Submitted by Renorbio (renorbioba@ufba.br) on 2017-08-15T14:32:14Z No. of bitstreams: 1 Tese_ Zulane Lima Sousa_ Atividades biológicas de extratos e frações das folhas de Persea americana e Syzygium malaccense_ 2016.pdf: 3239265 bytes, checksum: 5c62167b6ccb9fb8640e54efc7cd1af4 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-08-28T13:56:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_ Zulane Lima Sousa_ Atividades biológicas de extratos e frações das folhas de Persea americana e Syzygium malaccense_ 2016.pdf: 3239265 bytes, checksum: 5c62167b6ccb9fb8640e54efc7cd1af4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-28T13:56:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ Zulane Lima Sousa_ Atividades biológicas de extratos e frações das folhas de Persea americana e Syzygium malaccense_ 2016.pdf: 3239265 bytes, checksum: 5c62167b6ccb9fb8640e54efc7cd1af4 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia – FAPESB / Os produtos naturais são fonte de substâncias biologicamente ativas, especialmente as plantas, as quais passaram por anos de processos adaptativos contra fatores abióticos, como temperaturas extremas, falta de água, luz e nutrientes, assim como fatores bióticos, como insetos e micro-organismos. Esse processo adaptativo permitiu o desenvolvimento de metabólitos secundários que hoje são alvo para o estudo de compostos bioativos. Na área médica, a necessidade de novas drogas antimicrobianas ocorre devido ao crescente número de casos de micro-organismos resistentes às drogas de uso atual, além do que no caso dos antifúngicos, muitos são tóxicos, devido à similaridade de células eucariotas humanas e fúngicas. Na área agronômica, o problema de perda de produção pela ação de fitopatógenos é preocupante, principalmente para aquelas culturas que ainda não têm um método de controle eficaz e humanamente e ambientalmente seguros, como é o caso do cacaueiro (Theobroma cacao Linn.) infectado por Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime and Phillips-Mora, que causa a vassoura de bruxa. Com base nisto, este trabalho foi realizado com o objetivo de buscar substâncias bioativas em extratos das folhas de Persea americana Miller e Syzygium malaccense (L.) Merr. & Perry, plantas já utilizadas na medicina tradicional contra doenças infecciosas. A fração diclorometanólica de P. americana (PAD) apresentou atividade contra M. perniciosa com concentração de 500 µg/mL, apresentando 0,3% de sobrevivência quando comparado ao controle sem tratamento (p<0,05). Através dos estudos realizados, essa ação provavelmente é devida à presença de flavonoides nessa fração, os quais possivelmente agem sobre a membrana plasmática do fungo, levando-o à morte. Já o extrato bruto metanólico de S. malaccense (SMM) apresentou atividade contra Enterococcus faecalis resistente à vancomicina (ATCC 51299) e Staphylococcus aureus multirresistente (ATCC 43300), com concentração inibitória mínima (CIM) de 100 μg/mL. A fração aquosa de S. malaccense (SMA) mostrou atividade contra Candida albicans (CIM = 50 μg/mL) e Candida krusei (CIM = 6,25 μg/mL). A fração etanólica (SME) apresentou atividade contra Candida parapsilosis e C. albicans (CIMs = 100 μg/mL). Dessa maneira, tanto a fração PAD pode ser utilizada como uma alternativa para o controle da vassoura de bruxa, como as frações SMM, SMA e SME podem ser utilizadas para a elaboração de formulações farmacêuticas para o uso terapêutico. / Natural products are sources of biologically active substances, especially plants, which have gone through years of adaptive processes against abiotic factors such as extreme temperatures, and water, light and nutrients lack, as well as biotic factors such as insects and micro-organisms attacks. This adaptive process allowed the development of secondary metabolites that are now targeted for the study of bioactive compounds. In the medical field, the need for new antimicrobial drugs is due to the increasing number of cases of microorganisms resistant to currently useed drugs and in the case of antifungals many are toxic due to the similarity of human and fungal eukaryotic cells. In agronomy, the problem of lost production by plant pathogens action is worrying, especially for those crops that do not yet have an effective control method humanly and environmentally safe, as is the case of the cacao tree (Theobroma cacao Linn.) infected with Moniliophthora pernicious (Stahel) Aime and Phillips-Mora, which causes witches' broom. Based on this, this study was conducted with the objective of seeking bioactive compounds in extracts of Persea americana Miller and Syzygium malaccense (L.) Merr. & Perry leaves, plants already used in traditional medicine against infectious diseases. P. americana dichloromethane fraction (PAD) showed activity against M. perniciosa at concentration of 500 µg/mL, with 0.3% survival when compared to the untreated control (p <0.05). Through studies carried out, this action is probably due to the presence of flavonoids in this fraction, which possibly acts on the plasma membrane of the fungus, leading to death. S. malaccense crude methanol extract (SMM) showed activity against vancomycin-resistant Enterococcus faecalis (ATCC 51299) and multidrug-resistant Staphylococcus aureus (ATCC 43300) with minimum inhibitory concentration (MIC) of 100 µg/mL. The S. malaccense aqueous fraction (SMA) showed activity against Candida albicans (MIC = 50 µg/mL) and Candida krusei (MIC = 6.25 µg/mL). The S. malaccense ethanol fraction (SME) showed activity against Candida parapsilosis and C. albicans (MIC = 100 µg/mL). Thus, the PAD fraction may be used as an alternative for the control of witch's broom, as well as the SMM, SMA and SME fractions can be used for the preparation of pharmaceutical formulations for therapeutic use.

