Cette thèse de doctorat s’inscrit dans le cadre de l’étude in silico des relations qui lient la séquence d’une protéine à sa structure, sa stabilité et sa fonction. Elle a pour objectif de permettre à terme la conception rationnelle de protéines modifiées qui restent actives dans des conditions physico chimiques non physiologiques. Nous nous sommes plus particulièrement penchés sur la stabilité thermique des protéines, qui est définie par leur température de fusion Tm au delà de laquelle leur structure n’est thermodynamiquement plus stable. Notre travail s’articule en trois grandes parties : la recherche de facteurs favorisant la thermostabilité des protéines parmi des familles de protéines homologues, la mise sur pied d’une base de données de protéines de structure et de Tm déterminées expérimentalement, de laquelle sont dérivés des potentiels statistiques dépendant de la température, et enfin la mise au point de deux outils bioinformatiques visant à prédire d’une part la Tm d’une protéine à partir de la Tm de protéines homologues et d’autre part les changements de thermostabilité d’une protéine (Tm) engendrés par l’introduction d’une mutation ponctuelle. La première partie a pour objectif l’identification des facteurs de séquence et de structure (e.g. fréquence de ponts salins, d’interactions cation-{pi}) responsables des différentes stabilités thermiques de protéines homologues au sein de huit familles (chapitre 2). La spécificité de chaque famille ne nous a pas permis de généraliser l’impact de ces différents facteurs sur la stabilité thermique des protéines. Cependant, cette approche nous a permis de constater la multitude de stratégies différentes suivies par les protéines pour atteindre une plus grande thermostabilité. La deuxième partie concerne le développement d’une approche originale pour évaluer l’influence de la température sur la contribution de différents types d’interactions à l’énergie libre de repliement des protéines (chapitres 3 et 4). Cette approche repose sur la dérivation de potentiels statistiques à partir d’ensembles de protéines de thermostabilité moyenne distincte. Nous avons d’une part collecté le plus grand nombre possible de protéines de structure et de Tm déterminées expérimentalement, et d’autre part développé des potentiels tenant compte de l’adaptation des protéines aux températures extrêmes au cours de leur évolution. Cette méthode originale a mis en évidence la dépendance en la température d’interactions protéiques tels les ponts salins, les interactions cation-{pi}, certains empilements hydrophobes ... Elle nous a en outre permis de mettre le doigt sur l’importance de considérer la dépendance en la température non seulement des interactions attractives mais également des interactions répulsives, ainsi que sur l’importance de décrire la résistance thermique par la Tm plutôt que la Tenv, température de l’environnement de l’organisme dont elle provient (chapitre 5). La dernière partie de cette thèse concerne l’utilisation des profils énergétiques dans un but prédictif. Tout d’abord, nous avons développé un logiciel bioinformatique pour prédire la thermostabilité d’une protéine sur la base de la thermostabilité de protéines homologues. Cet outil s’est avéré prometteur après l’avoir testé sur huit familles de protéines homologues. Nous avons également développé un deuxième outil bioinformatique pour prédire les changements de thermostabilité d’une protéine engendrés par l’introduction d’une mutation ponctuelle, en s’inspirant d’un logiciel de prédiction des changements de stabilité thermodynamique des protéines développé au sein de notre équipe de recherche. Ce deuxième algorithme de prédiction repose sur le développement d’une grande base de données de mutants caractérisés expérimentalement, d’une combinaison linéaire de potentiels pour évaluer la Tm, et d’un réseau de neurones pour identifier les coefficients de la combinaison. Les prédictions générées par notre logiciel ont été comparées à celles obtenues via la corrélation qui existe entre stabilités thermique et thermodynamique, et se sont avérées plus fiables. Les travaux décrits dans notre thèse, et en particulier le développement de potentiels statistiques dépendant de la température, constituent une nouvelle approche très prometteuse pour comprendre et prédire la thermostabilité des protéines. En outre, nos travaux de recherche ont permis de développer une méthodologie qui pourra être adaptée à l’étude et à la prédiction d’autres propriétés physico chimiques des protéines comme leur solubilité, leur stabilité vis à vis de l’acidité, de la pression, de la salinité ... lorsque suffisamment de données expérimentales seront disponibles.

Lors de leur exploitation et de leur transport, les fluides pétroliers subissent de fortes variations de température et de pression susceptibles d'entraîner la formation de dépôts solides. Pour bien comprendre leur comportement, il est indispensable de disposer de données expérimentales fiables permettant de décrire correctement leur diagramme de phase afin d'élaborer des modèles thermodynamiques prédictifs. Au cours de ce travail, un microscope haute pression a été développé pour combler les insuffisances des techniques existantes dans le domaine des équilibres de phase liquide – solide ; il permet de mesurer la température de fusion finissante de divers types de systèmes dans la gamme 0,1 – 100 MPa pour des températures comprises entre 243 et 373 K. Dans un premier temps, ce dispositif a été mis à contribution pour étudier la variation de la température de fusion de corps purs rencontrés au sein des fluides pétroliers (alcanes linéaires, alkylcyclohexanes et alkylbenzènes) en fonction de la pression et du nombre d'atomes de carbone. Cette étude a révélé une dépendance entre la pente des courbes de liquidus dans un diagramme (T, P) et la structure cristalline du solide considéré. Dans un deuxième temps, les températures de fusion finissante de plusieurs mélanges synthétiques ont été étudiées en fonction de la pression. Une modélisation des résultats a été proposée pour chaque système en tenant compte de l'influence de la structure cristalline sur la pente des courbes de liquidus. Enfin, le dispositif de microscopie sous haute pression a permis l'étude de fluides de gisement et une discussion sur la taille des cristaux qui apparaissent dans de tels systèmes est proposée.

La qPCR est actuellement la technique de référence en matière de quantification d'ADN. Elle peut être définie comme une amplification exponentielle, cyclique et ciblée de la séquence d'ADN cible. Le caractère exponentiel de la qPCR est à la fois à l'origine de la sensibilité de la méthode mais aussi d'une potentielle variabilité inter-échantillons. Cette variabilité est compensée par le caractère cyclique de la méthode qui entraine une synchronisation de la réaction pour tous les échantillons à chaque cycle. L'amplification ciblée de la séquence choisie traduit quand à elle la spécificité de la méthode. Néanmoins, cette dernière propriété de la PCR reste la moins vérifiée. La spécificité de la qPCR est indiscutable lorsque la cible à détecter se trouve en quantité suffisante (>100 copies environ). En revanche, pour des quantités plus faibles ou en présence d'inhibiteurs, la spécificité diminue ou disparaît (limites de détection et de quantification). Cette perte de spécificité retentit de façon significative sur la précision et la reproductibilité du dosage à réaliser. Cependant, si l'hybridation non spécifique est inéluctable dans ces conditions, l'amplification non spécifique consécutive peut être limitée, voire supprimée au moyen d'amorces de PCR soit plus spécifiques, soit moins susceptibles de générer des différences inter-échantillons. La RT-qPCR, grâce à une étape initiale de transcription inverse (conversion d'un ARN en un ADN complémentaire) permet la quantification des ARN. Cependant, la transcription inverse reste moins reproductible que la PCR, générant des différences inter-échantillons délétères en diagnostic comme en recherche. Au cours de ces travaux, je propose des méthodes originales améliorant de façon significative différentes étapes de ces techniques. Premièrement, je propose une amélioration de la standardisation de l'étape de transcription inverse capable de diminuer de façon significative la variabilité inter-échantillons ; l'utilisation d'un volume constant d'extrait d'ARN pour chaque échantillon améliore considérablement la précision de la quantification d'ARN messagers. Deuxièmement, je propose une modification des amorces par incorporation de résidus d'acides nucléiques bloqués (LNA) ; cette modification permet d'augmenter la spécificité des amorces aux limites de la détection. Enfin, je propose une méthode simple et économique permettant la mesure directe de la température de fusion (Tm) dans les conditions réelles de la PCR. Ce paramètre, considéré comme capital pour la réalisation des dosages par qPCR, est généralement obtenu par des méthodes prédictives peu précises. De plus, cette méthode doit permettre de déterminer précisément les paramètres thermodynamiques des amorces (∆G, ∆H et ∆S) et ainsi avoir accès d'une part au pourcentage réel d'amorces hybridées en fonction de la température et d'autre part d'identifier la susceptibilité des amorces aux inhibiteurs.

