We report herein that IL-10-treated dendritic cells (DC) can be used effectively to reverse established severe asthma-like disease in a mouse model. Our lab had shown previously that allergen-presenting splenic CD8¦Á+ DCs could ¡Ö50% reduce airway hyper responsiveness (AHR), eosinophilia, and Th2 responses in asthma-phenotype mice, but only marginally reduce IgE/IgG1 levels. We now show that bone marrow-derived DCs that have been differentiated in the presence of IL-10 (DCIL-10) are effective in reversing the asthma phenotype. Co-culture of DCIL-10 with T memory (TM) cells from asthma-phenotype mice was associated with lack of Th2 responses, and this was partially reversed by IL-2. Immunostimulatory DC activated these Th2 cells. <i>In vivo</i>, delivery of allergen-pulsed DCIL-10, either into the airway or intraperitoneally abrogated AHR from weeks 3-10 post-treatment, and ameliorated lung eosinophilia and Th2 (IL-4, -5, -9, & -13, IgE) responses, as well as circulating allergen-specific IgE responses for at least 32 weeks following treatment. Repeated OVADCIL-10 treatments kept AHR normalized for 8 weeks as well as Th2 responses significantly low. In vivo, delivery of anti-IL-10R, but not anti-TGF-¦Â from day 12-21 after treatment had moderate effects on DCIL-10-driven tolerance, but 1-methyl tryptophan (inhibitor of indoleamine-2,3-dioxygenase) treatment had significant effects on Th2 responses. The mechanisms mediating tolerance in vivo are likely complex, but we speculate that infectious tolerance sustains this regulatory activity during the 32-week period in which we have observed tolerance to be in place.

We report herein that IL-10-treated dendritic cells (DC) can be used effectively to reverse established severe asthma-like disease in a mouse model. Our lab had shown previously that allergen-presenting splenic CD8¦Á+ DCs could ¡Ö50% reduce airway hyper responsiveness (AHR), eosinophilia, and Th2 responses in asthma-phenotype mice, but only marginally reduce IgE/IgG1 levels. We now show that bone marrow-derived DCs that have been differentiated in the presence of IL-10 (DCIL-10) are effective in reversing the asthma phenotype. Co-culture of DCIL-10 with T memory (TM) cells from asthma-phenotype mice was associated with lack of Th2 responses, and this was partially reversed by IL-2. Immunostimulatory DC activated these Th2 cells. <i>In vivo</i>, delivery of allergen-pulsed DCIL-10, either into the airway or intraperitoneally abrogated AHR from weeks 3-10 post-treatment, and ameliorated lung eosinophilia and Th2 (IL-4, -5, -9, & -13, IgE) responses, as well as circulating allergen-specific IgE responses for at least 32 weeks following treatment. Repeated OVADCIL-10 treatments kept AHR normalized for 8 weeks as well as Th2 responses significantly low. In vivo, delivery of anti-IL-10R, but not anti-TGF-¦Â from day 12-21 after treatment had moderate effects on DCIL-10-driven tolerance, but 1-methyl tryptophan (inhibitor of indoleamine-2,3-dioxygenase) treatment had significant effects on Th2 responses. The mechanisms mediating tolerance in vivo are likely complex, but we speculate that infectious tolerance sustains this regulatory activity during the 32-week period in which we have observed tolerance to be in place.