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Johana Rincones Perez / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T10:00:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Thomazella_DanielaPauladeToledo_D.pdf: 8858146 bytes, checksum: ff76b44d2d16f8e757475d68e4fb6c8b (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Moniliophihora perniciosa e Monüiophthora roreri são basidiomicetos fitopatogênicos. causadores de duas das mais devastadoras doenças fúngicas do cacaueiro: a Vassoura de bruxa e a Frosty Pod Rot (Momlíase), respectivamente. Apesar do grande impacto socioeconómico dessas doenças, aspectos importantes relacionados ao metabolismo destes patógenos ainda não são suficientemente compreendidos O estudo do metabolismo mitocondrial é particularmente relevante, pois compreende processos celulares vitais para a sobrevivência do organismo, como a regulação da produção de energia (ATP) e a manutenção do balanço redox da célula. Este trabalho teve como objetivo entender a importância da enzima mitocondrial oxidase alternativa (AOX) no metabolismo e desenvolvimento dos fungos M. perniciosa e M roreri- A AOX é uma oxidase terminal capaz de realizar o transporte de elétrons mitocondrial, catalisando a redução do oxigênio a água, de maneira desacoplada da síntese de ATP. Em M. perniciosa, a expressão do gene aox (Mp-aox) mostrou-se bastante relacionada ao ciclo de vida hemibiotrófico deste fungo. Níveis de expressão relativamente elevados deste gene foram observados no micélio biotrófico cultivado in vitro. De acordo, grande sensibilidade à inibição da via alternativa também foi verificada nesta fase micelial, sugerindo que a AOX tem participação no desenvolvimento deste primeiro estágio de M. perniciosa. Curiosamente, a inibição in vitro da cadeia respiratória principal retardou a transição da fase biotrófica para a necrotrófíca. Além disso, o uso combinado de inibidores da via principal e da AOX resultou em total inibição do desenvolvimento do fungo in vitro como também preveniu o estabelecimento da doença em plântulas de cacau. Com base nesses dados, o presente trabalho sugere um modelo no qual a participação diferencial das vias de transporte de elétrons (principal e alternativa) regula o desenvolvimento do micélio biotrófico e a transição de fase de M. perniciosa. Este é o primeiro trabalho em que se apresentam fortes evidências para uma função da AOX no desenvolvimento in planta e ciclo de vida de um fungo fítopatogênico. Como em M. perniciosa, o gene aox de M. roreri (Mr-aox) foi induzido em resposta ao fungicida azoxistrobina (inibidor do complexo III), sugerindo que a AOX tem participação na proteção do patògeno contra o estresse oxidativo gerado pela inibição da via principal- Apesar da indução do gene Mr-aox, M. roreri mostrou-se consideravelmente sensível ao fungicida. Deste modo, é possível que a ativação da AOX em M. roreri não seja suficiente para contornar os efeitos tóxicos da azoxistrobina e, consequentemente, que este fungo seja mais suscetível ao estresse oxidativo gerado pelo inibidor. Finalmente, a adição conjunta da azoxistrobina com um inibidor da AOX inibiu completamente o desenvolvimento in vitro de M. roreri. Com base nos resultados apresentados, sugere-se que a AOX tenha uma função relevante no metabolismo destes patógenos e que a inibição conjunta das vias principal e alternativa seja uma estratégia em potencial para o controle das doenças Vassoura de bruxa e Frosty PodRot. / Abstract: Moniliophthora perniciosa and Moniliophthora roreri are phytopathogenic basidiomycetes, which cause two of the most devastating fungal diseases of cacao: the Witches' Broom and Frosty Pod Rot diseases, respectively. Despite the great socioeconomic impact of the diseases, important aspects of the metabolism of these pathogens are not sufficiently understood. The mitochondrial metabolism is particularly important since it is associated with many cellular processes of crucial importance for the organism survival, such as the regulation of energy production (ATP) and the maintenance of the cellular redox balance. This study aimed to understand the importance of the mitochondrial enzyme alternative oxidase (AOX) in the metabolism and development of the cacao pathogens M perniciosa and M. roreri. AOX is a non-phosporylating ubiquinol oxidase which catalyzes the reduction of molecular oxygen to water. In M. perniciosa, the expression of aox gene {Mp-aox) was closely related to the hemibiotrophic lifestyle of this fungus. High levels of Mp-aox transcripts were observed in the biotrophic mycelium and, accordingly, it showed an elevated sensitivity to AOX inhibitors, suggesting that AOX has a role in the development of the biotrophic phase. Interestingly, the in vitro inhibition of the cytochrome-dependent pathway prevented the transition from biotrophy to necrotrophy. Furthermore, the combined use of an inhibitor of the cytochrome pathway with an AOX inhibitor completely impaired the in vitro fungal growth as well as prevented the establishment of the disease in cacao seedlings. Based on these data, this study suggests a model in which the involvement of the different pathways of electron transfer (cytochrome and alternative routes) regulates the development of the biotrophic mycelium and the phase transition of M. perniciosa in planta. This is the first report presenting strong evidences for a role of AOX during the in pfanta development and life cycle of a phytopathogenic fijngus. Like M. perniciosa, the aox gene of M. roreri {Mr-aox) is up-regulated after exposure of the fungal mycelium to the fungicide azoxystrobin (a potent inhibitor of complex III}, suggesting that AOX plays a protective role against the deleterious oxidative stress produced by the compound. However, even with the increased expression of Mr-aox, M. roreri growth was highly sensitive to the fungicide. Therefore, it is possible that AOX activation was not enough to overcome the toxic effects of the cytochrome pathway inhibition and, consequently, M. roreri presented a high susceptibility to oxidative stress. Finally, the combined application of azoxystrobin and an AOX inhibitor completely impaired the in vitro development of M. roreri Thus., based on these results, we suggest that AOX has a role in the metabolism of these cacao pathogens and the concomitant inhibition of both cytochrome and alternative pathways may be an efficient strategy for the control of Witches' Broom and Frosty Pod Rot diseases. / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

