A transferência de material genético para dentro das células de um indivíduo com o objetivo de conferir um benefício terapêutico ao corrigir uma anormalidade ou proporcionar às células uma nova função constitui a essência da terapia gênica. Seu princípio baseia-se no entendimento de que algumas doenças são causadas por defeitos em um ou mais genes, levando à produção descontrolada ou à supressão de uma proteína essencial para o funcionamento das células. Doenças monogênicas (como os erros inatos do metabolismo), câncer, doenças cardiovasculares, desordens neurodegenerativas e doenças adquiridas (infecciosas, por exemplo) são alvos da terapia gênica. Na terapia gênica, o agente terapêutico em questão é o material genético de interesse. Tanto os elementos regulatórios quanto o gene de interesse são clonados em um plasmídio de expressão, que é, então, utilizado para a construção de vetores de transferência virais e não virais. Bicamadas lipídicas microscópicas denominadas lipossomos são vetores não virais comumente utilizados. Este trabalho teve como objetivo iniciar uma adaptação das abordagens da farmacologia ao estudo de vetores não virais em terapia gênica e padronizar a detecção da green fluorescent protein (GFP) por espectrofotometria de fluorescência, determinando o tempo de expressão máxima dessa proteína em cultura de células HepG2 e obtendo-se, assim, um método quantitativo para avaliação da eficiência de transfecção de vetores e parâmetros de tempo para futura detecção da GFP in vivo. É possível traçar paralelos entre a farmacoterapia e a terapia gênica. A comparação entre as composições de formulações farmacêuticas e de vetores de transferência leva-nos a pensar que o gene de interesse corresponderia à pró-droga, enquanto a proteína expressa equivaleria à droga, uma vez que se constitui no componente terapeuticamente ativo. Os demais elementos presentes nos plasmídios, como os promotores e sítios de poliadenilação, corresponderiam aos excipientes e o vetor de transferência como um todo equivaleria à formulação farmacêutica. A detecção da GFP expressa por células HepG2 transfectadas pelo plasmídio pTracer associado a LipofectamineTM2000 mostrou-se semi-quantitativamente possível por espectrofotometria de fluorescência. O tempo de expressão máxima desta proteína neste estudo foi 48 horas, sendo este também o tempo máximo de análise. É necessário, portanto, que os tempos de análise da expressão protéica sejam expandidos. A adaptação de abordagens farmacológicas pode contribuir para o aprimoramento técnico necessário para que a terapia gênica torne-se uma forma de tratamento amplamente difundida.

Uma abordagem alternativa para a terapia gênica somática é a entrega da proteína terapêutica através da implantação de células geneticamente modificadas com capacidade de superexpressar o gene de interesse. Os mecanismos de encapsulação foram projetados para proteger as células da rejeição do organismo hospedeiro e para prevenir que as células modificadas se espalhassem, ao mesmo tempo em que permite a secreção protéica. As esferas de alginato formam uma estrutura semi-permeável conveniente para a injeção in vivo. Neste estudo, um protocolo laboratorial eficaz foi otimizado para gerar micro cápsulas de alginato de cálcio com forma e tamanho uniformes, contendo células viáveis. A encapsulação de células baby hamster kidney (BHK) em esferas de alginato foi executada utilizando um dispositivo simples montado com um cilindro de ar comprimido e uma bomba peristáltica. O fluxo de 100 mL/h da solução contendo as células e o fluxo de 10 L/min de ar comprimido geraram as melhores cápsulas em relação ao tamanho e a uniformidade das esferas. As células se mantiveram viáveis em cultura por quatro semanas, sem apresentar sinais de necrose, e a difusão protéica foi observada durante estas quatro semanas. Os resultados destes estudos in vitro demonstram claramente que o micro isolamento de células BHK em alginato, utilizando este dispositivo simples, pode prover um ambiente capaz de preservar as células vivas e viáveis. Além disso, as células encapsuladas sob as condições descritas nesse trabalho, possibilitam a difusão de β-gal mesmo após quatro semanas de tratamento, tornando-se assim potencialmente compatíveis com a entrega de proteína terapêutica. / An alternative approach to somatic gene therapy is to deliver the therapeutic protein by implanting genetically modified cells that could overexpress the gene of interest. Microencapsulation devices were designed to protect cells from host rejection and prevent the foreign cells from spreading while allowing protein secretion. Alginate beads form a semi-permeable structure that is suitable for in vivo injection. In this study we report an effective laboratory protocol to generate calcium alginate microcapsules, following optimization of uniformly shaped and sized particles that contain viable cells. Encapsulation of baby hamster kidney (BHK) cells in alginate beads was performed using a simple device assembled with a cylinder of compressed air and a peristaltic pump. Cell suspension flow of 100 mL/h and air jet flow of 10 L/min allowed best size and shape uniformity of beads. Cells were maintained viable in culture for 4 weeks, with no signs of necrosis, and protein diffusion was observed during these weeks. Results of these in vitro studies clearly demonstrated that microisolation of BHK cells in alginate using a simple assembly device could provide an environment that is capable of preserving live and viable cells. In addition, encapsulated cells under the conditions described were able to secrete β- galactosidase even after four weeks of treatment, thus becoming potentially compatible with therapeutic protein delivery.