Zielstellung: Ziel dieser kumulativen Dissertationsarbeit war die vergleichende Untersuchung der Wirtsantwort in verschiedenen Mauslinien nach Infektion mit Streptobacillus (S.) moniliformis und Rodentibacter (R.) pneumotropicus mit Anzeigeparametern für die Klinik, die Pathologie und die Immunantwort. Es sollten neue erregerspezifische enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) evaluiert und durch die Bestimmung der Immunglobulin G (IgG)-Subklassen mausstammspezifische Unterschiede in der Immunantwort aufgezeigt werden. Darüber hinaus waren Sentinelsysteme zu bewerten. Material und Methoden: Es wurden BALB/c und C57BL/6-Mäuse intranasal mit S. moniliformis- oder R. pneumotropicus infiziert und mit Kontaktsentinels vergesellschaftet. Zusätzlich wurde benutzte Einstreu der Infektionskäfige auf Käfige mit nichtinfizierten CD1-Mäusen (Einstreu-Sentinels) übertragen. Die Infektionsgruppen wurden über 4 Wochen, die Sentinels mindestens 7 Wochen alle 12 Stunden klinisch untersucht und die Verläufe dokumentiert. Am Ende der Experimente bzw. bei Erreichen spezifischer Abbruchkriterien wurden die Mäuse tierschutzgerecht euthanasiert und definierte Organproben für pathohistologische und bakteriologische Untersuchungen gewonnen. Die Erreger wurden dabei massenspektrometrisch sowie mittels polymerase chain reaction (PCR) differenziert und in Proben des Respirationstraktes quantitativ erfasst. Erregerspezifische Antikörper wurden in tracheonasaler Spülflüssigkeit und im Serum in eigens etablierten ELISA‘s auf Basis von Ganzzellextrakten bestimmt. Weiterhin erfolgte die Messung des Verhältnisses der IgG-Subtypen IgG1 und IgG2 im ELISA. Ergebnisse: Der Infektionsversuch mit S. moniliformis bestätigte mit einer Mortalität von 75% die bekannte hohe Infektionsanfälligkeit der C57BL/6-Mäuse im Gegensatz zu BALB/c, die keine Krankheitsanzeichen entwickelten. Die wichtigsten pathologischen Manifestationen waren eitrig-nekrotisierende Lymphadenitiden und Pneumonien in Verbindung mit der Reisolation des Infektionsstammes. Mithilfe des etablierten ELISA‘s gelang der Nachweis erregerspezifischer IgG-Antikörper im Serum der Tiere beider Linien. Bei den Kontaktsentinels konnte, bis auf eine Ausnahme, weder kulturell, noch serologisch eine Infektion nachgewiesen werden. Gleiches gilt für alle Einstreu-Sentinels. Molekularbiologisch wurde aber Erreger-DNA in den Lungen der Sentinels festgestellt. Die Infektion mit einem R. pneumotropicus Stamm, welcher genotypisch positiv für alle drei bekannten RTX-Toxine dieses Erregers war, führte zu einer unerwartet hohen Morbidität und Mortalität in beiden Mauslinien. In frühzeitig euthanasierten Tieren beider Linien konnten katarrhalisch-eitrige bis nekrotisierende Bronchopneumonien sowie eine Dissemination des Belastungsstammes in zahlreiche innere Organe nachgewiesen werden. In überlebenden Tieren beider Linien wurde eine deutliche Kolonisation respiratorischer Schleimhäute mit dem Belastungsstamm trotz z.T. hoher mukosaler IgA-Spiegel und Serokonversion im Blut nachgewiesen. Überlebende C57BL/6 Mäuse zeigten eine signifikant niedrigere Bakterienlast in inneren Organen als BALB/c Mäuse. In allen Kontaktsentinels, aber nicht in einem einzigen Einstreu-Sentinel, konnte kulturell und indirekt serologisch eine Infektion mit R. pneumotropicus nachgewiesen werden. Die Bestimmung der IgG-Subklassen in den Seren der C57BL/6-Mäuse beider Infektionsstudien ergab eine Verschiebung des Verhältnisses IgG2/IgG1 von unter 0,8 vor zu über 1,6 nach Infektion. Dies weist auf eine T-Helferzell (Th) 1-dominierte Immunantwort hin. BALB/c-Mäuse behielten dagegen ein Verhältnis unter 0,8 auch nach der Infektion bei, sodass auf eine Th2- Antwort zu schließen war. Schlussfolgerungen: Sowohl für S. moniliformis als auch für R. pneumotropicus konnten Tiermodelle mit diversen Anzeigeparametern etabliert werden, welche für Folgestudien zur Pathogenese oder Immunprophylaxe genutzt werden können. Für beide Erreger wurden neue sensitive und spezifische ELISA-Protokolle in die Diagnostik eingeführt. Kontaktsentinels, aber nicht Einstreu-Sentinels, sind gut geeignet, um R. pneumotropicus-Infektionen nachzuweisen. Die beobachtete stammspezifische Klinik, Pathologie und Immunantwort der C57BL/6-Mäuse nach experimenteller S. moniliformis-Infektion sprach für eine pathologische Th1-Immunantwort. Im Gegensatz dazu war im R. pneumotropicus – Infektionsversuch die Th1-Immunantwort der C57BL/6-Mäuse mit einer effektiveren Reduktion des Erregers in inneren Organen assoziiert. Die unerwartet hohe Morbidität und Mortalität im R. pneumotropicus –Infektionsversuch weist auf eine besonders hohe Virulenz des eingesetzten Stammes hin, sodass in dieser Arbeit erstmalig ein septikämischer Verlauf in Wildtyp-Mäusen nach intranasaler R. pneumotropicus-Infektion nachgewiesen werden konnte.:Inhaltsverzeichnis (I) Abkürzungsverzeichnis (III) 1 Einleitung (1) 2 Literatur (3) 2.1 Streptobacillus moniliformis (3) 2.1.1 Allgemeine Charakteristika (3) 2.1.2 Differenzierung von Streptobacillus spp.(4) 2.1.3 Serologische Methoden zum indirekten Nachweis einer Streptobacillus moniliformis - Infektion (5) 2.1.4 Epidemiologie der durch Streptobacillus moniliformis hervorgerufenen Zoonose (6) 2.1.5 Klinik und Pathologie der Streptobacillus moniliformis-Infektion bei Nagetieren (8) 2.1.6 Klinik und Pathologie der Streptobacillus moniliformis-Infektion in Menschen und anderen Nebenwirten (9) 2.1.7 Pathogenese und Virulenzfaktoren (10) 2.1.8 Prävalenz in Nagern (11) 2.1.9 Sanierung Streptobacillus moniliformis infizierter Nagetierbestände und Prävention (12) 2.2 Rodentibacter (R.) pneumotropicus und heylii (Pasteurella (P.) pneumotropica Biotyp Jawetz und Heyl) (14) 2.2.1 Allgemeine Charakteristika (14) 2.2.2 Ursprüngliche Einteilung in Biotypen und Reklassifikation zu Rodentibacter spp. (14) 2.2.3 Differenzierung von Rodentibacter spp. (15) 2.2.4 Serologische Methoden zum indirekten Nachweis einer Rodentibacter- Infektion (15) 2.2.5 Übertragung (15) 2.2.6 Klinik und Pathologien der Rodentibacter-Infektion in Nagern (16) 2.2.7 Pathogenese und Virulenzfaktoren (18) 2.2.8 Prävalenz (19) 2.2.9 Sanierung Rodentibacter pneumotropicus infizierter Nagetierbestände und Prävention (20) 2.3 Mäuse als Versuchstiere (22) 2.3.1 Inzucht-Stämme (22) 2.3.1.1 Merkmale, Verwendung und Historie der BALB/c-Wildtypmäuse (22) 2.3.1.2 Merkmale, Verwendung und Historie der C57BL/6-Wildtypmäuse (23) 2.3.1.3 Unterschiede der Immunreaktionen in C57BL/6- und der BALB/c- Mäusen (23) 2.3.2 Auszucht-Stämme (24) 2.3.2.1 Merkmale, Verwendung und Historie der CD1-Wildtypmäuse (24) 2.4 Gesundheitsmonitoring in Labortierhaltungen (25) 2.4.1 Empfehlungen der Federation of Laboratory Animal Science Associations (FELASA) (25) 2.4.2 Sentinelsysteme für das Gesundheitsmonitoring in Labormausbeständen (26) 3 Publikationen (28) 3.1 Fornefett J, Krause J, Klose K, Fingas F, Hassert R, Eisenberg T, Grunwald T, Müller U, Schrödl W, Baums CG. Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6J mice infected with Streptobacillus moniliformis. Microbes and Infection. 2018;20(2):101-110 (28) 3.2 Fornefett J, Krause J, Klose K, Fingas F, Hassert R, Benga L, Grunwald T, Müller U, Schrödl W, Baums CG. Comparative analysis of humoral immune responses and pathologies of BALB/c and C57BL/6 wildtype mice experimentally infected with a highly virulent Rodentibacter pneumotropicus (Pasteurella pneumotropica) strain. BMC Microbiology. 2018;18(1):45 (39) 4 Übergreifende Diskussion (51) 5 Zusammenfassung (59) 6 Summary (61) 7 Literaturverzeichnis (63) 7.1 Fachliteratur (63) 7.2 Internet (76) 7.3 Gesetzestexte (78) Anhang (79) i Ergänzende Abbildungen (79) ii Ergänzendes Material zu 3.1 “Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6J mice infected with Streptobacillus moniliformis” (81) iii Ergänzendes Material zu 3.2 “Comparative analysis of humoral immune responses and pathologies of BALB/c and C57BL/6 wildtype mice experimentally infected with a highly virulent Rodentibacter pneumotropicus (Pasteurella pneumotropica) strain” (83) Liste mit weiteren Veröffentlichungen Danksagung / Objective: Aim of this cumulative doctoral thesis was the comparative analysis of the host response in different mice strains infected with Streptobacillus (S.) moniliformis and Rodentibacter (R.) pneumotropicus with readout parameters for clinics, pathology and immune response. New pathogen specific enzyme linked immunosorbent assay’s (ELISA) were evaluated. Differentiation of immunoglobulin (Ig) G subclasses was conducted to reveal differences in the immune response between the two mice strains. Furthermore, sentinel systems were assessed. Materials and methods: BALB/c and C57BL/6 mice were infected intranasally with S. moniliformis or R. pneumotropicus and housed together with contact sentinels. Soiled bedding from infection cages was transmitted to cages with uninfected CD1 mice (bedding sentinels). Infection groups were observed for 4 weeks, sentinels for at least 7 weeks and the clinical course was documented. At the end of the experiments or when predefined termination criteria were reached, animals were humanely killed. Predefined organ samples were collected for pathohistological and bacteriological screenings. Pathogens were differentiated via mass spectrometry and via polymerase chain reaction (PCR). The specific bacterial load was quantified in samples of the respiratory tract. Pathogen-specific antibodies were detected in tracheonasal lavages and sera using newly established ELISAs based on whole cell extracts. Determination of the ratios of the IgG subtypes (IgG1 to IgG2) was conducted using ELISAs. Results: The S. moniliformis experiment confirmed the known high susceptibility of C57BL/6 mice with a mortality of 75%. This was in contrast to BALB/c, which developed no signs of illness. The major pathologies were purulent-necrotizing inflammations of the lymph nodes and the lung associated with detection of the challenge strain. Specific IgG-antibodies were detected in sera of both mice strains by the newly established ELISAs. In contact and bedding sentinels the infection was not detected by culture or indirectly by serology, except for one contact sentinel. However, pathogen DNA was detectable in the lungs of these animals via PCR. The infection with the R. pneumotropicus strain, which is genotypically positive for all 3 known RTX toxins of this pathogen, leaded to an unexpected high morbidity and mortality in both mice strains. In early losses a catharal-purulent to necrotizing bronchopneumonia as well as dissemination of the challenge strain in various inner organs was recorded. Efficient colonization of the respiratory mucosa through the challenge strain was detected in survivors of both lines despite high mucosal IgA levels and seroconversion in the blood. Surviving C57BL/6 mice showed a significant lower bacterial burden in inner organs than BALB/c. All contact sentinels were culturally and serologically positive for R. pneumotropicus infection in contrast to all bedding sentinels. Differentiation of IgG subclasses in sera of C57BL/6 mice of both experiments revealed a shift of the IgG2/IgG1 ratio from 0.8 prior to infection to 1.6 post infection suggesting a T helper (Th) 1-prone immune response. BALB/c mice remained under 0.8 after infection indicating a Th2-prone immune response. Conclusions: New animal models with various readout parameters were established for both S. moniliformis and R. pneumotropicus. These models can be used in future studies on pathogenesis and immunoprophylaxis. Sensitive und specific ELISA-protocols were established for both pathogens. Contact sentinels but not bedding sentinels are appropriate for detection of R. pneumotropicus-infections. The observed distinct clinic, pathology and immune response of C57BL/6 mice experimentally infected with S. moniliformis indicated on the one hand a pathological Th1 immune response. On the other hand, the Th1 response of C57BL/6 mice to R. pneumotropicus infection was associated with a more efficient clearance of the challenge strain in internal organs. The unprecedented high morbidity and mortality in the R. pneumotropicus experiment indicates high virulence of this strain. Accordingly, this work revealed for the first time septicaemia in wildtype mice after intranasal R. pneumotropicus-infection.:Inhaltsverzeichnis (I) Abkürzungsverzeichnis (III) 1 Einleitung (1) 2 Literatur (3) 2.1 Streptobacillus moniliformis (3) 2.1.1 Allgemeine Charakteristika (3) 2.1.2 Differenzierung von Streptobacillus spp.(4) 2.1.3 Serologische Methoden zum indirekten Nachweis einer Streptobacillus moniliformis - Infektion (5) 2.1.4 Epidemiologie der durch Streptobacillus moniliformis hervorgerufenen Zoonose (6) 2.1.5 Klinik und Pathologie der Streptobacillus moniliformis-Infektion bei Nagetieren (8) 2.1.6 Klinik und Pathologie der Streptobacillus moniliformis-Infektion in Menschen und anderen Nebenwirten (9) 2.1.7 Pathogenese und Virulenzfaktoren (10) 2.1.8 Prävalenz in Nagern (11) 2.1.9 Sanierung Streptobacillus moniliformis infizierter Nagetierbestände und Prävention (12) 2.2 Rodentibacter (R.) pneumotropicus und heylii (Pasteurella (P.) pneumotropica Biotyp Jawetz und Heyl) (14) 2.2.1 Allgemeine Charakteristika (14) 2.2.2 Ursprüngliche Einteilung in Biotypen und Reklassifikation zu Rodentibacter spp. (14) 2.2.3 Differenzierung von Rodentibacter spp. (15) 2.2.4 Serologische Methoden zum indirekten Nachweis einer Rodentibacter- Infektion (15) 2.2.5 Übertragung (15) 2.2.6 Klinik und Pathologien der Rodentibacter-Infektion in Nagern (16) 2.2.7 Pathogenese und Virulenzfaktoren (18) 2.2.8 Prävalenz (19) 2.2.9 Sanierung Rodentibacter pneumotropicus infizierter Nagetierbestände und Prävention (20) 2.3 Mäuse als Versuchstiere (22) 2.3.1 Inzucht-Stämme (22) 2.3.1.1 Merkmale, Verwendung und Historie der BALB/c-Wildtypmäuse (22) 2.3.1.2 Merkmale, Verwendung und Historie der C57BL/6-Wildtypmäuse (23) 2.3.1.3 Unterschiede der Immunreaktionen in C57BL/6- und der BALB/c- Mäusen (23) 2.3.2 Auszucht-Stämme (24) 2.3.2.1 Merkmale, Verwendung und Historie der CD1-Wildtypmäuse (24) 2.4 Gesundheitsmonitoring in Labortierhaltungen (25) 2.4.1 Empfehlungen der Federation of Laboratory Animal Science Associations (FELASA) (25) 2.4.2 Sentinelsysteme für das Gesundheitsmonitoring in Labormausbeständen (26) 3 Publikationen (28) 3.1 Fornefett J, Krause J, Klose K, Fingas F, Hassert R, Eisenberg T, Grunwald T, Müller U, Schrödl W, Baums CG. Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6J mice infected with Streptobacillus moniliformis. Microbes and Infection. 2018;20(2):101-110 (28) 3.2 Fornefett J, Krause J, Klose K, Fingas F, Hassert R, Benga L, Grunwald T, Müller U, Schrödl W, Baums CG. Comparative analysis of humoral immune responses and pathologies of BALB/c and C57BL/6 wildtype mice experimentally infected with a highly virulent Rodentibacter pneumotropicus (Pasteurella pneumotropica) strain. BMC Microbiology. 2018;18(1):45 (39) 4 Übergreifende Diskussion (51) 5 Zusammenfassung (59) 6 Summary (61) 7 Literaturverzeichnis (63) 7.1 Fachliteratur (63) 7.2 Internet (76) 7.3 Gesetzestexte (78) Anhang (79) i Ergänzende Abbildungen (79) ii Ergänzendes Material zu 3.1 “Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6J mice infected with Streptobacillus moniliformis” (81) iii Ergänzendes Material zu 3.2 “Comparative analysis of humoral immune responses and pathologies of BALB/c and C57BL/6 wildtype mice experimentally infected with a highly virulent Rodentibacter pneumotropicus (Pasteurella pneumotropica) strain” (83) Liste mit weiteren Veröffentlichungen Danksagung