La qPCR est actuellement la technique de référence en matière de quantification d'ADN. Elle peut être définie comme une amplification exponentielle, cyclique et ciblée de la séquence d'ADN cible. Le caractère exponentiel de la qPCR est à la fois à l'origine de la sensibilité de la méthode mais aussi d'une potentielle variabilité inter-échantillons. Cette variabilité est compensée par le caractère cyclique de la méthode qui entraine une synchronisation de la réaction pour tous les échantillons à chaque cycle. L'amplification ciblée de la séquence choisie traduit quand à elle la spécificité de la méthode. Néanmoins, cette dernière propriété de la PCR reste la moins vérifiée. La spécificité de la qPCR est indiscutable lorsque la cible à détecter se trouve en quantité suffisante (>100 copies environ). En revanche, pour des quantités plus faibles ou en présence d'inhibiteurs, la spécificité diminue ou disparaît (limites de détection et de quantification). Cette perte de spécificité retentit de façon significative sur la précision et la reproductibilité du dosage à réaliser. Cependant, si l'hybridation non spécifique est inéluctable dans ces conditions, l'amplification non spécifique consécutive peut être limitée, voire supprimée au moyen d'amorces de PCR soit plus spécifiques, soit moins susceptibles de générer des différences inter-échantillons. La RT-qPCR, grâce à une étape initiale de transcription inverse (conversion d'un ARN en un ADN complémentaire) permet la quantification des ARN. Cependant, la transcription inverse reste moins reproductible que la PCR, générant des différences inter-échantillons délétères en diagnostic comme en recherche. Au cours de ces travaux, je propose des méthodes originales améliorant de façon significative différentes étapes de ces techniques. Premièrement, je propose une amélioration de la standardisation de l'étape de transcription inverse capable de diminuer de façon significative la variabilité inter-échantillons ; l'utilisation d'un volume constant d'extrait d'ARN pour chaque échantillon améliore considérablement la précision de la quantification d'ARN messagers. Deuxièmement, je propose une modification des amorces par incorporation de résidus d'acides nucléiques bloqués (LNA) ; cette modification permet d'augmenter la spécificité des amorces aux limites de la détection. Enfin, je propose une méthode simple et économique permettant la mesure directe de la température de fusion (Tm) dans les conditions réelles de la PCR. Ce paramètre, considéré comme capital pour la réalisation des dosages par qPCR, est généralement obtenu par des méthodes prédictives peu précises. De plus, cette méthode doit permettre de déterminer précisément les paramètres thermodynamiques des amorces (∆G, ∆H et ∆S) et ainsi avoir accès d'une part au pourcentage réel d'amorces hybridées en fonction de la température et d'autre part d'identifier la susceptibilité des amorces aux inhibiteurs. / QPCR is currently the gold standard for DNA quantification of DNA. It can be defined as an exponential, cyclic and targeted amplification of a known DNA sequence. The exponential character of qPCR is both the cause of the sensitivity of the method but also a potential variability between samples. This variability is offset by the cyclical nature of the method that causes a synchronization of the reaction for all samples in each cycle. The targeted amplification of the selected sequence translates the specificity of the method. Nevertheless, this last property of PCR remains the least tested. The specificity of qPCR is unquestionable when the target to detect is sufficient (> 100 copies). However, for smaller quantities or in the presence of inhibitors, the specificity decreases or disappears (limits of detection and quantification). This loss of specificity will have a significant effect upon the accuracy and reproducibility of the assay to be performed. However, if non-specific hybridizations are unavoidable in these conditions, consecutive nonspecific amplification may be limited or eliminated using more specific PCR primers or less likely to produce inter-sample differences. RT-qPCR allows RNA quantification because of an initial step of reverse transcription (conversion of an RNA into a complementary DNA). However, reverse transcription is less reproducible than PCR, generating harmful inter-sample differences both in diagnosis and in the research field. In this work, I propose innovative methods improving significantly different steps of these techniques. First, I propose an improved standardization of the reverse transcription step that can significantly reduce the variability between samples; using a constant volume of RNA extract for each sample substantially improves mRNA quantification accuracy. Second, I propose a primers modification by incorporating Locked Nucleic Acid residues (LNA); this modification increases the specificity of the primers to the limits of detection. Finally, I propose a simple and economical method for direct measurement of the melting temperature (Tm) in real PCR conditions. This essential parameter in the achievement of qPCR assays is generally obtained by predictive methods with low accuracy. Furthermore, this method should determine the thermodynamic parameters of the oligonucleotide sequence (∆G, ∆H and ∆S), on the one hand allowing access to the actual percentage of annealed primers according to the temperature and on the other hand, to identify the primers susceptibility in the presence of inhibitors.

A l'heure où la médecine tend vers une généralisation des méthodes prédictives, les biocapteurs occupent le devant de la scène. Se basant sur des méthodes de détection et de transduction variées, différents types de biocapteurs sont développés dans le but d'observer des interactions biomoléculaires. Les domaines d'application sont vastes : détections de polluants ou d'OGM, amélioration de la spécificité d'un médicament (traitement anti-cancéreux) ou encore diagnostic génétique fiable. C'est autour de la problématique de la détection de la maladie génétique de la mucoviscidose que s'architecture mes travaux de recherche. Le biocapteur que nous avons utilisé se base sur un système optique utilisant l'imagerie SPR couplée à une biopuce à ADN. Les molécules sondes sont des simples brins d'ADN de synthèse dont la séquence a été calculée afin de pouvoir détecter dans les simples brins cibles issus de l'ADN de patient les modifications génétiques du gène de la CFTR responsable de la maladie. Ces biopuces sont constituées d'une couche métallique fonctionnalisée par une chimie de surface reposant sur la liaison thiol/or et se terminant par une couche de Streptavidin. Les sondes sont biotinylées et un micro-arrayer les dispose sous forme de matrice sur la surface. Grâce à l'implémentation d'un module de contrôle de température et de différentes études sur le TM des interactions ADN-ADN et grâce à une méthode de correction des données, nous avons réussi à établir le diagnostic génétique d'une SNP sans ambiguïté en moins d'une dizaine de minutes. Les dernières études de ce manuscrit ouvrent la porte à la cartographie expérimentale des structures secondaires des simples brins cibles.

Cette thèse de doctorat s’inscrit dans le cadre de l’étude in silico des relations qui lient la séquence d’une protéine à sa structure, sa stabilité et sa fonction. Elle a pour objectif de permettre à terme la conception rationnelle de protéines modifiées qui restent actives dans des conditions physico chimiques non physiologiques. Nous nous sommes plus particulièrement penchés sur la stabilité thermique des protéines, qui est définie par leur température de fusion Tm au delà de laquelle leur structure n’est thermodynamiquement plus stable. Notre travail s’articule en trois grandes parties :la recherche de facteurs favorisant la thermostabilité des protéines parmi des familles de protéines homologues, la mise sur pied d’une base de données de protéines de structure et de Tm déterminées expérimentalement, de laquelle sont dérivés des potentiels statistiques dépendant de la température, et enfin la mise au point de deux outils bioinformatiques visant à prédire d’une part la Tm d’une protéine à partir de la Tm de protéines homologues et d’autre part les changements de thermostabilité d’une protéine (Tm) engendrés par l’introduction d’une mutation ponctuelle.<p><p>La première partie a pour objectif l’identification des facteurs de séquence et de structure (e.g. fréquence de ponts salins, d’interactions cation-{pi}) responsables des différentes stabilités thermiques de protéines homologues au sein de huit familles (chapitre 2). La spécificité de chaque famille ne nous a pas permis de généraliser l’impact de ces différents facteurs sur la stabilité thermique des protéines. Cependant, cette approche nous a permis de constater la multitude de stratégies différentes suivies par les protéines pour atteindre une plus grande thermostabilité.<p><p>La deuxième partie concerne le développement d’une approche originale pour évaluer l’influence de la température sur la contribution de différents types d’interactions à l’énergie libre de repliement des protéines (chapitres 3 et 4). Cette approche repose sur la dérivation de potentiels statistiques à partir d’ensembles de protéines de thermostabilité moyenne distincte. Nous avons d’une part collecté le plus grand nombre possible de protéines de structure et de Tm déterminées expérimentalement, et d’autre part développé des potentiels tenant compte de l’adaptation des protéines aux températures extrêmes au cours de leur évolution. Cette méthode originale a mis en évidence la dépendance en la température d’interactions protéiques tels les ponts salins, les interactions cation-{pi}, certains empilements hydrophobes .Elle nous a en outre permis de mettre le doigt sur l’importance de considérer la dépendance en la température non seulement des interactions attractives mais également des interactions répulsives, ainsi que sur l’importance de décrire la résistance thermique par la Tm plutôt que la Tenv, température de l’environnement de l’organisme dont elle provient (chapitre 5).<p><p>La dernière partie de cette thèse concerne l’utilisation des profils énergétiques dans un but prédictif. Tout d’abord, nous avons développé un logiciel bioinformatique pour prédire la thermostabilité d’une protéine sur la base de la thermostabilité de protéines homologues. Cet outil s’est avéré prometteur après l’avoir testé sur huit familles de protéines homologues. Nous avons également développé un deuxième outil bioinformatique pour prédire les changements de thermostabilité d’une protéine engendrés par l’introduction d’une mutation ponctuelle, en s’inspirant d’un logiciel de prédiction des changements de stabilité thermodynamique des protéines développé au sein de notre équipe de recherche. Ce deuxième algorithme de prédiction repose sur le développement d’une grande base de données de mutants caractérisés expérimentalement, d’une combinaison linéaire de potentiels pour évaluer la Tm, et d’un réseau de neurones pour identifier les coefficients de la combinaison. Les prédictions générées par notre logiciel ont été comparées à celles obtenues via la corrélation qui existe entre stabilités thermique et thermodynamique, et se sont avérées plus fiables.<p><p>Les travaux décrits dans notre thèse, et en particulier le développement de potentiels statistiques dépendant de la température, constituent une nouvelle approche très prometteuse pour comprendre et prédire la thermostabilité des protéines. En outre, nos travaux de recherche ont permis de développer une méthodologie qui pourra être adaptée à l’étude et à la prédiction d’autres propriétés physico chimiques des protéines comme leur solubilité, leur stabilité vis à vis de l’acidité, de la pression, de la salinité .lorsque suffisamment de données expérimentales seront disponibles.<p> / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Chimie dynamique: reconnaissance de nucléobases par des récepteurs synthétiques et isomérie cis-trans d'hydrazones acylées.Ce travail traite du développement des systèmes moléculaires qui peuvent s'adapter à l'addition de substances qui agissent comme un gabarit. Cette approche permet d'isoler une espèce majeure à partir d'un mélange de composés par le biais de la chimie combinatoire dynamique (CCD). La première partie de ma thèse de doctorat inclus l'utilisation d'un ADN simple brin (ADNsb) comme un gabarit pour le transfert d'information par auto-assemblage de récepteurs sans avoir besoin d'enzyme. De nouveaux récepteurs de l'adénine et de la guanine (pinces A et G) solubles dans l'eau ont été conçues dans ce but. Une approche utilisant la résonance magnétique nucléaire (RMN) a été utilisée pour déterminer l'affinité de liaison comme preuve d'une reconnaissance spécifique et efficace. Une évaluation dans l'eau par dichroïsme circulaire (CD) et mesure de la température de fusion par UV (Tm) a été réalisée. Cela a permis de tester respectivement la capacité d'auto-assemblage entre les pinces et un modèle ADNsb, et la force du processus de coopérativité. La deuxième partie de ce travail est axée sur le tri spontanné de motifs pyridine acylhydrazone et sur les configurations intéressantes qu'ils adoptent. Nous avons étudié la synthèse d'une série de motifs pyridine acylhydrazone: dimère, trimères et pentamères. Des études RMN ont permis d'évaluer les changements dans l'équilibre configurationnel cis / trans de ces systèmes dynamiques. Les études ont montré que l'équilibre attendu est biaise la cis acylhydrazone pyridine isomère a été observée par diffraction des rayons X. / Dynamic chemistry: nucleobase recognition by synthetic receptors and cis-trans acylhydrazone isomerism. This work deals with the development of molecular systems which can adapt upon the addition of substances that act as templates. This approach enables one major species to be identified from a mixture of compounds through the use of dynamic combinatorial chemistry (DCC). The first part of my PhD included the use of a single stranded DNA (ssDNA) as a template for information transfer via the self-assembly of receptors without the need for enzymes. New water soluble adenine and guanine receptors (A and G clamps) were designed and synthesised for this purpose. Nuclear magnetic resonance (NMR) titration studies were carried out to calculate the binding affinity and as a proof of specific and efficient recognition. An assessment in water via circular dichroism (CD) and UV temperature melting (Tm) studies was carried out. This tested the ability for self-assembly between the clamps and a ssDNA template and the strength of the cooperative process respectively. The second part of my PhD focused on the self-sorting of acylhydrazone pyridine motifs and the interesting configurations they adopt. The feasibility to synthesise these acylhydrazone pyridine motifs (dimer, trimers and pentamers) was investigated. X-ray and NMR studies showed that the equilibrium was found to be biased in an unusual way, and the cis acylhydrazone pyridine isomer was observed.