A doença vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao), causada pelo basidiomiceto Crinipellis perniciosa, levou a total destruição da lavoura sul-baiana, previamente cultivada principalmente com variedades altamente suscetíveis, tornando o Brasil, um país tipicamente exportador de cacau em importador em poucos anos. A perda da resistência do genótipo ?Scavina 6?, única fonte de resistência reconhecida contra C. perniciosa, está associada à variabilidade genética do patógeno. Diante disto, o objetivo deste estudo foi caracterizar a diversidade genética de isolados de C. perniciosa derivados de tecido infectado de Theobroma cacao (vassoura vede), originalmente coletados na Amazônia (Amazonas, Pará e Rondônia), uma região de ocorrência endêmica do fungo, usando marcadores moleculares. A identificação de relações genéticas entre isolados amazônicos e da Bahia e a possível existência de isolados geográficos também foram objetos deste trabalho. Primeiramente, a confirmação de identidade dos isolados Amazônicos foi conduzida usando amplificação e digestão da região ITS do rDNA e marcadores teloméricos. Todos os isolados avaliados foram confirmados como C. perniciosa. O primer telomérico TeloC1, previamente apresentado para discriminar o biótipo C, permitiu a separação do biótipo C dos biótipos S e L, porém, revelou variabilidade genética nos isolados de Cametá, PA e Cacaulândia, RO. Usando marcadores telomérico amplificado com o primer TeloA1R e ERIC, uma grande diversidade foi encontrada para os isolados da Região Amazônica em comparação àqueles da Bahia. Dentro dos isolados Amazônicos, a maior diversidade foi detectada para os isolados de Rondônia (Ji-Paraná, Cacaulândia e Ariquemes) e Pará (Cametá), áreas com 11 ocorrência endêmica ou de instalação histórica (mais de 300 anos) do cacaueiro, respectivamente. Isolados coletados em municípios localizados na regiãoTransamazônica, tais como Anapú, Altamira, Brasil Novo, Medicilândia e Uruará apresentaram maior similaridade com aqueles de Santarém e municípios relacionados à Belém, como Cametá, Baião e Mocajuba. Estes resultados sugerem que isolados da região Transamazônica pode ter sido originados de Belém ou Santarém, Pará. Na Bahia, houve a formação de dois grupos de isolados como previamente demonstrado. Os marcadores moleculares Microssatélites, ERIC e teloméricos foram eficientes na detecção da variabilidade genética em C. perniciosa. A diversidade genética observada auxiliará na identificação e escolha de regiões com maior diversidade de isolados para serem usados na seleção para resistência à vassoura-de-bruxa em programas de melhoramento do cacau / Witches broom disease of cacao (Theobroma cacao L.), caused by the basidiomycete Crinipellis perniciosa, devastated the producing region of Southern Bahia, previously cultivated mainly with highly susceptible cultivars, forcing Brazil, a typical exporter country to become a cocoa importer. The loss of resistance of the genotype ?Scavina 6?, the unique source of resistance against C. perniciosa has been associated with pathogen genetic variability. Thus, the objective of this study was to characterize the genetic diversity of C. perniciosa isolated derived from infected tissues of T. cacao (green-brooms), originally collected in the Amazon (Amazonas, Pará and Rondônia states), a region with endemic occurrence of the fungus, using molecular markers. The identification of the genetic relationships among the Amazonian and Bahian isolates, and the possible existence of geographical isolates were also objectives of this work. First, the identification confirmation of the Amazonian isolates was conducted using amplification and digestion of the ITS region of the rDNA and telomeric markers. All isolates evaluated were confirmed as C. perniciosa. The telomeric primer TeloC1, previously shown to discriminate the C biotype, allowed the separation of biotype C from biotypes S and L, but it revealed genetic diversity for isolates from Cametá, PA and Cacaulândia, RO. Using another telomeric marker amplified with TeloA1 primer and ERIC, a large genetic diversity was detected for isolates from the Amazon in comparison to Bahian. Within the Amazonian isolates, more diversity was detected for isolates from Rondônia (Ji-Paraná, Cacaulândia and Ariquemes) and Pará (Cametá), areas with endemic occurrence of wild cacao or historical introduction and cultivation (over 300 years), respectively. Isolates colletected at the Transamazônica roadway, such as from Anapú, Altamira, Brasil Novo, Medicilândia and Uruará presented more similarity with those from Santarém and locales nearer to Belém, such as Cametá, Baião and Mocajuba. These results suggested that isolates from the Transamazônica region might have originated from Belém or Santarém, Pará. In Bahia, there were two groups of isolates as previously demonstrated. Microsatellite, ERIC and telomeric markers were efficient in detecting the genetic variability of C. perniciosa. The genetic diversity observed will help in identifying and choosing regions with more diverse isolates to be used to screen for witches? broom resistance in cacao breeding programs

O fungo Moniliophthora perniciosa é o agente causal da vassoura de bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao L.). Três biótipos distintos (biótipos -C, -L e -S) são reconhecidos de acordo com a especificidade quanto ao hospedeiro. O presente estudo teve como objetivo a análise da diversidade genética com o uso de marcadores microssatélites de 134 isolados dos biótipos -C, -L e -S de M. perniciosa coletados principalmente na Amazônia Brasileira e áreas de cultivo. A diversidade genética foi associada com virulência e/ou agressividade dos isolados a acessos diferenciais (suscetíveis ou resistentes) de T. cacao. Os biótipos -S e -L apresentaram uma diversidade gênica e genotípica superior em comparação com o biótipo-C. A população do biótipo-C com maior diversidade genotípica foi a do Acre, seguida pelo Oeste do Amazonas, ambas correspondendo a áreas em que se encontra cacaueiro nativo no Brasil. A população com menor diversidade genotípica foi a da Bahia, que corresponde a uma área onde a presença de M. perniciosa foi registrada mais recentemente, no final da década de 1980. Dos 134 isolados, 83 correspondem a genótipos multilocos únicos, sendo encontrados apenas dois indivíduos com genótipos idênticos para o biótipo-S, e nenhum para o biótipo-L. No biótipo-C foram identificados 61 genótipos multilocos em 111 isolados coletados em áreas de ocorrência natural e cultivo de cacau. Os dados de similaridade genética corroboram que o biótipo-C e também o -S que são homotálicos evoluíram de um biótipo heterotálico, possivelmente o biótipo-L. As populações do biótipo-C do estado do Pará e Leste do Amazonas compartilham ancestrais comuns em Ji-Paraná (RO) e Assis Brasil (AC), enquanto que a região sob a influência do rio Amazonas possui outra ascendência, que seria em Atalaia do Norte (Alto Solimões). Os genótipos multilocos da Bahia exibiram origens análogas as da população do Baixo Amazonas, com ascendência em Ji-Paraná (RO) e Alenquer (PA). Na avaliação de agressividade de M. perniciosa, a concentração do inóculo se mostrou determinante para a manifestação dos sintomas, com o aumento de plântulas com sintomas à medida que aumenta a concentração de basidiósporos. Dentre as progênies avaliadas, \'PA 195 x CAB 214\' apresentou menor proporção de plântulas com sintomas. Na inoculação com isolados de M. perniciosa oriundos do Acre e