IntroducciónLas b(l 3)(l 4) glucanasas son enzimas de gran interés biotecnólogico tanto en la industria cervezera como en la de fabricación de piensos. Los objetivos de esta tesis han sido: rediseñar la glucanasa de bacillus licheniformis con objeto de tratar de mejorar la actividad enzimática y determinar la función del lazo mayor del centro activo en dicho proceso, así como analizar y rediseñar la estabilidad térmica del enzima, en particular determinar la influencia del lazo mayor en la desnaturalización térmica, relacionándolo con el proceso y tipo de plegamiento.Análisis de los mutantes de saturación en la posición 58 de glucanasas1. La reducción de volumen de la cadena lateral aumenta la actividad, aumentado la constante catalítica kcat, si bien disminuye la Km. El mutante M58G presenta la actividad más alta, hasta 6 veces más que el silvestre, y el mutante M58A presenta más de 4 veces la actividad del silvestre, ambos, en términos de kcat/Km. 2. Los residuos hidrófilos disminuyen la actividad. 3. Unicamente en mutantes aromáticos como M58F y M58W, se aprecia una disminución de valores de Km, respecto al enzima silvestre. El análisis de la termorresistencia1. Con respecto al medio, serían claves el pH (por pérdida de interacciones pH dependientes), el tampón (por su posible papel quelante),y la presencia de sustrato (porque estabilizaría).2. Con respecto a la estructura serían claves los aminoácidos del lazo y la coordinación del Ca++. La coordinación del Ca++ puede ser mejorada introduciendo una nueva interacción entre el catión y la beta 15, como en el caso del mutante N236D. 3. Finalmente, la termoinactivación de la glucanasa de Bacillus licheniformis, en todos los mutantes estudiados, siguen un patrón bifásico. Su análisis cinético permite justificar el efecto de diversos mutantes y el comportamiento del enzima frente a la temperatura. / IntroductionThe (l-3)(l-4) glucanases are enzymes of great biotechnologyc interest in the brewery industry and in the manufacture of fodder. One objective of this thesis is to redesign the glucanase of bacillus licheniformis trying to improve its enzymatic activity to determine the function that the big loop, situated in the active centre, in this process. Another objective is to analyse and redesign the thermal stability of the enzyme, determining, in particular, the influence of the big loop in the thermal denaturation, and the relation with the process and type of folding.Analysis of the saturation at position 58 of glucanase 1. The reduction of volume of the lateral chain increases the activity, increasing the catalytic constant kcat, although the Km diminishes. Mutant M58G shows the highest activity, up to 6 times more than the wild type, and mutant M58A shows more than 4 times the activity of the wild type, both, in terms of kcat/Km. 2. Hydrophilic residues diminish the activity. 3. Only in the aromatic mutants, like M58F and M58W, we can observe that the Km values diminish, with respect to the wild enzyme. The analysis of the thermoresistance 1. Some factors of the buffer are essential: pH (by loss of pH dependent interactions ), the buffer composition (by its possible chelant action) and the substrate presence (it would stabilize the enzyme).2. Regarding to structure, the amino acids of the loop and the coordination of the Ca++ would be key elements. The coordination of the Ca++ can be improved introducing a new interaction between the cation and beta 15, as in the case of mutant N236D. 3. Finally the thermoinactivation, of the glucanase of Bacillus licheniformis, in all of the mutants studied, follows a two-phases pattern. The kinetic analysis justifies the effect of several mutants and the behaviour of the enzyme versus the temperature.

La albúmina de huevo es una compleja mezcla de proteínas que contiene todos los aminoácidos esenciales. Se utiliza como suplemento alimenticio, por sí solo o mezclado con otros componentes. La industria de productos de huevo elabora, según la temperatura de pasteurización que utilice, un producto con buenas propiedades de batido obtenido por tratamiento térmico del polvo a 72°C y otro con excelentes propiedades de formación de gel que se obtiene cuando se aplica 82°C, ambos procesos por un tiempo de 14 días en cuarto caliente. En estos procesos se mejoran las cualidades funcionales de este producto pero se aumenta en forma proporcional la supervivencia y el incremento de la termorresistencia de Salmonella, bacteria usada como organismo centinela para el establecimiento de los programas de pasterización de productos de huevo. Además es sabido que Salmonella constituye una de las principales causas de morbilidad en el mundo. Durante las últimas décadas, el número de brotes de salmonelosis se han asociado con el consumo de alimentos listos para el consumo de bajo contenido de humedad, que si bien han resultado poco frecuentes han afectado a un gran número de personas. Entre estos, la albúmina de huevo deshidratada es un alimento que puede presentar riesgo de contaminación con Salmonella ya sea debido a que el tratamiento térmico puede no destruirla totalmente o puede producirse una contaminación posterior al proceso de secado. Es también conocido que Salmonella presenta una inusual resistencia a las condiciones de stress y su respuesta a los tratamientos térmicos puede ser diferente si las cepas se encuentran pre adaptadas a condiciones ácidas. Por esta razón, este estudio conducirá a determinar la cinética de muerte térmica de tres serotipos: Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Montevideo aisladas de huevo, e inoculada en albúmina deshidratada. Los estudios de muerte térmica se llevarán a cabo a las temperaturas de pasteurización industrial: 72, 77 y 82ºC. La cinética de muerte se estudiará en un cóctel de las cepas más termorresistentes. El efecto del estrés por pH ácido se evaluará previo cultivo de las cepas adaptadas a ácido, a pH 3.5. Adicionalmente se evaluará la respuesta a un choque térmico previo calentamiento a 50°C por 30 minutos. La optimización de los tratamientos térmicos requiere disponer de datos precisos del grado y biovariabilidad de la resistencia al calor de los microorganismos, teniendo en cuenta también las posibles respuestas de adaptación que pueden desarrollar cuando han sido sometidos a condiciones adversas. Estos resultados resultan importantes en el campo de la tecnología de alimentos y la seguridad alimentaria, dado que aportarán tiempos y temperaturas de muerte térmica de Salmonella en albúmina deshidratada, lo que permitirá a la industria reducir de manera más eficiente y eficaz el riesgo de contaminación con Salmonella en productos de bajo contenido de humedad. / Lound, LH. (2014). TERMORRESISTENCIA DE CEPAS DE SALMONELLA NATIVAS EN ALBÚMINA DE HUEVO DESHIDRATADA Y PASTEURIZADA. EFECTO DE LA ACTIVIDAD DE AGUA Y DEL CHOQUE TÉRMICO [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/39372

La tendencia actual de los consumidores a adquirir alimentos con alta calidad sensorial y alto valor nutritivo y funcional está haciendo que las industrias de procesado desarrollen tecnologías capaces de combinar estas propiedades con la innegociable seguridad alimentaria. En el caso de los zumos de frutas se trata de conseguir este objetivo combinando tratamientos mínimos con la conservación refrigerada del producto durante su periodo de vida comercial, que suele ser del orden de dos meses. Se han descrito tratamientos suaves de pasteurización de zumos ácidos, como el de naranja, que cumplen este objetivo. En el caso de la fresa, no se ha encontrado ninguna referencia bibliográfica sobre tratamientos de este tipo. Por ello, el objetivo planteado en esta tesis ha sido el estudio del efecto de la intensidad del tratamiento térmico en diferentes propiedades relacionadas con la calidad y estabilidad nutritiva, funcional y sensorial del puré de fresa. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que el tratamiento térmico más intenso (90ºC-2 min) conlleva un aumento de la viscosidad y del área relativa de histéresis, relacionado con un incremento de la fracción de pectina hidrosoluble. No obstante, también son las muestras estructuralmente más estables durante el almacenamiento. En cuanto a su aceptación sensorial, cambio en el color, contenido en antocianinas, vitamina C y actividad antirradical no hay diferencias entre los diferentes tratamientos térmicos aplicados. En el almacenamiento refrigerado se produce una pequeña pérdida de algunos parámetros de calidad, pero estas pérdidas son mucho más intensas si el puré de fresas se conserva a temperatura ambiente. Como conclusión se sugiere obtener un puré de fresa estéril, mediante la técnica de envasado en caliente y posterior enfriamiento de los envases, por ser el tratamiento más seguro y de aplicación industrial más sencilla, y conservar el producto en refrigeración durante su vida comercial. / Osorio Mora, O. (2008). Influencia de tratamientos térmicos en la calidad y estabilidad del puré de fresa (Fragaria x ananassa, cv Camarosa) [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/3041