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença lisossomal. A enzima envolvida com essa doença é a a-L-iduronidase (IDUA), e suas alterações levam a depósitos dos glicosaminoglicanos heparan e dermatan sulfato. As características fenotípicas da doença compreendem entre outras características malformações ósseas, hepatoesplenomegalia, problemas cardíacos, opacidade da córnea e retardo mental. O tratamento de MPS I atualmente se baseia em reposição enzimática e transplante de medula óssea. Levando em conta que esses tratamentos ainda não levam a uma correção dos danos ao sistema nervoso central (SNC), há necessidade do desenvolvimento de novos tratamentos para MPS I. Ainda outro problema da MPS I é a falta de estudos sobre os danos fisiológicos resultantes, principalmente no SNC. Visando contribuir com estes pontos, nosso trabalho teve como objetivo (a) o desenvolvimento de três vetores virais para posteriores ensaios pré-clínicos de terapia gênica e (b) o detalhamento da caracterização fisiopatológica de camundongos representando um modelo para MPS I, enfocando alguns aspectos do SNC. Foram produzidos três vetores virais com o cDNA da IDUA humana. O vetor baseado no vírus da imunodeficiência humana (HIV), apesar de baixos títulos virais, foi capaz de aumentar em até 60 vezes a atividade da IDUA nas células transduzidas. Um segundo vetor, baseado no vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV) foi capaz de transduzir células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea do modelo murino de MPS I, sendo assim ótima ferramenta para terapia gênica ex vivo. O terceiro vetor, baseado no vírus da imunodeficiência felina (FIV) mostrou funcionalidade inferior quando comparado aos outros sistemas virais, e deve ser aperfeiçoado para utilização terapêutica. A caracterização do modelo foi feita através do estudo da fosforilação de proteínas de neurofilamentos em diferentes estruturas do cérebro de camundongos MPS I. Os resultados mostraram, além de alterações na fosforilação direta das proteínas analisadas, uma hiperfosforilação na ERK1/2 de córtex e hipocampo. Depósitos de gangliosídeos foram investigados de forma individual no cerebelo, córtex, hipocampo e hipotálamo, sendo detectadas diferenças específicas para cada estrutura. Ainda foram realizados estudos da neurotransmissão glutamatérgica e com isso foi identificada uma diminuição na captação de glutamato em hipocampo e córtex nos camundongos MPS I, além de uma diminuição no binding para glutamato no hipocampo. Como conclusão desses estudos, foram desenvolvidos vetores eficientes para transferência do gene terapêutico e, adicionalmente, os danos fisiológicos causados pela doença no SNC foram melhor elucidados no modelo murino de MPS I. As informações obtidas aqui serão de grande importância principalmente quando associadas a ensaios de terapia gênica, pois as características encontradas no SNC podem ser usadas para acompanhamentos de ensaios préclínicos usando os vetores desenvolvidos no trabalho. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a monogenic disease resulting from a defect in the gene that encodes the lysosomal hydrolase a-L-iduronidase (IDUA) and characterized by accumulation of glycosaminoglycans (GAGs) heparan and dermatan sulfate. Phenotypic characteristics involve bone malformations, hepatosplenomegaly, heart problems, corneal opacity and mental retardation. Treatment of MPS I is currently based on enzymatic replacement and bone marrow transplantation. Since these treatments are not capable of correcting central nervous system (CNS) effects of the disease, new therapeutic approaches are needed. One of the problems in the investigation of MPS I is the paucity of studies about resulting physiological consequences, particularly those related to the CNS. Aiming to contribute to these aspects of MPS I, this study proposes (a) the development of three viral vectors to be used in gene therapy preclinical studies, and (b) the further investigation of physiopathological alterations in the CNS of a murine model of MPS I (MPS I mice). Three viral vectors, carrying the human IDUA gene, were produced. The vector based on the human immunodeficiency virus (HIV) was produced in low titers, but induced a 60-fold increase in the baseline activity of IDUA in transduced cells. A second vector, based on the Moloney murine leukemia virus (MoMLV), was capable to transduce mesenchymal stem cells isolated from the bone marrow of MPS I mice, representing an interesting tools for ex vivo gene therapy protocols. The third vector, was based on the feline immunodeficiency virus (FIV), was functionally inferior to the other two systems and needs optimization to be therapeutically useful. The model was characterized by the investigation of phosphorylation patterns of neurofilament proteins in different regions of the brain of MPS I mice. The results showed that, besides alterations in the direct phosphorylation profile of the proteins analyzed, ERK1/2 was hyperphosphorylated in the cortex and hippocampus. Ganglioside storage was individually investigated in the cortex, cerebellum, hippocampus and hypothalamus, and specific differences were observed for each structure. An analysis of glutamatergic neurotransmission was also performed. MPS I animals showed a decrease in the glutamate uptake in the cortex and hippocampus. In addition, glutamate binding was decreased in the hippocampus. In conclusion, the present work resulted in the development of efficient viral vectors for the transfer of the therapeutic gene, and CNS physiological damages due to the disease were characterized in the murine model of MPS I. These results will be of great importance particularly when associated to gene therapy trials, since the CNS characteristics described in this work may be used for the follow-up of preclinical assays with the viral vectors developed.

Uma abordagem alternativa para a terapia gênica somática é a entrega da proteína terapêutica através da implantação de células geneticamente modificadas com capacidade de superexpressar o gene de interesse. Os mecanismos de encapsulação foram projetados para proteger as células da rejeição do organismo hospedeiro e para prevenir que as células modificadas se espalhassem, ao mesmo tempo em que permite a secreção protéica. As esferas de alginato formam uma estrutura semi-permeável conveniente para a injeção in vivo. Neste estudo, um protocolo laboratorial eficaz foi otimizado para gerar micro cápsulas de alginato de cálcio com forma e tamanho uniformes, contendo células viáveis. A encapsulação de células baby hamster kidney (BHK) em esferas de alginato foi executada utilizando um dispositivo simples montado com um cilindro de ar comprimido e uma bomba peristáltica. O fluxo de 100 mL/h da solução contendo as células e o fluxo de 10 L/min de ar comprimido geraram as melhores cápsulas em relação ao tamanho e a uniformidade das esferas. As células se mantiveram viáveis em cultura por quatro semanas, sem apresentar sinais de necrose, e a difusão protéica foi observada durante estas quatro semanas. Os resultados destes estudos in vitro demonstram claramente que o micro isolamento de células BHK em alginato, utilizando este dispositivo simples, pode prover um ambiente capaz de preservar as células vivas e viáveis. Além disso, as células encapsuladas sob as condições descritas nesse trabalho, possibilitam a difusão de β-gal mesmo após quatro semanas de tratamento, tornando-se assim potencialmente compatíveis com a entrega de proteína terapêutica. / An alternative approach to somatic gene therapy is to deliver the therapeutic protein by implanting genetically modified cells that could overexpress the gene of interest. Microencapsulation devices were designed to protect cells from host rejection and prevent the foreign cells from spreading while allowing protein secretion. Alginate beads form a semi-permeable structure that is suitable for in vivo injection. In this study we report an effective laboratory protocol to generate calcium alginate microcapsules, following optimization of uniformly shaped and sized particles that contain viable cells. Encapsulation of baby hamster kidney (BHK) cells in alginate beads was performed using a simple device assembled with a cylinder of compressed air and a peristaltic pump. Cell suspension flow of 100 mL/h and air jet flow of 10 L/min allowed best size and shape uniformity of beads. Cells were maintained viable in culture for 4 weeks, with no signs of necrosis, and protein diffusion was observed during these weeks. Results of these in vitro studies clearly demonstrated that microisolation of BHK cells in alginate using a simple assembly device could provide an environment that is capable of preserving live and viable cells. In addition, encapsulated cells under the conditions described were able to secrete β- galactosidase even after four weeks of treatment, thus becoming potentially compatible with therapeutic protein delivery.