Amazonas, a proporção de plântulas com sintomas foi superior quando inoculadas com o isolado de Tabatinga (AM). O genótipo de cacaueiro que apresentou uma reação diferenciada foi o \'CAB 214\', para o qual nenhuma plântula apresentou sintomas quando inoculada com o isolado de Marechal Thaumaturgo (AC). Com o uso de microssatélites os genótipos multilocos de Tabatinga (AM) e Marechal Thaumaturgo (AC) foram identificados em grupos distintos. Na análise de treze genes de patogenicidade induzidos pela limitada disponibilidade de N, o gene 88KD foi o que demonstrou o maior número de transcritos acumulados. Os isolados que apresentaram uma mesma tendência em seus genes mais expressos foram Tabatinga (AM) e Óbidos (PA) que apesar de possuírem origens geográficas distintas, foram identificados no mesmo grupo na análise com microssatélites / The fungus Moniliophthora perniciosa is the causal agent of witches\'broom in cacao (Theobroma cacao L.). Three different biotypes (C-; S-; and L-biotypes) are recognized according to host specificity. The present study aimed to analyze the genetic diversity using microsatellite markers for 134 isolates of the C-, L- and S- biotypes of M. perniciosa collected mainly in the Brazilian Amazon and areas of cultivation. Genetic diversity was associated with virulence and/or aggressiveness of isolates in differential accesses (susceptible or resistant) of T. cacao. The L- and S- biotypes showed a higher genetic and genotype diversity compared with C-biotype. Of the 134 isolates, 83 corresponded to unique multilocus genotypes, and found only two individuals with identical genotypes for the S-biotype, and none for the L-biotype. In the C-biotype were identified 61 multilocus genotypes in 111 isolates collected in areas of natural occurrence and cultivation of cocoa. The genetic similarity data corroborate that the C- and S- biotypes that are apparently homothallic evolved from a heterothallic biotype, possibly L-biotype. The populations of C-biotype of the state of Para and Amazonas East share common ancestors, in Ji-Paraná (RO) and Assis Brazil (AC), while the region under the influence of the Amazon River has another descent that would be in the Atalaia do Norte (Upper Solimões). The multilocus genotypes from Bahia showed a similar origin of the population of the Lower Amazon, with ancestry in Ji-Paraná (RO) and Alenquer (PA). In the evaluation of aggressiveness of M. perniciosa, the inoculum concentration proved to be decisive for the manifestation of symptoms, with the increase of seedlings with symptoms as increases the concentration of basidiospores. Among the progenies, \'PA 195 x CAB 214\' showed a lower proportion of seedlings with symptoms. In inoculation with M. perniciosa from Acre and Amazonas, the proportion of seedlings with symptoms was higher when inoculated with the isolate from Tabatinga (AM). The genotype of cocoa that had a differentiated reaction was the \'CAB 214\', for which no plants showed symptoms when inoculated with the isolate Marechal Thaumaturgo (AC). With the use of microsatellite, the multilocus genotypes of Tabatinga (AM) and Marechal Thaumaturgo (AC) were identified in different groups. In the analysis of thirteen genes of pathogenicity induced by the limited availability of N, 88KD gene showed the highest number of transcripts. The isolates that showed a similar trend in their more expressed genes were Tabatinga (AM) and Óbidos (PA) that despite having different geographical origins were identified in the same group in the analysis with microsatellite

O fungo Moniliophthora perniciosa é o agente causal da vassoura de bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao L.). Três biótipos distintos (biótipos -C, -L e -S) são reconhecidos de acordo com a especificidade quanto ao hospedeiro. O presente estudo teve como objetivo a análise da diversidade genética com o uso de marcadores microssatélites de 134 isolados dos biótipos -C, -L e -S de M. perniciosa coletados principalmente na Amazônia Brasileira e áreas de cultivo. A diversidade genética foi associada com virulência e/ou agressividade dos isolados a acessos diferenciais (suscetíveis ou resistentes) de T. cacao. Os biótipos -S e -L apresentaram uma diversidade gênica e genotípica superior em comparação com o biótipo-C. A população do biótipo-C com maior diversidade genotípica foi a do Acre, seguida pelo Oeste do Amazonas, ambas correspondendo a áreas em que se encontra cacaueiro nativo no Brasil. A população com menor diversidade genotípica foi a da Bahia, que corresponde a uma área onde a presença de M. perniciosa foi registrada mais recentemente, no final da década de 1980. Dos 134 isolados, 83 correspondem a genótipos multilocos únicos, sendo encontrados apenas dois indivíduos com genótipos idênticos para o biótipo-S, e nenhum para o biótipo-L. No biótipo-C foram identificados 61 genótipos multilocos em 111 isolados coletados em áreas de ocorrência natural e cultivo de cacau. Os dados de similaridade genética corroboram que o biótipo-C e também o -S que são homotálicos evoluíram de um biótipo heterotálico, possivelmente o biótipo-L. As populações do biótipo-C do estado do Pará e Leste do Amazonas compartilham ancestrais comuns em Ji-Paraná (RO) e Assis Brasil (AC), enquanto que a região sob a influência do rio Amazonas possui outra ascendência, que seria em Atalaia do Norte (Alto Solimões). Os genótipos multilocos da Bahia exibiram origens análogas as da população do Baixo Amazonas, com ascendência em Ji-Paraná (RO) e Alenquer (PA). Na avaliação de agressividade de M. perniciosa, a concentração do inóculo se mostrou determinante para a manifestação dos sintomas, com o aumento de plântulas com sintomas à medida que aumenta a concentração de basidiósporos. Dentre as progênies avaliadas, \'PA 195 x CAB 214\' apresentou menor proporção de plântulas com sintomas. Na inoculação com isolados de M. perniciosa oriundos do Acre e Amazonas, a proporção de plântulas com sintomas foi superior quando inoculadas com o isolado de Tabatinga (AM). O genótipo de cacaueiro que apresentou uma reação diferenciada foi o \'CAB 214\', para o qual nenhuma plântula apresentou sintomas quando inoculada com o isolado de Marechal Thaumaturgo (AC). Com o uso de microssatélites os genótipos multilocos de Tabatinga (AM) e Marechal Thaumaturgo (AC) foram identificados em grupos distintos. Na análise de treze genes de patogenicidade induzidos pela limitada disponibilidade de N, o gene 88KD foi o que demonstrou o maior número de transcritos acumulados. Os isolados que apresentaram uma mesma tendência em seus genes mais expressos foram Tabatinga (AM) e Óbidos (PA) que apesar de possuírem origens geográficas distintas, foram identificados no mesmo grupo na análise com microssatélites / The fungus Moniliophthora perniciosa is the causal agent of witches\'broom in cacao (Theobroma cacao L.). Three different biotypes (C-; S-; and L-biotypes) are recognized according to host specificity. The present study aimed to analyze the genetic diversity using