Tedlar™ bags are a promising medium for remote breath collection and later analysis using SIFT-MS for disease diagnosis. It is important to understand the changes in integrity of samples stored in Tedlar™ bags. However, there is little work into this problem completed to date, and thus little known about these issues. Therefore, a study into the integrity of samples stored in Tedlar™ bags and analysed using SIFT-MS was undertaken. The sample integrity of ammonia, acetone, ethanol, isoprene and pentane, all initially at 3ppm in breath and nitrogen substrates, and stored in Tedlar™ bags was investigated. Experiments tested the effect of storage size (0.5, 1, 3L), storage time (6-48 hours), storage temperature (23℃ - 25℃, 37℃), humidity (0.4 - 4.5% absolute) and inter-bag variation using triplicate bags. The SIFT-MS instrument used was LDI2 located at Christchurch Hospital. The repeatability and precision of LDI2 was established using prepared cylinder samples (0.05% absolute humidity) of acetone, pentane and ethanol tested at seven times over a 250 min time period. A generalised Cauchy distribution was used to give a combined distribution from multiple bags for the sample humidity and compound concentration. A combined measure of the repeatability and precision, T s , ranged between 217 - 349 ppb for ethanol, acetone and pentane. The factors affecting the repeatability and precision were both machine and compound dependant. The effect of the factors differed over time, with different precursors and compounds. No obvious effects of bag storage size on the sample integrity of pentane, isoprene, ethanol and acetone were observed. The absolute humidity change within bag samples was linked to the volume to surface area ratio because it was more affected by permeation and condensation. All compounds in the nitrogen substrate (except for 37℃ stored acetone (NO+)) displayed decreases in sample integrity with time. All compounds in the breath substrate displayed regular losses of sample integrity, except for the 37℃ and 23℃ - 25℃ stored ethanol (NO+) and 37℃ stored ethanol (H3O+), pentane (O2+) and ammonia (H3O+, O2+). The average change of sample integrity for pentane, isoprene, ethanol and acetone ranged from 0.2 to 3.6 times the maximum T s , while ammonia ranged from 0.9 - 10 times. All observed behaviour was reproducible. Absolute humidity and storage temperature affected the sample integrity of acetone, ethanol and ammonia. Generally, the intra-bag variance was comparable between all storage temperatures and substrates while the inter-bag variation was affected by the absolute humidity. Only the initial and final concentrations between precursors for the 23℃ - 25℃ stored breath and nitrogen substrates agreed. The breath substrate samples gave erroneous values for ammonia. Permeation of compounds into the bags from the atmosphere was not significant. The overall issues surrounding storing breath in Tedlar™ bags for analysis using SIFTMS is not the loss of sample integrity, but the kinetics, precision and repeatability of the SIFT-MS instrument. The current kinetics are not adequate to accurately monitor acetone, isoprene, pentane, ammonia and ethanol in breath and stored in Tedlar™ bags at breath absolute humidity levels greater than 3%. Generally, the loss of sample integrity was only marginally outside the repeatability and precision of the machine.

Real time detection of Volatile Organic Compounds (VOCs) using Selected Ion Flow Tube – Mass Spectrometry (SIFT-MS) provides a unique opportunity for research into breath testing for clinical diagnosis. However, before engaging in research into breath analytes as markers of disease, appropriate breath collection methods are required. Collection of breath for SIFT-MS instruments fall into two categories, direct breath collection into the instrument and the remote breath collection onto a storage medium. This thesis describes the development and validation of both methods of breath collection equipment for SIFT-MS analysis. Development of the direct breath collection device involved standardising and optimising the way in which breath is sampled by SIFT-MS. Design considerations include ergonomics, patient safety, breathing resistance, materials, and appropriate operating conditions of the device. Results from materials testing showed that all materials emit VOCs and the best approach is to minimise VOC emission by careful material selection. To minimise flow resistance experienced by the patient, the capillary from which the SIFT-MS instrument samples, is placed as close as possible to the users mouth. The optimal operating temperature of the device was found to be 100°C - 120°C, which ensures that water vapour will not condense inside the capillary causing blockage. In order to ensure patient safety the device is adequately insulated using stagnant air which also minimises VOC emission from insulation materials. Because a SIFT-MS instrument is large and cannot be easily shifted around a hospital, a system of remote sample collection is required. It is also important to separately collect and analyse breath from the respiratory alveolar region. For this reason the remote breath collection device designed also fractionates collected breath samples into the breath from the upper airways and alveolar breath. The storage medium chosen for the collected breath samples is a gas sampling bag made from Tedlar™. Collection of breath into Tedlar™ bags allows breath to be stored as a whole air sample, the ideal form for analysis with the SIFT-MS technique. Alveolar breath is fractionated from deadspace gasses by measuring a subject's exhalation and collecting the portion of interest. The breath exhalation is measured by an averaging Pitot tube and pressure transducer. Signal processing and automation of the remote breath collection device is controlled by a Cypress Microsystems PSoC microcontroller. To validate the device isoprene and acetone concentrations in fractionated breath samples were compared with a whole breath sample. Results showed that the alveolar breath fraction had a higher concentration of acetone than the upper airway fraction, indicating that the breath was successfully fractioned. However, isoprene concentrations were lower in both fractions due to hyperventilation of the subject causing a dilution effect of alveolar VOCs. Therefore, a higher sample collection volume is required per exhalation, and regulating subjects' breathing rate will avoid the dilution effect observed in collected breath samples. Overall, this thesis had designed, developed and validated two forms of breath collection systems for use with SIFT-MS technology.