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença lisossomal. A enzima envolvida com essa doença é a a-L-iduronidase (IDUA), e suas alterações levam a depósitos dos glicosaminoglicanos heparan e dermatan sulfato. As características fenotípicas da doença compreendem entre outras características malformações ósseas, hepatoesplenomegalia, problemas cardíacos, opacidade da córnea e retardo mental. O tratamento de MPS I atualmente se baseia em reposição enzimática e transplante de medula óssea. Levando em conta que esses tratamentos ainda não levam a uma correção dos danos ao sistema nervoso central (SNC), há necessidade do desenvolvimento de novos tratamentos para MPS I. Ainda outro problema da MPS I é a falta de estudos sobre os danos fisiológicos resultantes, principalmente no SNC. Visando contribuir com estes pontos, nosso trabalho teve como objetivo (a) o desenvolvimento de três vetores virais para posteriores ensaios pré-clínicos de terapia gênica e (b) o detalhamento da caracterização fisiopatológica de camundongos representando um modelo para MPS I, enfocando alguns aspectos do SNC. Foram produzidos três vetores virais com o cDNA da IDUA humana. O vetor baseado no vírus da imunodeficiência humana (HIV), apesar de baixos títulos virais, foi capaz de aumentar em até 60 vezes a atividade da IDUA nas células transduzidas. Um segundo vetor, baseado no vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV) foi capaz de transduzir células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea do modelo murino de MPS I, sendo assim ótima ferramenta para terapia gênica ex vivo. O terceiro vetor, baseado no vírus da imunodeficiência felina (FIV) mostrou funcionalidade inferior quando comparado aos outros sistemas virais, e deve ser aperfeiçoado para utilização terapêutica. A caracterização do modelo foi feita através do estudo da fosforilação de proteínas de neurofilamentos em diferentes estruturas do cérebro de camundongos MPS I. Os resultados mostraram, além de alterações na fosforilação direta das proteínas analisadas, uma hiperfosforilação na ERK1/2 de córtex e hipocampo. Depósitos de gangliosídeos foram investigados de forma individual no cerebelo, córtex, hipocampo e hipotálamo, sendo detectadas diferenças específicas para cada estrutura. Ainda foram realizados estudos da neurotransmissão glutamatérgica e com isso foi identificada uma diminuição na captação de glutamato em hipocampo e córtex nos camundongos MPS I, além de uma diminuição no binding para glutamato no hipocampo. Como conclusão desses estudos, foram desenvolvidos vetores eficientes para transferência do gene terapêutico e, adicionalmente, os danos fisiológicos causados pela doença no SNC foram melhor elucidados no modelo murino de MPS I. As informações obtidas aqui serão de grande importância principalmente quando associadas a ensaios de terapia gênica, pois as características encontradas no SNC podem ser usadas para acompanhamentos de ensaios préclínicos usando os vetores desenvolvidos no trabalho. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a monogenic disease resulting from a defect in the gene that encodes the lysosomal hydrolase a-L-iduronidase (IDUA) and characterized by accumulation of glycosaminoglycans (GAGs) heparan and dermatan sulfate. Phenotypic characteristics involve bone malformations, hepatosplenomegaly, heart problems, corneal opacity and mental retardation. Treatment of MPS I is currently based on enzymatic replacement and bone marrow transplantation. Since these treatments are not capable of correcting central nervous system (CNS) effects of the disease, new therapeutic approaches are needed. One of the problems in the investigation of MPS I is the paucity of studies about resulting physiological consequences, particularly those related to the CNS. Aiming to contribute to these aspects of MPS I, this study proposes (a) the development of three viral vectors to be used in gene therapy preclinical studies, and (b) the further investigation of physiopathological alterations in the CNS of a murine model of MPS I (MPS I mice). Three viral vectors, carrying the human IDUA gene, were produced. The vector based on the human immunodeficiency virus (HIV) was produced in low titers, but induced a 60-fold increase in the baseline activity of IDUA in transduced cells. A second vector, based on the Moloney murine leukemia virus (MoMLV), was capable to transduce mesenchymal stem cells isolated from the bone marrow of MPS I mice, representing an interesting tools for ex vivo gene therapy protocols. The third vector, was based on the feline immunodeficiency virus (FIV), was functionally inferior to the other two systems and needs optimization to be therapeutically useful. The model was characterized by the investigation of phosphorylation patterns of neurofilament proteins in different regions of the brain of MPS I mice. The results showed that, besides alterations in the direct phosphorylation profile of the proteins analyzed, ERK1/2 was hyperphosphorylated in the cortex and hippocampus. Ganglioside storage was individually investigated in the cortex, cerebellum, hippocampus and hypothalamus, and specific differences were observed for each structure. An analysis of glutamatergic neurotransmission was also performed. MPS I animals showed a decrease in the glutamate uptake in the cortex and hippocampus. In addition, glutamate binding was decreased in the hippocampus. In conclusion, the present work resulted in the development of efficient viral vectors for the transfer of the therapeutic gene, and CNS physiological damages due to the disease were characterized in the murine model of MPS I. These results will be of great importance particularly when associated to gene therapy trials, since the CNS characteristics described in this work may be used for the follow-up of preclinical assays with the viral vectors developed.