microsatellite markers for 134 isolates of the C-, L- and S- biotypes of M. perniciosa collected mainly in the Brazilian Amazon and areas of cultivation. Genetic diversity was associated with virulence and/or aggressiveness of isolates in differential accesses (susceptible or resistant) of T. cacao. The L- and S- biotypes showed a higher genetic and genotype diversity compared with C-biotype. Of the 134 isolates, 83 corresponded to unique multilocus genotypes, and found only two individuals with identical genotypes for the S-biotype, and none for the L-biotype. In the C-biotype were identified 61 multilocus genotypes in 111 isolates collected in areas of natural occurrence and cultivation of cocoa. The genetic similarity data corroborate that the C- and S- biotypes that are apparently homothallic evolved from a heterothallic biotype, possibly L-biotype. The populations of C-biotype of the state of Para and Amazonas East share common ancestors, in Ji-Paraná (RO) and Assis Brazil (AC), while the region under the influence of the Amazon River has another descent that would be in the Atalaia do Norte (Upper Solimões). The multilocus genotypes from Bahia showed a similar origin of the population of the Lower Amazon, with ancestry in Ji-Paraná (RO) and Alenquer (PA). In the evaluation of aggressiveness of M. perniciosa, the inoculum concentration proved to be decisive for the manifestation of symptoms, with the increase of seedlings with symptoms as increases the concentration of basidiospores. Among the progenies, \'PA 195 x CAB 214\' showed a lower proportion of seedlings with symptoms. In inoculation with M. perniciosa from Acre and Amazonas, the proportion of seedlings with symptoms was higher when inoculated with the isolate from Tabatinga (AM). The genotype of cocoa that had a differentiated reaction was the \'CAB 214\', for which no plants showed symptoms when inoculated with the isolate Marechal Thaumaturgo (AC). With the use of microsatellite, the multilocus genotypes of Tabatinga (AM) and Marechal Thaumaturgo (AC) were identified in different groups. In the analysis of thirteen genes of pathogenicity induced by the limited availability of N, 88KD gene showed the highest number of transcripts. The isolates that showed a similar trend in their more expressed genes were Tabatinga (AM) and Óbidos (PA) that despite having different geographical origins were identified in the same group in the analysis with microsatellite

A doença vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao), causada pelo basidiomiceto Crinipellis perniciosa, levou a total destruição da lavoura sul-baiana, previamente cultivada principalmente com variedades altamente suscetíveis, tornando o Brasil, um país tipicamente exportador de cacau em importador em poucos anos. A perda da resistência do genótipo ?Scavina 6?, única fonte de resistência reconhecida contra C. perniciosa, está associada à variabilidade genética do patógeno. Diante disto, o objetivo deste estudo foi caracterizar a diversidade genética de isolados de C. perniciosa derivados de tecido infectado de Theobroma cacao (vassoura vede), originalmente coletados na Amazônia (Amazonas, Pará e Rondônia), uma região de ocorrência endêmica do fungo, usando marcadores moleculares. A identificação de relações genéticas entre isolados amazônicos e da Bahia e a possível existência de isolados geográficos também foram objetos deste trabalho. Primeiramente, a confirmação de identidade dos isolados Amazônicos foi conduzida usando amplificação e digestão da região ITS do rDNA e marcadores teloméricos. Todos os isolados avaliados foram confirmados como C. perniciosa. O primer telomérico TeloC1, previamente apresentado para discriminar o biótipo C, permitiu a separação do biótipo C dos biótipos S e L, porém, revelou variabilidade genética nos isolados de Cametá, PA e Cacaulândia, RO. Usando marcadores telomérico amplificado com o primer TeloA1R e ERIC, uma grande diversidade foi encontrada para os isolados da Região Amazônica em comparação àqueles da Bahia. Dentro dos isolados Amazônicos, a maior diversidade foi detectada para os isolados de Rondônia (Ji-Paraná, Cacaulândia e Ariquemes) e Pará (Cametá), áreas com 11 ocorrência endêmica ou de instalação histórica (mais de 300 anos) do cacaueiro, respectivamente. Isolados coletados em municípios localizados na regiãoTransamazônica, tais como Anapú, Altamira, Brasil Novo, Medicilândia e Uruará apresentaram maior similaridade com aqueles de Santarém e municípios relacionados à Belém, como Cametá, Baião e Mocajuba. Estes resultados sugerem que isolados da região Transamazônica pode ter sido originados de Belém ou Santarém, Pará. Na Bahia, houve a formação de dois grupos de isolados como previamente demonstrado. Os marcadores moleculares Microssatélites, ERIC e teloméricos foram eficientes na detecção da variabilidade genética em C. perniciosa. A diversidade genética observada auxiliará na identificação e escolha de regiões com maior diversidade de isolados para serem usados na seleção para resistência à vassoura-de-bruxa em programas de melhoramento do cacau / Witches broom disease of cacao (Theobroma cacao L.), caused by the basidiomycete Crinipellis perniciosa, devastated the producing region of Southern Bahia, previously cultivated mainly with highly susceptible cultivars, forcing Brazil, a typical exporter country to become a cocoa importer. The loss of resistance of the genotype ?Scavina 6?, the unique source of resistance against C. perniciosa has been associated with pathogen genetic variability. Thus, the objective of this study was to characterize the genetic diversity of C. perniciosa isolated derived from infected tissues of T. cacao (green-brooms), originally collected in the Amazon (Amazonas, Pará and Rondônia states), a region with endemic occurrence of the fungus, using molecular markers. The identification of the genetic relationships among the Amazonian and Bahian isolates, and the possible existence of geographical isolates were also objectives of this work. First, the identification confirmation of the Amazonian isolates was conducted using amplification and digestion of the ITS region of the rDNA and telomeric markers. All isolates evaluated were confirmed as C. perniciosa. The telomeric primer TeloC1, previously shown to discriminate the C biotype, allowed the separation of biotype C from biotypes S and L, but it revealed genetic diversity for isolates from Cametá, PA and Cacaulândia, RO. Using another telomeric marker amplified with TeloA1 primer and ERIC, a large genetic diversity was detected for isolates from the Amazon in comparison to Bahian. Within the Amazonian isolates, more diversity was detected for isolates from Rondônia (Ji-Paraná, Cacaulândia and Ariquemes) and Pará (Cametá), areas with endemic occurrence of wild cacao or historical introduction and cultivation (over 300 years), respectively. Isolates colletected at the Transamazônica roadway, such as from Anapú, Altamira, Brasil Novo, Medicilândia and Uruará presented more similarity with those from Santarém and locales nearer to Belém, such as Cametá, Baião and Mocajuba. These results suggested that isolates from the Transamazônica region might have originated from Belém or Santarém, Pará. In Bahia, there were two groups of isolates as previously demonstrated. Microsatellite, ERIC and telomeric markers were efficient in detecting the genetic variability of C. perniciosa. The genetic diversity observed will help in identifying and choosing regions with more diverse isolates to be used to screen for witches? broom resistance in cacao breeding programs

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 474764 bytes, checksum: dc1db5661d6bff9e0de8af890d4b1836 (MD5) Previous issue date: 2009-07-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Gypsy/Ty3 group retrotransposons are the main transposable elements found in the genome of pathogenic fungi. In this work, two retrotransposons termed MpSaci and Sophie were analyzed in Moniliophthora perniciosa and Cochliobolus heterostrophus, respectively. MpSaci was used to assess molecular markers based on transposable elements IRAP and REMAP. When 70 isolates of M. perniciosa were analyzed, a total of 43 loci were amplified by generating 46.51% polymorphism. Significant differences were found between populations of M. perniciosa divided in relation to biotope and the geographical origin, showing that populations are structured on the geographical origin and the host (biotype). The cluster analysis of different geographical regions of biotype C were observed two large groups that show two main entrances of the pathogen in the state of Bahia. Searches done in the database of the Genome Project of C. heterostrophus (JGI- Genome) showed the presence of DNA sequences with similarity to reverse transcriptase of Class I elements belonging to the group Gypsy/Ty3. Based on these sequences could be found seven different copies of an intact transposable element named Sophie. The analysis of 37 sequences of the reverse transcriptase gene showed a possible silencing mechanism similar to RIP. The seven copies of the element Sophie had 7426 bp 7512 bp. The retrotransposon sequences Sophie has two open reading frames (ORFs) that encode the Gag protein and the Pol polyprotein. The presence of different target sites suggests that Sophie is an element with recent activity in the genome of C. heterostrophus can have a great impact on the evolution of the genome of its host. / Retrotransposons do grupo Gypsy/Ty3 são os principais elementos transponíveis encontrados no genoma de fungos fitopatogênicos. Neste trabalho, dois retrotransposons denominados de MpSaci e Sophie foram analisados em Moniliophthora perniciosa e Cochliobolus heterostrophus, respectivamente. MpSaci foi utilizado para avaliar os marcadores moleculares baseados em elementos transponíveis IRAP e REMAP. Quando 70 isolados de M. perniciosa foram analisados, o total de 43 locos foram amplificados gerando 46,51% de bandas polimórficas. Diferenças significativas foram encontradas entre as populações de M. perniciosas divididas em relação ao biótipo e à origem geográfica, demonstrando que as populações encontram-se estruturadas quanto à origem geográfica e ao hospedeiro (biótipo). Pela análise de agrupamento de diferentes regiões geográficas do biótipo C foram observados dois grandes grupos que evidenciam duas principais entradas do patógeno no estado da Bahia. Buscas feitas no banco de dados do Projeto Genoma de C. heterostrophus (JGI - Genome) revelaram a presença de seqüências de DNA com similaridade a transcriptase reversa de elementos da Classe I pertencentes ao grupo Gypsy/Ty3. Com base nessas seqüências foi possível encontrar sete cópias diferentes e intactas de um elemento transponível que foi denominado Sophie. A análise de 37 seqüências do gene da transcriptase reversa demonstrou possível mecanismo de silenciamento semelhante a RIP. As sete cópias do elemento Sophie apresentaram 7.426 pb a 7.512 pb. O retrotransposon Sophie possui duas seqüências de leitura abertas (ORFs) que codificam a proteína Gag e a poliproteína Pol. A presença de diferentes sítios-alvo sugere que Sophie é um elemento com atividade recente no genoma de C. heterostrophus podendo ter grande impacto na evolução do genoma do seu hospedeiro.

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Jorge Maurício Costa Mondego / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T22:21:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Teixeira_PauloJosePereiraLima_D.pdf: 96794209 bytes, checksum: ecb31f47caf999afd03d8b9da31315f5 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O cacaueiro se destaca como uma das principais culturas perenes na agricultura, sendo economicamente relevante por fornecer a matéria prima para a fabricação do chocolate, um produto que movimenta bilhões de dólares no mercado mundial a cada ano. Apesar de sua importância, o cacaueiro é drasticamente atacado por diversas doenças que diminuem sua produtividade e reduzem a qualidade das amêndoas do cacau. Dentre estas, a vassoura de bruxa, causada pelo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa, é um importante fator limitante da produção cacaueira nas Américas. Utilizando tecnologias de sequenciamento de DNA de nova geração, realizamos uma abrangente análise transcriptômica da vassoura de bruxa neste trabalho. Um banco de dados denominado Atlas Transcriptômico da Vassoura de Bruxa foi construído, o qual compreende aproximadamente 60 bibliotecas de RNA-seq representativas dos mais variados estágios de desenvolvimento, condições de crescimento e respostas a estresse do fungo M. perniciosa sob condições in vitro e in planta. O primeiro capítulo desta tese apresenta uma análise global do Atlas Transcriptômico da vassoura de bruxa. Este conjunto de dados tem suportado uma série de estudos específicos relacionados a variados aspectos da doença, os quais são apresentados e detalhados nos demais capítulos da tese. Notavelmente, uma análise detalhada da interação biotrófica entre o cacaueiro e o fungo M. perniciosa (Capítulo II) revelou a ocorrência de intensa reprogramação transcricional e importantes alterações fisiológicas em plantas infectadas, incluindo a ativação de respostas de defesa ineficientes e a ocorrência de privação de carbono. Curiosamente, um processo de senescência prematura se estabelece no tecido infectado e parece ser um evento central no desenvolvimento da doença, possivelmente disparando o início da fase necrotrófica desta interação planta-patógeno. Ainda, nossos dados também permitiram a identificação de potenciais efetores de virulência em M. perniciosa, como também a caracterização do status metabólico do fungo durante a infecção do cacaueiro. Um modelo detalhado que sumariza os aspectos moleculares da vassoura de bruxa foi elaborado. De maneira geral, o Atlas Transcriptômico da Vassoura de Bruxa representa um importante avanço no estudo desta doença e tem servido como ponto de partida para uma série de estudos adicionais. A utilização destes