Los insectos saproxílicos, que dependen de la presencia de madera muerta y/o en descomposición, de hongos de la madera, o bien de la presencia de otros organismos saproxílicos, en algún momento de su ciclo vital, desempeñan una función clave para el correcto funcionamiento de los ecosistemas de bosque, actuando como recicladores de los nutrientes contenidos en la madera en descomposición. La diversidad de insectos saproxílicos, y más concretamente de coleópteros, así como la estructura de los ensambles que conforman, se encuentran condicionadas por una serie de variables de carácter físico, químico y biótico. Comprender cómo este amplio conjunto de variables afecta a los patrones espacio-temporales de las comunidades, resulta esencial a la hora de elaborar estrategias de manejo de los ecosistemas, que permitan preservar este tipo de fauna, en muchas ocasiones, amenazada. Con este marco de fondo, el objetivo general de esta tesis doctoral reside en analizar el conjunto de factores ambientales que afectan a la diversidad y a la distribución espacio-temporal de los ensambles de coleópteros saproxílicos que habitan los bosques mediterráneos de roble melojo ubicados en el oeste de la península ibérica para, de este modo, poder proponer una serie de directrices a seguir, a la hora de manejar este tipo de ecosistemas. Este objetivo general se divide en una serie de objetivos específicos, cada uno de los cuales ha derivado en la redacción de un artículo científico y que pueden ser consultados de manera individualizada en los capítulos II, III y IV. En el capítulo II se evaluó la influencia de un total de 24 variables ambientales a nivel de paisaje y a nivel de árbol, muchas de ellas consecuencia del manejo tradicional del bosque en el oeste ibérico por parte del hombre, analizando la riqueza observada de especies y empleando los estimadores de diversidad verdadera. El estudio permitió demostrar que, son muchas las variables que deben ser tenidas en cuenta a la hora de aplicar estrategias de manejo de los ecosistemas forestales y que no todos los métricos empleados para evaluar la diversidad de los ensambles saproxílicos responden de la misma manera frente a esas variables derivadas del manejo. De acuerdo con los resultados obtenidos, es posible establecer una serie de recomendaciones para la gestión forestal de áreas sometidas a técnicas tradicionales de manejo: favorecer en cierta medida la apertura del medio, reducir la carga ganadera y la explotación de madera a nivel vecinal, mantener en el paisaje un elevado volumen de madera en avanzado estado de descomposición, realizar un trasmoche selectivo de cierta cantidad de árboles para acelerar la aparición de oquedades y conservar los denominados “árboles hábitat”, que presenten microhábitats potenciales para este tipo de fauna, ya sean oquedades o tumores. El capítulo III se centró en analizar la posible influencia de los factores abióticos de temperatura y humedad relativa, en los patrones intranuales mostrados por los ensambles de coleópteros saproxílicos que habitan los bosques de roble melojo en la península ibérica, tanto en términos de riqueza como de composición de especies. Además, se abordó el estudio del tamaño corporal, como un rasgo que puede afectar tanto a la fisiología como a la eficacia biológica (fitness) de las especies y que podría explicar, al menos en parte, la dinámica temporal de estos ensambles. Este estudio permitió demostrar que la dinámica temporal de los ensambles de coleópteros saproxílicos que habitan los bosques de roble en el oeste ibérico está condicionada, al menos en gran medida, por las fluctuaciones anuales de las variables abióticas de temperatura y humedad relativa. Considerando el marco actual de calentamiento global, el hecho de conocer cómo ambas variables abióticas afectan a la estructura y diversidad de estos ensambles, permitirá predecir algunas de las consecuencias que el cambio climático puede tener en la distribución temporal de estas comunidades faunísticas. Además, se observó que no todas las especies de coleópteros saproxílicos muestran la misma plasticidad a la hora de adaptarse a esas fluctuaciones de temperatura y que muchas de ellas pueden permanecer activas únicamente bajo un cierto rango térmico. En este sentido, se recomienda profundizar en el estudio de los rangos térmicos de las especies, ya que proporcionará información muy valiosa a la hora de tratar de entender los patrones temporales mostrados por estos ensambles. Finalmente, en el capítulo IV, se estudió la influencia que pueden tener las emisiones de compuestos orgánicos volátiles (COVs) por parte del roble melojo, en los ensambles de coleópteros saproxílicos que emplean esta especie arbórea como planta hospedadora. Para ello, se partió de la premisa de que los árboles añosos (generalmente de mayor tamaño y en un estado de descomposición avanzado) son más visitados por los insectos saproxílicos, que en el caso de los árboles más jóvenes (generalmente de menor porte y en un estado de descomposición nulo o poco avanzado); las emisiones de COVs podrían explicar, al menos en parte, ciertos aspectos de la etología de este grupo de insectos. A pesar de la ausencia de significación estadística, los resultados mostraron una tendencia clara, que indicó que los árboles de mayor porte (árboles añosos, en un estado de descomposición avanzado) emiten este tipo de compuestos con una mayor intensidad que los árboles de menor tamaño. Si tenemos en cuenta, además, que este estudio demostró que los árboles añosos, de mayor perímetro (generalmente en un estado de senescencia más avanzado) albergaron una mayor riqueza de especies de coleópteros saproxílicos, se llega a la conclusión de que la emisión de COVs debe ser tenida en cuenta como una variable más (dentro del amplio conjunto de las ya comentadas en apartados previos), que puede estar condicionando la dinámica espacio-temporal de los ensambles de coleópteros saproxílicos que habitan los bosques de roble melojo en la península ibérica. Este estudio abre una novedosa vía de investigación que permitirá profundizar en el estudio de la relación directa que puede existir entre los compuestos químicos emitidos por los árboles y la fauna saproxílica circundante.