A transferência de material genético para dentro das células de um indivíduo com o objetivo de conferir um benefício terapêutico ao corrigir uma anormalidade ou proporcionar às células uma nova função constitui a essência da terapia gênica. Seu princípio baseia-se no entendimento de que algumas doenças são causadas por defeitos em um ou mais genes, levando à produção descontrolada ou à supressão de uma proteína essencial para o funcionamento das células. Doenças monogênicas (como os erros inatos do metabolismo), câncer, doenças cardiovasculares, desordens neurodegenerativas e doenças adquiridas (infecciosas, por exemplo) são alvos da terapia gênica. Na terapia gênica, o agente terapêutico em questão é o material genético de interesse. Tanto os elementos regulatórios quanto o gene de interesse são clonados em um plasmídio de expressão, que é, então, utilizado para a construção de vetores de transferência virais e não virais. Bicamadas lipídicas microscópicas denominadas lipossomos são vetores não virais comumente utilizados. Este trabalho teve como objetivo iniciar uma adaptação das abordagens da farmacologia ao estudo de vetores não virais em terapia gênica e padronizar a detecção da green fluorescent protein (GFP) por espectrofotometria de fluorescência, determinando o tempo de expressão máxima dessa proteína em cultura de células HepG2 e obtendo-se, assim, um método quantitativo para avaliação da eficiência de transfecção de vetores e parâmetros de tempo para futura detecção da GFP in vivo. É possível traçar paralelos entre a farmacoterapia e a terapia gênica. A comparação entre as composições de formulações farmacêuticas e de vetores de transferência leva-nos a pensar que o gene de interesse corresponderia à pró-droga, enquanto a proteína expressa equivaleria à droga, uma vez que se constitui no componente terapeuticamente ativo. Os demais elementos presentes nos plasmídios, como os promotores e sítios de poliadenilação, corresponderiam aos excipientes e o vetor de transferência como um todo equivaleria à formulação farmacêutica. A detecção da GFP expressa por células HepG2 transfectadas pelo plasmídio pTracer associado a LipofectamineTM2000 mostrou-se semi-quantitativamente possível por espectrofotometria de fluorescência. O tempo de expressão máxima desta proteína neste estudo foi 48 horas, sendo este também o tempo máximo de análise. É necessário, portanto, que os tempos de análise da expressão protéica sejam expandidos. A adaptação de abordagens farmacológicas pode contribuir para o aprimoramento técnico necessário para que a terapia gênica torne-se uma forma de tratamento amplamente difundida.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2012. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2012-10-29T14:09:23Z No. of bitstreams: 1 2012_LudmyllaCostaCunha_Parcial.pdf: 2564492 bytes, checksum: 6e6ce6ca592e7c52d9722490cc9c373a (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-11-22T12:01:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_LudmyllaCostaCunha_Parcial.pdf: 2564492 bytes, checksum: 6e6ce6ca592e7c52d9722490cc9c373a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-22T12:01:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_LudmyllaCostaCunha_Parcial.pdf: 2564492 bytes, checksum: 6e6ce6ca592e7c52d9722490cc9c373a (MD5) / Gliomas representam o tipo de tumor cerebral primário de maior malignidade. Entre as alterações que conferem competência tumoral ao glioma, está o aumento na expressão do canal de potássio hEag1. Na última década, a interferência de RNA (RNAi) tem se destacado como técnica para estudo da função de genes em mamíferos, via silenciamento gênico pós-transcricional. Neste sentido, a técnica de RNAi foi utilizada no atual estudo para silenciar o gene Eag1 em células de glioma. Na primeira etapa deste projeto, foram identificados alvos para RNAi na região codante do gene hEag1 (NM_172362.2), via algoritmo baseado em redes neurais artificiais. Foram identificados 25 alvos de RNAi, com escores variando de 0,82 a 0,87, e selecionados para o atual estudo os dois alvos com maiores escores. Foi realizada síntese química de siRNAs para estes alvos situados nos exons 2 e 8, daí a denominação e2_hEag1 e e8_hEag1. Também foram sintetizados o siRNA controle positivo descrito anteriormente Kv10.1-3 e o controle negativo scramble (Qiagen). Foi inicialmente determinado o ponto temporal (4h, 8h, ou 48h) e a concentração (18,75 nM, 37,5 nM ou 75,0 nM) de maior silenciamento de hEag1, utilizando-se os siRNAs controles transfectados em lipossomas catiônicos. O maior silenciamento foi observado no tempo de 8h pós-transfecção, na menor dosagem testada, 18,75 nM. Nesta condição experimental, foi testado o grau de silenciamento de Eag1 causado pelos dois novos siRNAs, em comparação com o controle positivo Kv10.1-3. Ambos siRNAs desenhados no atual estudo -e2_hEag1 e e8_hEag1 -foram mais efetivos que o controle positivo Kv10.1-3, reduzindo assim o conteúdo relativo de hEag1 em 0,46 vezes e 0,52 vezes, respectivamente, em relação ao valor obtido no controle negativo scramble (p < 0,05). Na última etapa deste estudo, foi avaliado se vetores de expressão de short hairpins RNAs (shRNA) direcionados ao alvo 5´ GTCCACTTGGTCCATGTCCAG 3´ do controle positivo Kv10.1-3 (pKv10.1-3hum_LI), causariam alteração de fenótipo celular, ou seja, redução da viabilidade dos gliomas. O efeito destes vetores de expressão (pKv10.1-3hum_LI ou pScramble, dose de 0,2 µg) sobre a viabilidade de gliomas, em uso isolado ou em combinação com interferon gama (IFN-y, 25 ng/mL ) foi testado pelo ensaio de MTT. A redução de viabilidade obtida com a combinação do vetor pKv10.1-3hum_LI e IFN-y (40,4 %)foi superior àquela obtida com o uso isolado de ambos, 16,0% e 11,4%, nesta ordem (p < 0,05). Este efeito sinérgico não foi observado com o vetor controle negativo pScramble, o que indica tratar-se de efeito sequência-específico, ou seja, dependente da sequência do shRNA expresso pelo vetor pKv10.1-3hum_LI. Em síntese, o presente estudo mostra que é possível silenciar a expressão de hEag1 de gliomas via siRNAs sintéticos. Além disto, revela a importância de hEag1 para a viabilidade celular do glioma, principalmente durante a injúria por IFN-y. No sentido tecnológico, o atual estudo apresenta um protocolo inovador com potencial uso na terapêutica de gliomas, baseado na associação de RNAi sobre hEag1 com o agente imunomodulador IFN-y. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Glioma is the most common type of primary malignant brain tumor. The disease presents poor clinical outcome and the treatment is essentially palliative. Among the genetic changes that confer capability to tumor cells is the hEag1 gene overexpression. RNA interference (RNAi) has rapidly advanced into a practical technique for mammalian gene function studies, through post-transcriptional genetic silencing. The technique was used in the present study to silence hEag1 gene in glioma cells in culture. We first identified RNAi targets in the coding region of hEag1 (NM_172362.2) by using algorithms based on artificial neural networks. Twenty-five hEag1 RNAi targets were found, with scores ranging from 0.82 to 0.87; the two highest rated were selected. They were chemically synthesized as short interfering RNAs (siRNAs), and designated e2_hEag1 and e8_hEag1, according to the targeted exon. Positive and negative siRNA controls were the previously published Kv10.1-3, and the scramble All Star (Qiagen), respectively. We first determined the time-point (4h, 8h, or 48h) and siRNA concentration (18.75 nM, 37.5 nM, or 75.0 nM) that provide the highest silencing effect, by using RT-qPCR. The best hEag1 knock-down occurred at 8h post-transfection with 18.75 nM siRNA concentration. We used this experimental condition to compare the two new siRNAs - e2_hEag1 and e8_hEag1 – with the positive control Kv10.1-3. Both siRNAs in test produced higher silencing effects compared to Kv10.1-3 (p < 0.05). The mRNA fold decrease varied from 0.46 to 0.52, according to each transfected siRNA e2_hEag1 or e8_hEag1, respectively. Finally, we evaluated whether an expressed short hairpin RNA (shRNA) to the same hEag1 Kv10.1-3 target sequence (5´- GTCCACTTGGTCCATGTCCAG 3´) would decrease the glioma cell viability. The expression vectors (pKv10.1-3hum_LI or a scramble control one pScramble, dose 0.2 µg) were transfected into glioma cells, with or without interferon gamma concurrent treatment (IFN- y, 25 ng/mL ) viability was determined by MTT assay. The association of the vector pKv10.1-3hum_LI and IFN- y decreased the glioma cell viability to 40.4%, which surpassed the results obtained from their isolate use, 16.0% and 11.4%, respectively (p<0.05). As pScramble showed no synergism with IFN- y we consider the pKv10.1-3hum_LI effects were sequence-specific. In conclusion, this study showed the ability of two unpublished siRNAs to knock-down hEag1. Our results are in agreement with previous data that established a role for Eag1 in the tumor cell viability. This role seems to be even more important during IFN-y injury. Regarding to biotechnology, this study presents an innovative treatment able to reduce the glioma cell viability, based on the association of shRNA expression vector to hEag1 and the immunomodulatory agent IFN- y.

A transferência de material genético para dentro das células de um indivíduo com o objetivo de conferir um benefício terapêutico ao corrigir uma anormalidade ou proporcionar às células uma nova função constitui a essência da terapia gênica. Seu princípio baseia-se no entendimento de que algumas doenças são causadas por defeitos em um ou mais genes, levando à produção descontrolada ou à supressão de uma proteína essencial para o funcionamento das células. Doenças monogênicas (como os erros inatos do metabolismo), câncer, doenças cardiovasculares, desordens neurodegenerativas e doenças adquiridas (infecciosas, por exemplo) são alvos da terapia gênica. Na terapia gênica, o agente terapêutico em questão é o material genético de interesse. Tanto os elementos regulatórios quanto o gene de interesse são clonados em um plasmídio de expressão, que é, então, utilizado para a construção de vetores de transferência virais e não virais. Bicamadas lipídicas microscópicas denominadas lipossomos são vetores não virais comumente utilizados. Este trabalho teve como objetivo iniciar uma adaptação das abordagens da farmacologia ao estudo de vetores não virais em terapia gênica e padronizar a detecção da green fluorescent protein (GFP) por espectrofotometria de fluorescência, determinando o tempo de expressão máxima dessa proteína em cultura de células HepG2 e obtendo-se, assim, um método quantitativo para avaliação da eficiência de transfecção de vetores e parâmetros de tempo para futura detecção da GFP in vivo. É possível traçar paralelos entre a farmacoterapia e a terapia gênica. A comparação entre as composições de formulações farmacêuticas e de vetores de transferência leva-nos a pensar que o gene de interesse corresponderia à pró-droga, enquanto a proteína expressa equivaleria à droga, uma vez que se constitui no componente terapeuticamente ativo. Os demais elementos presentes nos plasmídios, como os promotores e sítios de poliadenilação, corresponderiam aos excipientes e o vetor de transferência como um todo equivaleria à formulação farmacêutica. A detecção da GFP expressa por células HepG2 transfectadas pelo plasmídio pTracer associado a LipofectamineTM2000 mostrou-se semi-quantitativamente possível por espectrofotometria de fluorescência. O tempo de expressão máxima desta proteína neste estudo foi 48 horas, sendo este também o tempo máximo de análise. É necessário, portanto, que os tempos de análise da expressão protéica sejam expandidos. A adaptação de abordagens farmacológicas pode contribuir para o aprimoramento técnico necessário para que a terapia gênica torne-se uma forma de tratamento amplamente difundida.

Uma abordagem alternativa para a terapia gênica somática é a entrega da proteína terapêutica através da implantação de células geneticamente modificadas com capacidade de superexpressar o gene de interesse. Os mecanismos de encapsulação foram projetados para proteger as células da rejeição do organismo hospedeiro e para prevenir que as células modificadas se espalhassem, ao mesmo tempo em que permite a secreção protéica. As esferas de alginato formam uma estrutura semi-permeável conveniente para a injeção in vivo. Neste estudo, um protocolo laboratorial eficaz foi otimizado para gerar micro cápsulas de alginato de cálcio com forma e tamanho uniformes, contendo células viáveis. A encapsulação de células baby hamster kidney (BHK) em esferas de alginato foi executada utilizando um dispositivo simples montado com um cilindro de ar comprimido e uma bomba peristáltica. O fluxo de 100 mL/h da solução contendo as células e o fluxo de 10 L/min de ar comprimido geraram as melhores cápsulas em relação ao tamanho e a uniformidade das esferas. As células se mantiveram viáveis em cultura por quatro semanas, sem apresentar sinais de necrose, e a difusão protéica foi observada durante estas quatro semanas. Os resultados destes estudos in vitro demonstram claramente que o micro isolamento de células BHK em alginato, utilizando este dispositivo simples, pode prover um ambiente capaz de preservar as células vivas e viáveis. Além disso, as células encapsuladas sob as condições descritas nesse trabalho, possibilitam a difusão de β-gal mesmo após quatro semanas de tratamento, tornando-se assim potencialmente compatíveis com a entrega de proteína terapêutica. / An alternative approach to somatic gene therapy is to deliver the therapeutic protein by implanting genetically modified cells that could overexpress the gene of interest. Microencapsulation devices were designed to protect cells from host rejection and prevent the foreign cells from spreading while allowing protein secretion. Alginate beads form a semi-permeable structure that is suitable for in vivo injection. In this study we report an effective laboratory protocol to generate calcium alginate microcapsules, following optimization of uniformly shaped and sized particles that contain viable cells. Encapsulation of baby hamster kidney (BHK) cells in alginate beads was performed using a simple device assembled with a cylinder of compressed air and a peristaltic pump. Cell suspension flow of 100 mL/h and air jet flow of 10 L/min allowed best size and shape uniformity of beads. Cells were maintained viable in culture for 4 weeks, with no signs of necrosis, and protein diffusion was observed during these weeks. Results of these in vitro studies clearly demonstrated that microisolation of BHK cells in alginate using a simple assembly device could provide an environment that is capable of preserving live and viable cells. In addition, encapsulated cells under the conditions described were able to secrete β- galactosidase even after four weeks of treatment, thus becoming potentially compatible with therapeutic protein delivery.

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença lisossomal. A enzima envolvida com essa doença é a a-L-iduronidase (IDUA), e suas alterações levam a depósitos dos glicosaminoglicanos heparan e dermatan sulfato. As características fenotípicas da doença compreendem entre outras características malformações ósseas, hepatoesplenomegalia, problemas cardíacos, opacidade da córnea e retardo mental. O tratamento de MPS I atualmente se baseia em reposição enzimática e transplante de medula óssea. Levando em conta que esses tratamentos ainda não levam a uma correção dos danos ao sistema nervoso central (SNC), há necessidade do desenvolvimento de novos tratamentos para MPS I. Ainda outro problema da MPS I é a falta de estudos sobre os danos fisiológicos resultantes, principalmente no SNC. Visando contribuir com estes pontos, nosso trabalho teve como objetivo (a) o desenvolvimento de três vetores virais para posteriores ensaios pré-clínicos de terapia gênica e (b) o detalhamento da caracterização fisiopatológica de camundongos representando um modelo para MPS I, enfocando alguns aspectos do SNC. Foram produzidos três vetores virais com o cDNA da IDUA humana. O vetor baseado no vírus da imunodeficiência humana (HIV), apesar de baixos títulos virais, foi capaz de aumentar em até 60 vezes a atividade da IDUA nas células transduzidas. Um segundo vetor, baseado no vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV) foi capaz de transduzir células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea do modelo murino de MPS I, sendo assim ótima ferramenta para terapia gênica ex vivo. O terceiro vetor, baseado no vírus da imunodeficiência felina (FIV) mostrou funcionalidade inferior quando comparado aos outros sistemas virais, e deve ser aperfeiçoado para utilização terapêutica. A caracterização do modelo foi feita através do estudo da fosforilação de proteínas de neurofilamentos em diferentes estruturas do cérebro de camundongos MPS I. Os resultados mostraram, além de alterações na fosforilação direta das proteínas analisadas, uma hiperfosforilação na ERK1/2 de córtex e hipocampo. Depósitos de gangliosídeos foram investigados de forma individual no cerebelo, córtex, hipocampo e hipotálamo, sendo detectadas diferenças específicas para cada estrutura. Ainda foram realizados estudos da neurotransmissão glutamatérgica e com isso foi identificada uma diminuição na captação de glutamato em hipocampo e córtex nos camundongos MPS I, além de uma diminuição no binding para glutamato no hipocampo. Como conclusão desses estudos, foram desenvolvidos vetores eficientes para transferência do gene terapêutico e, adicionalmente, os danos fisiológicos causados pela doença no SNC foram melhor elucidados no modelo murino de MPS I. As informações obtidas aqui serão de grande importância principalmente quando associadas a ensaios de terapia gênica, pois as características encontradas no SNC podem ser usadas para acompanhamentos de ensaios préclínicos usando os vetores desenvolvidos no trabalho. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a monogenic disease resulting from a defect in the gene that encodes the lysosomal hydrolase a-L-iduronidase (IDUA) and characterized by accumulation of glycosaminoglycans (GAGs) heparan and dermatan sulfate. Phenotypic characteristics involve bone malformations, hepatosplenomegaly, heart problems, corneal opacity and mental retardation. Treatment of MPS I is currently based on enzymatic replacement and bone marrow transplantation. Since these treatments are not capable of correcting central nervous system (CNS) effects of the disease, new therapeutic approaches are needed. One of the problems in the investigation of MPS I is the paucity of studies about resulting physiological consequences, particularly those related to the CNS. Aiming to contribute to these aspects of MPS I, this study proposes (a) the development of three viral vectors to be used in gene therapy preclinical studies, and (b) the further investigation of physiopathological alterations in the CNS of a murine model of MPS I (MPS I mice). Three viral vectors, carrying the human IDUA gene, were produced. The vector based on the human immunodeficiency virus (HIV) was produced in low titers, but induced a 60-fold increase in the baseline activity of IDUA in transduced cells. A second vector, based on the Moloney murine leukemia virus (MoMLV), was capable to transduce mesenchymal stem cells isolated from the bone marrow of MPS I mice, representing an interesting tools for ex vivo gene therapy protocols. The third vector, was based on the feline immunodeficiency virus (FIV), was functionally inferior to the other two systems and needs optimization to be therapeutically useful. The model was characterized by the investigation of phosphorylation patterns of neurofilament proteins in different regions of the brain of MPS I mice. The results showed that, besides alterations in the direct phosphorylation profile of the proteins analyzed, ERK1/2 was hyperphosphorylated in the cortex and hippocampus. Ganglioside storage was individually investigated in the cortex, cerebellum, hippocampus and hypothalamus, and specific differences were observed for each structure. An analysis of glutamatergic neurotransmission was also performed. MPS I animals showed a decrease in the glutamate uptake in the cortex and hippocampus. In addition, glutamate binding was decreased in the hippocampus. In conclusion, the present work resulted in the development of efficient viral vectors for the transfer of the therapeutic gene, and CNS physiological damages due to the disease were characterized in the murine model of MPS I. These results will be of great importance particularly when associated to gene therapy trials, since the CNS characteristics described in this work may be used for the follow-up of preclinical assays with the viral vectors developed.