dados na identificação e caracterização de potenciais fatores de patogenicidade de M. perniciosa (Capítulos III, IV e VI) e de mecanismos de defesa do cacaueiro (Capítulo V) também é apresentada nesta tese / Abstract: Cacao stands out as one of the major perennial crops in the world, being economically relevant as the source of chocolate, a multi-billion dollar product appreciated worldwide. Despite its importance, cacao is seriously affected by several diseases that reduce crop yield and decrease the quality of cocoa beans. Among them, the witches' broom disease (WBD), caused by the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, is a major constraint for cacao production in the Americas. Using next generation sequencing technologies, a comprehensive transcriptomic analysis of WBD was performed. We developed a database named "WBD Transcriptome Atlas", which comprises approximately 60 RNA-seq libraries that represent a wide range of developmental stages, growth conditions and stress responses of the fungus, either under in vitro or in planta conditions. The first chapter of this thesis presents a global analysis of the WBD Transcriptome Atlas. This data set has supported a number of specific analyses related to several aspects of WBD, which are presented and detailed in the other chapters of the thesis. Strikingly, a detailed analysis of the biotrophic interaction between M. perniciosa and cacao (Chapter I) revealed the occurrence of intense transcriptional reprogramming and remarkable physiological alterations in infected plants, including the activation of ineffective defense responses and the occurrence of carbon deprivation. Curiously, a premature senescence process is established in infected tissues and appears to be a central event in WBD, possibly triggering the onset of the necrotrophic stage of this plant-pathogen interaction. Additionally, our data also allowed the identification of potential virulence effectors in M. perniciosa, as well as the characterization of the metabolic status of the fungus during cacao infection. A detailed model summarizing the molecular aspects of WBD is presented. Overall, the WBD Transcriptome Atlas represents an important advance in the study of this disease and constitutes a starting point for a number of additional studies. The use of these data in the identification and characterization of potential pathogenicity factors of M. perniciosa (Chapters III, IV and VI) and defense mechanisms of cacao (Chapter V) will also be presented in this thesis / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Johana Rincones Peres / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T06:30:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barau_JoanGrande_D.pdf: 15458099 bytes, checksum: 72a1f6ed8ef42544b91f989494fb4ce2 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A introdução da doença vassoura de bruxa do cacaueiro no Sul da Bahia representa um dos maiores exemplos da magnitude de impacto sócio econômico que uma fitopatologia pode aflingir a uma região ou país com um predominante perfil agroexportador. Com a execução do projeto genoma do fungo causador da vassoura de bruxa, o Basidiomiceto Moniliopthora perniciosa, uma série de trabalhos de caracterização morfológica, fisiológica e genética da doença foram inciados. Em um primeiro momento, em paralelo com a caracterização das alterações bioquímicas da doença, buscamos entender as diferenças de expressão gênica através de microarranjos de DNA e bibliotecas ESTs comparando as duas fases morfo-genéticas do fungo reproduzidas in vitro. Apesar de esse esforço pioneiro ter permitido a formação de um modelo panorâmico das alterações genéticas do fungo e fornecido importantes diretrizes para a pesquisa futura, ficou claro a necessidade de se explorar em maior detalhe a interação in vivo. Dentre os aspectos importantes investigados, o estudo do metabolismo do glicerol durante a fase biotrófica da interação através de marcadores de expressão mostrou que essa fonte de carbono em potencial pode ter um papel importante no início da infecção e participar da sinalização de stress através da modulação do shuttle mitocondrial de glicerol 3-fosfato. No entanto, a necessidade de se entender melhor o panorama das fontes de carbono disponíveis no apoplasto, o microambiente ocupado pelo fungo nas fases iniciais da interação, nos motivou a caracterizar as alterações nutricionais desse espaço ao longo da doença. Foi possível demonstrar que a vassoura de bruxa quebra o ciclo de carbono normal do apoplasto e que induz o corte da comunicação vascular com as partes sadias da planta ao final da fase biotrófica. Uma correlação entre a sinalização por carbono e a expressão de genes de patogenicidade secundária foi explorada. Com a expansão dos dados de genoma e transcriptoma utilizando sequenciamento de DNA de terceira geração (Illumina e 454 Life Sciences), dezenas de genes-alvo com potencial participação em vias de patogenicidade e desenvolvimento da doença foram identificados. Nesse contexto, dentre as ferramentas para análises de genômica funcional nesse modelo, a inativação ou nocaute de genes por gene targeting e o estudo da atividade de proteínas através de fusões com genes repórteres são essenciais ao teste das hipóteses geradas como fruto da pesquisa genômica da Vassoura-de-bruxa. Transformantes de M. perniciosa carregando uma cópia do gene marcador de autofagia MpATG8 fusionado ao marcador GFP apresentaram um padrão de fluorescência característico da biologia celular de ATG8, permitindo acompanhar o processo de autofagia sob condições de deprivação de nutrientes, demonstrando a possibilidade da aplicação de fusões com repórteres fluorescentes para experimentos de localização subcelular de proteínas desse fitopatógeno. Por fim, uma estratégia baseada na seleção de recombinantes através da técnica split marker em conjunto com um silenciamento transiente do sistema de reparo NHEJ por RNAi foi traçada e executada de modo a obter o nocaute do gene MpKu70, essencial a essa via de reparo, cuja inativação está associada a um aumento da eficiência de recombinação homóloga e gene targeting / Abstract: Cocoa's Witches Broom Disease (WBD) is caused by the hemibiotrophic interaction between the Basidiomycete fungus Moniliopthora perniciosa and plants of Theobroma cacao. One remarkable feature of WBD is its unusual long biotrophic phase in which the fungal growth is restricted to the apoplastic space of plants. We compared differential gene expression between biotrophic and saprotrophic-like hyphae in vitro and proposed based on microarray and EST results that the maintenance of biotrophic-like cultures of M. perniciosa in vitro is subject to Carbon source regulation, especially regarding the use of glycerol as a preferential carbon source for biotrophy. To further gain insight into the carbon source regulation of WBD biotrophic phase in vivo, we characterized glycerol utilization using fungal expression markers during the initial phases of infection. We also characterized