo principal deste estudo foi a compreensão dos mecanismos de ação destas duas classes de elicitores e sua relação no desenvolvimento de cada uma das doenças / Abstract: Moniliophthora perniciosa and Moniliophthora roreri are two hemibiotrophic fungi that cause Witches' Broom and Frosty Pod Rod Diseases, respectively, in cocoa trees of Central and South America. ...Note: The complete abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T17:23:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_LudimilaDias_M.pdf: 4371531 bytes, checksum: 15deaceac3a09118222822415b70daaf (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O ciclo sexual de basidiomicetos é controlado pelo sistema mating type. Este é formado por dois loci multigênicos não ligados A e B, o locus A codifica duas proteínas homeodomínio HD1 e HD2, capazes de heterodimerização, enquanto o locus B apresenta genes para receptores de feromônio e feromônios. Em fungos heterotálicos, o desenvolvimento sexual depende da especificidade entre os quatro alelos, sistema este chamado tetrapolar, e é ativado apenas por interações específicas entre alelos parentais necessariamente diferentes, assegurando que hifas geneticamente iguais sejam incompatíveis. Em contrapartida, a condição na qual hifas geneticamente iguais são compatíveis é denominada homotalismo. Fungos basidiomicetos são tipicamente heterotálicos, no entanto, apesar de pertencer a este filo, o fitopatógeno Moniliophthora perniciosa, causador da doença Vassoura de Bruxa no cacaueiro, é classificado como homotálico primário. Curiosamente, apesar desta classificação, M. perniciosa contém um sistema genético tetrapolar, sendo o primeiro fungo descrito com essa característica. Neste trabalho, foi realizada a caracterização dos loci mating type em M. perniciosa e verificamos o perfil transcricional destes genes com o objetivo de entender os mecanismos moleculares que atuam no seu comportamento homotálico. Primeiramente, foram identificados no genoma um locus A e um locus B, além de genes atuantes no processamento e sinalização em resposta aos feromônios. O estudo do perfil transcricional destes genes revelou que um receptor tem um perfil de expressão condizente com a fase do ciclo de vida do fungo na qual ocorre o processo de dicariotização. A análise funcional dos receptores foi realizada em um sistema expressão heteróloga, promissor para o estudo de GPCRs (G coupled proteins receptors), porém não permitiu confirmar a presença de alelos compatíveis de receptores e precursores de feromônios no genoma de M. perniciosa como uma possível explicação ao comportamento homotálico. Tendo em vista o locus A, este é formado por um par MpHD1 e MpHD2, o que difere de outros basidiomicetos devido a inserção de uma sequência (11,958kb) interrompendo seus promotores. A hipótese neste cenário é que o transposon encontrado no locus A poderia ter permitido um crossover desigual que trariam genes compatíveis para o mesmo alelo, sendo responsável pelo homotalismo na espécie. Contrariando essa hipótese, os dados obtidos neste projeto indicam que uma possível transição prévia ao homotalismo resultou em uma pressão seletiva relaxada sobre os loci mating type, cuja consequência foi a degeneração nos genes destes loci. Neste contexto, os genes do mating type poderiam não estar mais envolvidos na dicariotização. Este trabalho, portanto, fornece importantes dados para o entendimento da biologia sexual deste fungo, o que futuramente poderá ser correlacionado a sua fitopatogenicidade / Abstract: The basidiomycetes¿ sexual cycle is controlled by the mating type system. The structure of this system comprises two unlinked multigenic loci, A and B. The A locus codes for homeodomain proteins, HD1 e HD2 which form a heterodimer, and B locus presents pheromone receptors and pheromones. In outcrossing (heterothallic) fungi, sexual development depends on the compatibility of four genes in two different allelic versions in a so-called tetrapolar system, and is strictly activated by specific interactions between different parental alleles, ensuring that genetically identical hyphae are incompatible. The phytopathogen Moniliophthora perniciosa causes Witches¿ broom disease in cacao plants, and it is a typical basidiomycete fungi. However, it completes its sexual development through the crossing of genetically identical hyphae, and is the first described homothallic fungi with a complete tetrapolar genetic system. Here we show the characterization of the mating type loci of M. perniciosa and the transcriptional profile of these genes, to uncover the mechanisms underpinning its homothallic behavior. First, we identified an A locus, a B locus and a set of genes that participates in pheromone processing and signalization. Considering the transcriptional profile of these genes, one receptor shows an expression profile consistent with an involvement in dikaryotization. The functional evaluation of the receptors was performed in a heterologous expression system, a promising tool for GPCR (G coupled proteins receptors) proteins study. This system did not allow the confirmation if M. perniciosa contains compatible alleles for receptors and pheromones, one possible explanation for homothallism. Considering A locus, it codes for a pair MpHD1 and MpHD2, which has a sequence insertion (11,958kb) interrupting their promoters, differing from others basidiomycetes. The hypothesis in this scenario is that the insertion of a transposon could have allowed an unequal crossover that brought together compatible genes in the same allele, causing the homothallism in this species. Interestingly, in an opposite direction, our data indicates that a previous transition for homothallism could have resulted in a relaxed selective pressure on mating type loci, with consequences such as the presence of degenerated genes on these loci. In this context, the mating type genes could not necessarily play a role in dikaryotization process. This work provides valuable data for understanding the sexual biology of M. perniciosa, which hereafter could be correlated with its phytopathogenicity / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular