FREITAS, A. C. Produção de proteases por Aspergillus em fermentação semi-sólida utilizando torta de canola. 83 f. 2009. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) – Centro de Tecnologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2009. / Submitted by Marlene Sousa (mmarlene@ufc.br) on 2016-03-21T19:12:22Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_acfreitas.pdf: 1152918 bytes, checksum: 4a33865f89d978715f9c8c42e00d1485 (MD5) / Approved for entry into archive by Marlene Sousa(mmarlene@ufc.br) on 2016-03-28T17:44:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_acfreitas.pdf: 1152918 bytes, checksum: 4a33865f89d978715f9c8c42e00d1485 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-28T17:44:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_acfreitas.pdf: 1152918 bytes, checksum: 4a33865f89d978715f9c8c42e00d1485 (MD5) Previous issue date: 2009-02-19 / The proteases belong to the class of enzymes with the capacity to hydrolyze peptidic connections into protein and protein fragments, modifying the substrate by great selectivity and specification. The semi-solid fermentation is a fermentation process in which the growth of microorganisms and the formation of the products occur on the surface of the solid substrate next to the absence of free water, usually using natural raw materials as a source of carbon and energy. On this study, it was done the semi solid cultivation of filament fungi, in order to produce proteases using as a substrate a cake of canola. It was evaluated, in a first study, the potential of different strains of Aspergillus for the production of proteases. The strains studied were Aspergillus niger (CNPAT 001, IOC 207, IOC 4222, IOC 4220 and IOC 3883) and Aspergillus oryzae IV. The best strain obtained for the production of protease was a strain of Aspergillus oryzae IV. Later on, it was studied the influence of the different quantities of water and coke canola added; the best production was obtained in proportion with 40 mL of water to 100 g of cake. After determination to medium of moisture, was evaluated the temperature of incubation, the best results were obtained in media incubated at 20° C. Further, studies were done to determine the best concentration of inoculum, the concentrations tested were 1 × 104, 1 × 105, 1 × 106 and 1 × 107 spores per gram of medium, being 1 × 107 to better concentration analyzed. The influence of supplementation of fermentation medium with sources of phosphorus, carbon and nitrogen was evalueted. Supplementation of the cake of canola, with 1% (w/w) monobasic sodium phosphate did not influence positively the production of proteases. Supplementation of medium with different sources of nitrogen were studied in the proportion of 1.0% (w/w) in the weight of the substrate, being the yeast extract of the best source evaluated, showing increased production of proteases. Then, it was tested the incubation period of the medium without supplementation of nutrients, between 0 and 240 hours of fermentation with samples being removed every 24 h of fermentation process. The highest production occurred at 96 h with production of 336 U.g-1 protease. After this stage, was evaluated the supplementation of medium with different carbon sources at different concentrations, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 7.5, 10.0, 12, 5 15.0 % (w/w) in the weight of the substrate; the increased production of proteases occurred in the medium with the addition of glucose at a concentration of 7.5 % obtaining 452 Ug-1. In the last stage, was performed the characterization of the medium during the fermentation process by of a chemical and physicochemical analytical determinations. The increased production of proteases obtained was 452 U.g-1 in 96 hours of fermentation process, in media supplemented with 7.5 % glucose, at the fermentation conditions: temperature of incubation of the medium at 20° C, damp cake with 40 mL water per 100 g of substrate and concentration of inoculum of 1 × 107 spores.g-1. / As proteases fazem parte da classe de enzimas com a capacidade de hidrolisar ligações peptídicas em proteínas e fragmentos de proteínas, modificando os substratos com grande seletividade e especificidade. A fermentação semi-sólida é um processo fermentativo no qual o crescimento do microrganismo e a formação dos produtos ocorrem na superfície do substrato sólido próximo à ausência de água livre, geralmente utilizando matéria-prima natural como fonte de carbono e energia. Realizou-se neste estudo o cultivo semi-sólido de fungos filamentosos, visando à produção de proteases utilizando como substrato a torta de canola. Avaliando-se, em um primeiro estudo, o potencial de diferentes linhagens de Aspergillus para a produção de proteases. As linhagens estudadas foram Aspergillus niger (CNPAT 001, IOC 207, IOC 4222, IOC 4220 e IOC 3883) e Aspergillus oryzae IV. A melhor linhagem obtida para a produção de protease foi a linhagem de Aspergillus oryzae IV. Em seguida, estudou-se a influência da adição de diferentes volumes de água a torta, onde a melhor produção foi obtida nos meios com proporção 40 mL de água para 100 g de torta. Determinada a melhor umidade do meio, avaliou-se a temperatura de incubação, os melhores resultados obtidos foram em meios incubados a 20°C. Na sequência, foram feitos estudos para determinação da melhor concentração de inóculo, as concentrações testas foram 1×104, 1×105, 1×106 e 1×107 esporos por grama de meio, sendo 1×107 a melhor concentração analisada. Avaliou-se a influência da suplementação do meio fermentativo com fontes de fósforo, carbono e nitrogênio. A suplementação da torta de canola, com 1% (m/m) de fosfato de sódio monobásico não influenciou positivamente na produção de proteases. A suplementação do meio com diferentes fontes de nitrogênio foram estudadas na proporção de 1,0 % (m/m) em relação ao peso do substrato, sendo o extrato de levedura a melhor fonte avaliada, apresentando maior produção de proteases. Em seguida, testou-se o período de incubação do meio sem suplementação de nutrientes, entre 0 e 240 horas de fermentação com amostras sendo retiradas a cada 24 h de processo fermentativo. A maior produção ocorreu em 96 h com produção de 336 U.g-1 de proteases. Após esta etapa, avaliou-se a suplementação do meio com diferentes fontes de carbono em diferentes concentrações, 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 7,5; 10,0; 12,5 15,0 % (m/m) em relação ao peso do substrato, a maior produção de proteases ocorreu no meio com adição de glicose na concentração de 7,5 % obtendo 452 U.g-1. Na última etapa, fez-se a caracterização do meio ao longo do processo fermentativo, através de determinações analíticas de ordem químicas e físico-químicas. A maior produção de proteases obtida foi de 452 U.g-1 em 96 horas de processo fermentativo, nos meios suplementados com 7,5 % de glicose, nas seguintes condições fermentativas: temperatura de incubação do meio a 20°C, torta umedecida com 40 mL de água por 100 g de substrato e concentração de inóculo de 1×107 esporos.g-1.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_vanessa_silva_da_silva.pdf: 492130 bytes, checksum: 6301288f1de4d9363b332a15a2ad0a6e (MD5) Previous issue date: 2011-11-28 / Listeria monocytogenes is an infectious microorganism causing listeriosis, a foodborne illness affecting immunocompromised, pregnant, elderly and childrens. Pathogenic to men and animals is found naturally in the environment and has the ability to multiply on adverse conditions such as high salinity and chilling temperatures. However, their detection in food is difficult because it is laborious, time consuming and expensive. Therefore comes to searching for methods to detect simple and fast. Immunological methods are very promising in this regard, but the conditions under which the organism is grown should be ideal for maximizing the expression and subsequent detection of the target antigen. Internalin A protein (InlA) of L. monocytogenes is an excellent target for detection of this pathogen in immunological tests, but the ideal conditions to enhance its expression had not yet been described. Therefore thus study analyzed the expression of InlA in two strains of L. monocytogenes serotype 4b, a clínical and other non-clínical, in non selective enrichment broths Luria-Bertani (LB), Brain Heart Infusion (BHI), Tryptic Soy Broth (TSB) and selective broths Fraser Broth (FRA), Listeria Enrichment Broth (LEB), Listeria Enrichment Broth - University of Vermont Medium (UVM), to incubation at 29 and 37 °C, through the ELISA and real time RT-PCR. All data were statistically analyzed considering a significance level of 5% (p <0.05). In the ELISA it was found that expression of InlA is strain-specific, in other words, was influenced by the origin of the strain, because the strain non-clínical of L. monocytogenes showed higher InlA expression levels than the clínical strain, and the medium used directly interfere with the expression of this antigen, and the most appropriate medium of enrichment for use in detection methods, regardless of the origin of the strain,was FRA, TSB and LEB. It was also observed that there was no significant difference in the expression of InlA when strains were grown at 29 and 37 °C. The real-time RT-PCR data showed inconclusive, since there was no statistically significant difference between the conditions analyzed, requiring thus more study. In conclusion, it was found that InlA gene expression on influenced by origin of the strain and culture media. Regardless of the origin of the strain, the preferred media for use in InlA protein detection methods are FRA, TSB and LEB / Listeria monocytogenes é um microrganismo infeccioso causador de listeriose, uma doença de origem alimentar que acomete principalmente imunocomprometidos, gestantes, idosos e crianças. Considerado patogênico tanto para homens quanto para animais, está distribuído naturalmente no ambiente e possui a capacidade de multiplicar-se sobre condições adversas, como alta salinidade e temperaturas de refrigeração. Todavia, sua detecção em alimentos é dificultada por ser trabalhosa, demorada e dispendiosa. Por isso, vem-se buscando métodos de detecção mais simples e rápidos. Os métodos imunológicos são muito promissores neste sentido, mas as condições em que o microrganismo é cultivado devem ser ideais para maximizar a expressão e consequente detecção do antígeno alvo. A proteína internalina A (InlA) de L. monocytogenes é um excelente alvo para detecção desse patógeno em testes imunológicos, porém as condições ideais para potencializar sua expressão ainda não foram descritas. Portanto, nesse trabalho analisou-se a expressão de InlA em duas cepas de L.monocytogenes sorotipo 4b, uma de origem clínica e outra não-clínica, nos caldos de enriquecimento não seletivos Luria-Bertani (LB), Brain Heart Infusion (BHI) e Tryptic Soy Broth (TSB), assim como nos caldos seletivos Fraser Broth (FRA), Listeria Enrichment Broth (LEB) e Listeria Enrichment Broth - University of Vermont Medium (UVM), a 29 e 37 °C, utilizando ELISA indireto e RT-PCR em tempo real. Todos os dados obtidos foram submetidos a análises estatísticas considerando um nível de significância de 5% (p<0,05). Através do ELISA indireto verificou-se que a expressão da InlA é cepa-especifica, ou seja, foi influenciada pela origem da cepa, pois a L. monocytogenes não-clínica apresentou maiores níveis de expressão de InlA do que a cepa clínica, e que os meios utilizados interferem diretamente na expressão desse antígeno, sendo os meios de enriquecimento mais indicados para uso em métodos de detecção, independentemente da origem da cepa, o FRA, TSB e LEB. Observou-se também que não ocorreu diferença significativa na expressão de InlA quando as cepas foram cultivadas a 29 e 37°C. O RT-PCR em tempo real apresentou dados inconclusivos, visto que não houve diferença estatística significativa entre as condições analisadas, necessitando, dessa forma, de maiores estudos.