the carbon source fluctuations in the apoplast of healthy and infected cocoa seedlings. We showed that healthy cocoa plants possess a rhythmic carbon cycle in the apoplast that is in fine tune with periodical leaf flushing, expansion and photosynthetic maturation. WBD completely disrupts the carbon cycle in the apoplast of infected plants and also arrests leaf photosynthesis at pre sink-to-source transition levels. It was also possible to distinguish two different phases of carbon availability in the apoplast. The two phases correlated with fungal growth rates, the expression of a characterized necrosis inducing gene and the development of a tumor-like callus at the base of infected stems that completely disrupted normal vascular communication between healthy and diseased parts of the plant. A possible correlation between carbon starvation and phase switch from biotrophic to necrotrophic was explored and the evolution of the vascular-disrupting callus was discussed in the view of the tradeoff between the physiological behavior of infected tissues as sinks and the avoidance of nutrient remobilization during infected tissue senescence. Finally, we focused on the development of functional genomic tools for the study of gene function in this pathogen. As a proof-of-concept, we successfully obtained fungal strains expressing the autophagy related gene MpATG8 fused with GFP reporter, in which was possible to visualize the autophagy process in vivo by fluorescence imaging. In addition we also obtained the first successful gene targeting knockout of MpKu70, an M. perniciosa homologous of a gene essential to NHEJ in Eukaryotes. MpKu70 knockouts strains have reported phenotypes of increased homologous recombination, and the M. perniciosa strain may be an important platform for future functional studies of genes important in witches broom disease pathogenesis / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Johana Rincones Pérez / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T12:47:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_BrunoVazde_D.pdf: 5827031 bytes, checksum: c9ff7bf065563150ef6ea14b5630ca52 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa é o agente causador da vassoura-de-bruxa do cacaueiro, doença que se tornou um dos principais problemas fitopatológicos do Brasil. O fungo possui duas fases de vida, biotrófica e necrotrófica, as quais estão associadas aos sintomas de vassoura-verde e vassoura-seca, respectivamente, durante a progressão da doença. Em vista dos grandes prejuízos econômicos causados pela vassoura-de-bruxa, foi iniciado o Projeto Genoma Vassoura-de-Bruxa, cujo objetivo é a decodificação genética do fungo com o intuito de identificar genes candidatos que possam estar relacionados ao estabelecimento e à progressão da doença para serem caracterizados. M. perniciosa é capaz de utilizar metanol como fonte única de carbono. Na maioria dos organismos estudados, a enzima metanol oxidase (MOX) é a responsável pelo metabolismo de metanol através do metabolismo peroxissomal, à qual também está associada uma catalase (CAT). Em plantas, uma das principais fontes de metanol é a pectina presente na estrutura da parede celular vegetal. Algumas espécies de fungos fitopatogênicos tem a capacidade de secretar oxalato como produto da enzima oxaloacetato acetilhidrolase (OAH), o qual é capaz de quelar íons cálcio da estrutura das pectinas, deixando-as vulneráveis ao ataque de enzimas que degradam a parede celular vegetal. Dentre essas enzimas, encontra-se a pectina metilesterase (PME), a qual é capaz de desmetilar as pectinas, liberando metanol. Como M. perniciosa possui em seu genoma sequências com similaridade a mox, cat, pme e oah, formulamos uma hipótese, segundo a qual M. perniciosa seria capaz de degradar o metanol proveniente das pectinas, através de um metabolismo peroxissomal, durante sua interação com o cacau na vassoura-de-bruxa. De fato, M. perniciosa é capaz de secretar oxalato, formando cristais de oxalato de cálcio. Nossos resultados sugerem fortemente que M. perniciosa utiliza o metanol proveniente das pectinas durante a vassoura-de-bruxa; no entanto, esse processo se daria através de um metabolismo extracelular, visto que M. perniciosa produz uma MOX e CAT extracelulares, e não através do metabolismo peroxissomal como inicialmente proposto. Além disso, M. perniciosa possui outras catalases, as quais se apresentam diferencialmente expressas nas diferentes fases do ciclo de vida do fungo e em diferentes estágios da progressão da vassoura-de-bruxa. Por fim, apresentamos uma análise preliminar do secretoma de M. perniciosa / Abstract: The hemibiotrophic basidiomycete fungus Moniliophthora perniciosa is the causal agent of Witches' broom disease (WBD) in cacao. M. perniciosa is classified as a hemibiotrophic pathogen and presents two morphologically distinct life phases, biotrophic and necrotrophic, that are correlated with the green broom and dry broom symptoms, respectively, during the progression of WBD. The introduction of WBD in Bahia, the main Brazilian cacao-producing state, reduced the cacao production drastically and Brazil has become a net importer of cacao in order to supply the national chocolate industry. Due to the extreme losses in cacao production, the Witches' Broom Genome Project was initiated to decode the M. perniciosa genome and, based on the data acquired, select genes that could be relevant during the progression of WBD for characterization. M. perniciosa is able to grow in methanol as the sole carbon source. In methylotrophic yeasts and other methanol-degrading organisms, a methanol oxidase (MOX) is the key enzyme in methanol metabolism and it is also related to a catalase (CAT); both MOX and CAT characterize a peroxisomal metabolism. In plants, one of the main sources of methanol is the pectin present in the plant cell walls. Many phytopathogenic fungal species produce oxalate, a product of the enzyme oxaloacetate acetyl hydrolase (OAH), which removes calcium ions bound to pectin to produce calcium oxalate crystals, thus exposing the host cell walls to plant cell wall-degrading enzymes (PCWD) of fungal origin. One of the main PCWDs is pectin methylesterase (PME), an enzyme that removes the methyl ester radicals from esterified pectin, releasing methanol. As M. perniciosa possesses mox, cat, oah and pme on its genome, we hypothesized that M. perniciosa would utilize a peroxisomal metabolism to metabolize the methanol released from the pectin demethylation in WBD. Indeed, M. perniciosa secretes oxalate, thus producing calcium oxalate crystals. Our data strongly suggest that M. perniciosa able to utilize the methanol released from pectin demethylation; however, this metabolism is probably extracellular due to the presence of secreted MOX and CAT. Moreover, M. perniciosa possesses other cats, which are differentially expressed in vitro and in planta. Finally, we present a preliminary analysis of M. perniciosa secretome / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular