Transforming growth factor beta (TGF-β) has been implicated in anterior subcapsular cataract (ASC) development. In the first section of this thesis, an in-vitro rat lens model was used to determine the role of matrix metalloproteinases during TGF-β-induced ASC. In the second part, an in-vivo TGF-β transgenic and Smad3 knockout model was used to examine the role of Smad3 signaling pathway in TGF-β-induced ASC development. Lastly, an in-vitro rat lens epithelial explant culture model was used to investigate the potential role of heat shock proteins (Hsps) in TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition (EMT). Optical, morphological and molecular changes were analyzed in theses studies. Results from cultured rat lenses show a significant increase of back vertex distance variability (decrease of sharpness and focus) during ASC development. Inhibition of MMPs eliminated the TGF-β-induced plaque formation. Similarly, the overexpression of TGF-β1 in transgenic mouse lenses leads to ASC formation and a decrease in lens optical quality in comparison to wild-type lenses, while TGF-β1/Smad3-/- (null) lenses show diminished TGF-β-induced effects. The plaques formed in the TGF-β1/Smad3-/- lenses are substantially smaller than in the TGF-β1/Smad3+/+ lenses. The morphological and molecular changes of TGF-β2/FGF-2 treated rat lens epithelial explants are similar to those found in the TGF-β2 treated rat lenses and transgenic TGF-β1 mouse lenses. Heat shock treatment prior to TGF-β treatment significantly reduced the effects of EMT in rat LECs. In conclusion, MMP inhibition prevented TGF-β-induced ASC formation whereas heat shock treatment and the absence of Smad3 protein expression only reduced the severity of TGF-β-induced effects.

During cell communication, cells produce secreted signals termed morphogens, which traffic through the tissue until they are received by target, responding cells. Using the fruit fly Drosophila melanogaster as a model organism, I have studied transforming growth factor-beta (TGF-beta) signal from the secreting to the receiving cells in the developing wing epithelial cells and at the neuromuscular junctions. Cell culture studies have suggested that cells modulate morphogenetic signaling by expressing the receptors and secreting the ligand in spatially defined areas of the cell. Indeed, I have found that TGF-beta ligands, receptors and R-Smads show a polarized distribution both in the epithelial cells and at the synapses. My results indicate that the cellular junctions define a signaling domain within the plasma membrane, to which TGF-beta signaling machinery is targeted. In the context of epithelial cells, the junctions play a role in TGF-beta signaling regulation through their component beta-cat. A complex forms between beta-cat and the R-Smad Mad, but the mechanism by which beta-cat modulates signaling is not yet understood. At the synapse, the sub-cellular localization of TGF-beta pathway components indicates the occurrence of an anterograde signal. Moreover, my results suggest a scenario in which TGF-beta signaling is coupled with synaptic activity: quanta of growth factor, released upon neurostimulation together with neurotransmitter quanta, could modulate therefore the development and the function of the synapse.

Le TGFE (Transforming Growth Factor-E) est une cytokine ayant de nombreusesfonctions au cours de la vie embryonnaire et de la vie adulte. Au cours de la cancérogenèse,le TGFE a un effet anti-tumoral sur les épithelia sains ou immortalisés, et acquière despropriétés facilitant la progression tumorale des épithélia transformés. Afin d'étudier cettedualité fonctionnelle du TGFE, nous avons choisi comme modèle d'étude l'adénocarcinomedu pancréas, une tumeur de très mauvais pronostic, qui représente la cinquième cause demortalité par cancer dans les pays développés. Les cancers du pancréas, dans leur grandemajorité, présentent des mutations activatrices de l'oncogène Kras, sécrètent de grandequantités de TGFβ et présentent des mutations inactivatrices au niveau de gènes régulateursde la voie du TGFβ. L'objectif général de mes travaux de thèse était de comprendre le rôle duTGFβ au cours des différentes phases de la cancérogenèse pancréatique grâce à l'utilisationde souris génétiquement modifiées. Tout d'abord, nous avons montré que l'activation cibléede la voie du TGFβ dans le pancréas coopérait avec l'oncogène Kras afin d'induire unepancréatite, une inflammation du pancréas favorisant le développement tumoral. Nous avonségalement démontré le rôle suppresseur de tumeur de TIF1γ, une protéine dont la fonction estméconnue mais qui a été proposée pour réguler la voie du TGFβ. En conclusion, mes travauxont tout d'abord contribué à une meilleure compréhension des mécanismes à l'origine del'inflammation du pancréas. Ceci ouvre de nouvelles perspectives de traitement visant àinactiver le programme pro-inflammatoire du TGFβ et ainsi d'inhiber l'effet pro-tumoral dela pancréatite. D'autre part, mes travaux ont permis de mettre en évidence une nouvelle voiesuppresseur de tumeur dans le pancréas. La caractérisation des programmes anti-tumorauxmis en jeu par TIF1γ devrait permettre de définir de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Diss. (sammanfattning) Linköping : Linköpings universitet, 2005. / Härtill 4 uppsatser.

Thesis (Ph. D.) -- University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2003. / Vita. Bibliography: 180-208.

A morfogênese das glândulas salivares envolve eventos complexos e coordenados, dependentes da interação epitélio-mesênquima e do microambiente. Fatores de crescimento coordenam vários desses processos biológicos e o fator transformador de crescimento-beta (TGF-) mostra-se relevante. Utilizando imunoistoquímica e imunofluorescência, a distribuição do TGF-1, 2 e 3 foi mapeada e sua expressão comparada com a expressão de marcadores de maturação em glândulas salivares humanas obtidas de fetos que tinham entre 4ª e 24ª semanas de vida intra-uterina. O TGF-1 foi detectado durante a fase pseudoglandular no mesênquima. Nas outras etapas da diferenciação glandular esse fator foi expresso no citoplasma das células acinares até a glândula salivar adulta. O TGF-2 foi detectado desde o estágio de botão inicial da glândula salivar. Sua expressão foi observada nas células ductais e sua presença aumentada ao longo da diferenciação glandular. O TGF-3 foi visto durante a fase pseudoglandular das glândulas salivares, inicialmente fraco nas células ductais e foi o único detectado em células mioepiteliais. A troca de subunidades de TGF- durante a maturação das glândulas salivares sugere mudanças estimuladas durante os complexos estágios de desenvolvimento dessas glândulas. O presente estudo reafirma essa evidência, e mostra que as subunidades do TGF- são fatores importantes durante a diferenciação de glândulas salivares. / Morphogenesis of salivary glands involves complex coordinated events. Synchronization between cell proliferation, polarization and differentiation, which are dependent on epithelialmesenchymal interactions and on the microenvironment, is a requirement. Growth factors mediate many of these orchestrated biological processes and transforming growth factor-beta (TGF- ) appears to be relevant. Using immunohistochemistry and immunofluorescence, we have mapped the distribution of TGF- 1, 2 and 3 and compared it with the expression of maturation markers in human salivary glands obtained from fetuses ranging from weeks 4 to 24 of gestation. TGF- 1 first appeared during pseudoglandular stage in the surrounding mesenchyme and, in the more differentiated stages, was expressed in the cytoplasm of acinar cells throughout the adult gland. The TGF- 2 was detected since the bud initial stage of the salivary gland. Its expression was observed in ductal cells and increased along gland differentiation. The TGF- 3 was detected from the pseudoglandular stage of the salivary gland, being weakly expressed on ductal cells, and it was the only factor detected on myoepithelial cells. The data suggest that TGF- have a role to play in salivary gland development and differentiation.

Pacientes submetidos por longos períodos à diálise peritoneal (DP) podem evoluir com fibrose e redução da capacidade de ultrafiltração da membrana peritoneal (MP). Essas alterações da MP são desencadeadas pela exposição prolongada às soluções de diálise peritoneal, peritonites de repetição e irritantes químicos que induzem inflamação, neoangiogênese e fibrose da MP. A ativação da via Transforming Growth Factor (TGF-beta)/Smad é um fundamental mecanismo mediador da fibrogênese peritoneal. Sendo assim, drogas que inibam a via TGF-beta/Smad são de especial interesse no tratamento da FP. O ácido valpróico (VPA) é um inibidor das histona desacetilases (iHDAC), enzimas que regulam a conformação da cromatina e a expressão gênica, com atividade anti-inflamatória e antifibrótica. O presente estudo tem como objetivo principal avaliar o efeito do VPA em um modelo experimental de fibrose peritoneal em ratos. Vinte e quatro ratos Wistar machos (peso inicial de 280 - 320g) foram dividos em 3 grupos experimentais: CONTROLE (n=8), animais normais que receberam injeções de salina intraperitoneal (IP); FP (n=8), animais que recereberam injeções IP de gluconato de clorexidina (GC) diariamente por 15 dias para indução de fibrose peritoneal; FP+VPA (n=8), animais com FP e tratados com VPA. O ácido valpróico (300mg/kg) foi administrado por gavage diariamente por 15 dias, simultaneamente à indução de fibrose peritoneal. Ao fim dos experimentos, amostras do tecido peritoneal foram coletadas para realização de histologia, imunho-histoquímica (IH), imunofluorescência (IF) e biologia molecular. A análise da MP dos animais do grupo FP revelou um espessamento significativo da camada submesotelial devido ao acúmulo de matriz extracelular e infiltrado inflamatório. O tratamento com VPA foi capaz de prevenir significativamente o espessamento da MP, mantendo a espessura do peritôneo do grupo FP+VPA similar a do grupo CONTROLE. Com relação à função peritoneal, a administração de VPA evitou a queda da ultrafiltração e aumento do transporte peritoneal de glicose induzidos pelo GC. Além disso, o VPA impediu o aumento da expressão de miofibroblastos e de fatores associados à fibrose (TGF-beta, FSP-1 e fibronectina) induzidos pelo GC. Interessantemente, o VPA reduziu de maneira significativa a expressão da Smad3, mediador intracelular crítico da sinalização TGF-beta/Smad, em relação ao grupo FP. Por outro lado, os animais tratados com VPA apresentaram um aumento da expressão peritoneal de fatores antifibróticos como a BMP-7 e Smad7, proteínas que contrarregulam as ações do TGF-beta. Além de atenuar a fibrose peritoneal, o VPA apresentou efeitos anti-inflamatório e antiangiogênico, demonstrado pela menor expressão de citocinas pró-inflamatórias, fatores quimiotáticos para macrófagos (MCP-1) e VEGF no grupo FP+VPA quando comparado ao grupo FP. Em resumo, o VPA foi capaz de bloquear o espessamento por fibrose da MP e preservar a sua função, além de proteger o peritônio contra a neoangiogênese e inflamação. Além disso, o VPA induziu um aumento da expressão de fatores antifibróticos na MP. Os resultados apresentados neste trabalho chamam a atenção para mecanismos envolvidos nas modificações da MP induzidas pela DP ainda pouco explorados e que podem constiuir potenciais alvos na prevenção do desenvolvimento da fibrose peritoneal associada à DP / Long term peritoneal dialysis (PF) can induce peritoneal fibrosis and loss of ultrafiltration capacity of peritoneal membrane (PM). These peritoneal changes are due to prolonged exposure to peritoneal dialysis solutions, chemical irritants and acute peritonitis episodes that induce inflammation, neoangiogenesis and PM fibrosis. The Transforming Growth Factor (TGF-?) is the main mediator involved in the development of peritoneal fibrosis. Thus, drugs that inhibit the TGF-?/Smad pathway or inflammation are of particular interest in the treatment of PF. Valproic acid (VPA) is an histone deacetylase (HDAC) inhibitor. HDACs are enzymes that regulate chromatin conformation and gene expression. Recent studies have described HDACi as promising drugs in the treatment of inflammatory and fibrotic diseases. The main aim of this study was to evaluate the effect of VPA in an experimental model of peritoneal fibrosis in rats. Twenty four Wistar rats (initial weight of 280-320g) were divided into three experimental groups: CONTROL (n = 8), normal animals that received only saline ip; FP (n = 8), peritoneal fibrosis was induced by daily Gluconate Clorhexedine (GC) intraperitoneal (IP) injections for 15 days; FP+VPA (n = 8), animals with peritoneal fibrosis and treated with VPA. Daily valproic acid (300mg/kg) doses were administered by gavage simultaneously with the induction of peritoneal fibrosis in the FP+VPA group. At the end of experiments, the animals were submitted to euthanasia and samples of peritoneal tissue were collected for histology, immunocytochemistry, immunofluorescence, and molecular biology. Also, a functional peritoneal test was performed. The FP group showed a significant thickening of PM due to the accumulation of extracellular matrix and inflammatory cellular infiltration. VPA treatment was able to significantly prevent PM thickening, maintaining the peritoneal thickness of the VPA group similar to that of the CONTROL group. The VPA administration also preserved peritoneal function in the FP+VPA group, avoiding the reduction of ultrafiltration and increasing of peritoneal glucose transport induced by GC. According to the histological changes mentioned above, the VPA hampered the upregulation of the pro-fibrotic genes (TGF-beta, FSP-1, and fibronectin) and increase in the myofibroblasts expression induced by GC injections. Interestingly, the peritoneal expression of phosphorylated Smad3 detected by immunohistochemistry and Smad3 mRNA was significantly higher in the FP group. However, this effect was attenuated by VPA treatment. On the other hand, VPA was able to induce an increase in the expression of the antifibrotic factors, such as BMP-7 and Smad7, in the peritoneal membrane. Besides its antifibrotic activity, VPA also showed anti-inflammatory and anti-angiogenic effects. Animals of the FP+VPA group showed a significant reduction of the PM expression of pro-inflmmatory cytokines, macrophage chemoattractants and, VEGF expression when compared with FP group. In conclusion, we have shown that VPA inhibits the progression of peritoneal fibrosis in a CG-induced peritoneal fibrosis model in rats. VPA inhibited different and important mechanisms involved in peritoneal membrane modifications induced by PD, as activation of TGF-beta/Smad pathway, inflammation, and angiogenesis. Notably, VPA induced the expression of antifibrotic factors. Our results are very interesting and shed lights on a new perspective for the treatment of peritoneal fibrosis. However, this is an exploratory study and future studies are needed before to translate this experimental finding into clinical application

Em virtude dos pobres resultados obtidos no tratamento do Câncer de Pulmão, seja em estágios iniciais ou na doença avançada localmente, há a necessidade de se desenvolver marcadores moleculares e imunohistoquímicos que possam prever o comportamento tumoral. Ácido Hialurônico (HA) é um componente da matriz extracelular, responsável pela hidratação e manutenção do equilíbrio osmótico tecidual. Concentrações de HA estão elevadas em vários tipos de cânceres, incluindo pulmão. Hialuronidases (HAases), são uma família de enzimas relacionadas com a propagação de infecções bacterianas, toxinas de venenos e progressão tumoral. A quebra do HA em pequenos fragmentos (3-25 dissacarídeos) promovidos pela ação das HAases tipo Hyal1, Hyal2 e Hyal3, está relacionada à promoção do câncer através da indução da angiogênese e estímulo a proliferação através de ativação da via tirosina quinase. Algumas isoformas de HAases, descritas como produto de splicing alternativo, possuem atividade enzimática diversificada. A heterogeneidade de expressão das HAases foi identificada em alguns tipos de câncer e pode ser correlacionada com o comportamento diferenciado dos tumores. Em uma primeira instância, o perfil de expressão das HYAL foi avaliado em tecidos pulmonares tumorais e normais de 69 tumores ressecados de pacientes com adenocarcinomas (ADC) e carcinomas de células escamosas (CCE) oriundos do Hospital das Clinicas e Hospital do Câncer AC. Camargo. A expressão da HYAL1- selvagem (wt) e variantes 1 a 5, HYAL2-wt, HYAL3-wt e variantes 1 a 3 foi identificada por PCR e seqüenciamento direto. Diferentes proporções de HYAL3-wt e variantes foram expressas em tecidos pulmonares tumorais e controles. HYAL1-wt esteve associada com prognóstico desfavorável e HYAL3-v1 com prognóstico favorável. Diante dos resultados obtidos dos tumores de pacientes do Hospital das Clínicas e Hospital AC. Camargo, prosseguimos a investigação para estudar a imunoexpressão das Hyal 1 e 3 e HAS 1, 2 e 3 nos CCE e ADC. Observamos que a intensidade de expressão de Hyal 3 foi maior pelas células tumorais quando comparada aos controles, porém esta diferença foi marginalmente significante. Já o resultado da análise da freqüência de imunoexpressão das Hyal 1 e 3, e HAS1, 2 e 3 demonstrou expressão na maioria dos espécimes tumorais e controles. A associação entre as variáveis foi testada e evidenciou imunoexpressão concomitante de HYAL e HAS nos tumores. O modelo matemático de sobrevida , controlado para sexo, idade e estadiamento mostrou risco de morte associado com adenocarcinoma sólido e imunoreatividade para HAS2 e HAS3. Para validar os resultados obtidos, sobretudo com a imunoexpressão das Hyal e HAS nos CCE e ADC, estudamos a população de pacientes do Hospital Universitário de Coimbra. Documentamos pela primeira vez uma via pela qual a hiperexpressão de HAS3 e Hyal 3 respectivamente por células epiteliais neoplásicas e mesenquimais, podem favorecer a invasão nos ADC e CCE. Surpreendentemente, demonstramos que a imunoexpressão de HAS1 e 3 pelas células epiteliais neoplásicas confere mais agressividade aos ADC acinares e papilares, mas uma expressão negativa de HAS1 pelas células mesenquimais confere um papel protetor a MEC auxiliando-a a evitar a invasão pelas células tumorais em ambos os tipos subtipos histológicos. A interação entre a expressão das hialuronidades e sintases do àcido hialurônico foi avaliada em relação à expressão de proteínas da transição epitélio-mesênquimal nos tumores de pacientes do Hospital Universitário de Coimbra. Hyal, HAS, E-caderina e TGF- modularam uma via invasiva tumorinduzida nos ADC e CCE de pulmão, e estiveram associados a um espectro diferente de agressividade, uma vez que houve uma relação inversa entre a expressão de biomarcadores epiteliais e mesenquimais. Enquanto a hiperexpressão de HAS1 e HAS3 provê uma agressividade aos CCE e ADC, uma hiperexpressão de TGF- e E-caderina, confere um efeito protetor à MEC ao evitar a invasão por células tumorais em ambos os tipos histológicos. Comparamos os níveis de imunoexpressão das Hyal1 e 3 e HAS 1, 2 e 3 nos tumores ressecados no Hospital das Clínicas e Hospital AC. Camargo com os níveis obtidos em tumores do Hospital Universitário de Coimbra. Verificamos que a imunoexpressão das HAS 1, 2, 3 e Hyal1 foi significativamente maior nos tumores de pacientes do Hospital Universitário de Coimbra, enquanto que a imunoexpressão de Hyal 3 foi significativamente maior nos tumores de pacientes brasileiros. Por todas essas razões, nossos resultados sugerem que estratégias direcionadas à modulação dos níveis de HYAL1-wt e HYAL3-v1, da hiper imuno expressão de HAS3 e Hyal 3 respectivamente por células epiteliais neoplásicas e mesenquimais, da alta síntese de HAS3 e Hyal 1, ou a resposta local baixa de TGF- e E-caderina, poderão ter grande impacto no câncer de pulmão / Given the poor results obtained in the treatment of Lung Cancer, in early stages or locally advanced disease, there is a need to develop molecular markers and immunohistochemical studies that can predict tumor behavior. Hyaluronic Acid (HA) is a component of extracellular matrix is responsible for hydration and maintenance of tissue osmotic equilibrium. Concentrations of HA are elevated in several types of cancers, including lung. Hyaluronidases (HAases) are a family of enzymes involved in the spread of bacterial toxins, poisons and tumor progression. The breakdown of HA into small fragments (3-25 disaccharides) promoted by the action of type HAases Hyal1, Hyal 2 and Hyal 3 is related to the promotion of cancer by inducing angiogenesis and stimulate proliferation through activation of the tyrosine kinase. Some isoforms HAases, described as the product of alternative splicing, have diverse enzymatic activity. The heterogeneity of expression of HAases was identified in some cancers and can be correlated with the different behavior of tumors. In a first instance, the expression profile of Hyal spliced forms was evaluated in tumor and normal lung tissue of 69 tumors resected from patients with adenocarcinomas(ADC) and squamous cell carcinomas (SqCC) from the Hospital das Clínicas and Hospital AC. Camargo. Gene expression of HYAL1 wild-type (wt) and variants 1 to 5 HYAL2-wt, and HYAL3-wt and variants 1 to 3 was identified by PCR and direct sequencing. Different proportions of HYAL3-wt and variants were expressed in tumor and normal lung tissue. HYAL1-wt was associated with unfavorable prognosis and HYAL3-v1 with favorable prognosis. Given the genetic abnormalities found in tumors of patients from Hospital das Clinicas and Hospital AC. Camargo, we continued our research to study the expression of Hyal 1.3 and HAS 1, 2, 3 in squamous cell carcinomas and adenocarcinomas. We observed that the intensity of expression of Hyal 3 was higher in tumor cells compared to controls, but this difference was marginally significant. Since the result of frequency analysis of immunoreactivity of Hyal 1 and 3, and HAS1, 2 e 3 showed expression in the majority of tumor samples and controls. The association between variables was tested and showed concomitant immunoexpression of the HAS and HYAL in tumors. The mathematical model of survival, adjusted for sex, age and staging showed risk of death associated with adenocarcinoma and solid and HAS3 HAS2 immunoreactivity.To validate the results, especially with the immunostaining of Hyal and HAS in squamous cell carcinomas and adenocarcinomas of the lung, the patient population studied at the University Hospital of Coimbra. Documented for the first time a route by which the overexpression of HAS3 and Hyal 3 respectively by neoplastic epithelial and mesenchymal cells may favor the invasion in ADC and SqCC, respectively. Surprisingly, we demonstrated that hyper HAS1 and 3 immunoreactivity by neoplastic epithelial cells confers more aggressiveness to the ADC acinar and papillary, but a negative expression of HAS1 by mesenchymal cells confers a protective role ECM-helping to prevent the invasion by tumor cells in both types histological subtypes.The interaction between the expression of hialuronidades and hyaluronic acid synthases was evaluated for protein expression of epithelial-mesenchymal transition in tumor patients at the University Hospital of Coimbra. Hyaluronidase, hyaluronan synthase, Ecadherin, and TGF- modulated via an invasive tumor-induced in the ADC and SqCC lung, and were associated with a different spectrum of aggressiveness, since there was an inverse relationship between the expression of epithelial biomarkers and mesenchymal cells. While overexpression of HAS1 and HAS3 provides an aggressiveness to SqCC and ADC, an overexpression of TGF- and E-cadherin confers a protective effect by preventing the ECM invasion by tumor cells in both histological types. We compared the levels of immunostaining Hyal 1, 3 and HAS1, 2 and 3 in tumors resected at the Hospital AC. Camargo, and the levels obtained in tumors of the Hospital Universitário de Coimbra. We found that the immunostaining of HAS 1, 2, 3 and Hyal1 was significantly higher in tumors from patients of Coimbra, while Hyal 3 immunoreactivity was significantly. higher in tumors of patients in Brazil. For all these reasons, our results suggest that strategies directed at modulating the levels of HYAL1-wt and HYAL3-v1, the immunohistochemical expression of HAS3 and Hyal 3 respectively by neoplastic epithelial and mesenchymal cells, the synthesis of HAS3 and Hyal1 or the local response of low TGF- and E-cadherin, may have great impact on lung cancer

Orientador: Ricardo Della Coletta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-22T21:07:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bufalino_Andreia_D.pdf: 2552060 bytes, checksum: 9156e1c08764322bea090809a2b166d5 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Ativina A é um membro da família dos fatores de crescimento transformante-? e sua expressão têm sido associados ao desenvolvimento tumoral. Contudo, sua expressão, função e mecanismos de regulação, por exemplo, via folistatina, no carcinoma espinocelular (CEC) oral é parcialmente conhecida. Diante disto, nosso estudo teve como objetivo avaliar a participação de ativina A na tumorigênese dos CECs orais. Para alcançar este objetivo, a expressão imuno-histoquímica de ativina A foi analisada em 115 amostras de CEC oral e sua expressão foi correlacionada com características clínico-patológicas e de sobrevida. In vitro a influência de ativina A sobre os principais eventos biológicos relacionados à tumorigênese oral foi verificada por 3 abordagens: 1) exposição da linhagem celular HaCAT a ativina A recombinante nas concentrações de 0, 1, 10 e 100 ng/ml, 2) tratamento das linhagens tumorais LN2 com folistatina recombinante nas concentrações de 0, 1, 10 e 100 ng/ml e 3) silenciamento estável da expressão de ativina A na linhagem LN2 com RNA de interferência (shINHBA). A expressão aumentada de ativina A em CECs orais foi significantemente correlacionada com a presença de metástases regionais (estádio N, p=0,034), tumores classificados como pobremente diferenciados (p=0,013) e demonstrou ser preditiva de um menor período de sobrevida livre de doença em 5 anos (HR: 1,74; 95% CI: 1,39-2,97; p=0,016). Os resultados dos estudos in vitro revelaram que ativina A apresenta um efeito pleotrópico no controle dos principais eventos associados à tumorigênese oral. A exposição das células HaCAT a ativina A resultou em um significante bloqueio da morte celular por apoptose e necrose, promoveu alteração do padrão de expressão dos marcadores da transição epitélio mesenquimal (TEM), aumentou a adesão celular aos componentes da matriz extracelular (MEC) e induziu a invasão e migração celular. Por outro lado, o tratamento das células LN2 com folistatina foi capaz de induzir significantemente a apoptose e a morte celular por necrose, reduzir a proliferação celular, alterar o padrão de expressão dos marcadores da TEM, além de reduzir a adesão celular aos componentes da MEC e os potenciais invasivo e migratório. O bloqueio de ativina A com a transdução estável de shINHBA na linhagem tumoral LN2 promoveu significantemente a apoptose e a morte por necrose, alterou a expressão dos marcadores da TEM de maneira similar aos efeitos da folistatina e reduziu a proliferação, invasão, migração e motilidade celular, que foi avaliada por formação de filopódios e lamelipódios. Interessantemente, o bloqueio com shINHBA significantemente facilitou a adesão das células LN2 aos componentes da MEC, diferente do que foi observado no tratamento com folistatina. Em conclusão, os resultados deste estudo sugerem que a ativina A regula eventos biológicos essenciais para a tumorigênese oral e é um fator prognóstico independente de sobrevida livre de doença em pacientes com CECs orais / Abstract: Activin A is a member of the transforming growth factor-? family and its deregulated expression has been described in different cancers. However, its expression, function and regulatory mechanisms, particularly via follistatin, in oral squamous cell carcinoma (OSCC) are partially known. The aim of the present study was to evaluate the role of activin A in the promotion of oral tumorigenesis. To achieve this goal, immunohistochemical expression of activin A was analyzed in 115 samples of OSCCs and its expression was correlated with clinicopathological features and outcome. In vitro, the influence of activin A on oral tumorigenesis was determined by 3 different approaches: 1) exposition of HaCaT cells to recombinant activin A in different concentrations (0, 1, 10 and 100 ng/ml), 2) treatment of LN2 tumor cells with recombinant follistatin in different concentrations (0, 1, 10 and 100 ng/ml) and 3) stable knockdown of activin A expression in the LN2 tumor cells by using interferencing RNA (shINHBA). Increased activin an expression in OSCCs was significantly correlated with the presence of regional metastases (stage N, p=0.034), poorly differentiated tumors (p=0.013), and shown to be predictive of a shortened disease-free survival (HR: 1.74, 95% CI: 1.39-2.97, p=0.016). In vitro studies showed a pleotropic effect of activin an on control of key events associated with oral tumorigenesis. Activin A resulted in a reduction of cell death by apoptosis and necrosis, promoted changes in the expression of epithelial-mesenchymal transition (EMT) markers, increased cell adhesion to extracellular matrix (ECM) components and induced cell invasion and migration in HaCAT cells. On the other hand, the inhibition of activin a using follistatin induced apoptosis and cell death by necrosis, reduced cell proliferation, changed the expression of EMT markers, reduced cell adhesion to ECM components and reduced the cell invasion and migration in LN2 cells. The activin a knockdown with shINHBA stable transduction in the tumor cell line LN2 significantly promoted death by apoptosis and necrosis changed the expression of EMT markers, and decreased cell proliferation, invasion, migration and motility evaluated by lamellipodia and filopodia formation. Interestingly, knockdown with shINHBA significantly promoted the adhesion of cells to ECM components in LN2 cells, different to the results observed in the treatment with follistatin. In conclusion, our results suggest that activin A regulate biological events essential for oral tumorigenesis, and is an independent prognostic factor for disease-free survival in patients with OSCCs / Doutorado / Patologia / Doutora em Estomatopatologia

Orientador: Maria Julia Marques / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T07:19:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moreira_DrielendeOliveira_M.pdf: 2075338 bytes, checksum: 00bb5917e4f176b73c58453340cb3a5e (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A Distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença caracterizada pela fraqueza muscular progressiva que leva à insuficiência respiratória e cardíaca, resultando em morte por volta dos 30 anos de idade. No camundongo mdx, modelo experimental da DMD, os músculos diafragma e cardíaco são severamente afetados apresentando fibrose semelhante à observada na patologia humana. O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos do tratamento a longo prazo com suramina, uma droga anti-fibrótica, nos músculos diafragma e cardíaco de camundongos mdx idosos. Camundongos mdx (n=20; 8 meses de idade) receberam injeções intraperitoneais de suramina (60 mg/kg), durante 3 meses. Controles mdx (n=20; 8 meses) e C57BL/10 (n=18; 8 meses) foram injetados com solução salina. Os camundongos da linhagem C57BL/10 expressam distrofina e são utilizados como controle da linhagem mdx. A suramina diminuiu os níveis de CK e atenuou a perda da força muscular. No músculo diafragma, a suramina reduziu a área de fibrose e a mionecrose. No músculo cardíaco, houve redução da fibrose, da inflamação e melhora significativa de parâmetros funcionais cardíacos (amplitude das ondas P, Q, R e S do eletrocardiograma). Sugere-se que a suramina possa ser potencialmente útil nas distrofinopatias, atenuando a miopatia nos músculos mais afetados, o coração e o diafragma, nos estágios tardios da doença / Abstract: Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a disease characterized by progressive muscle weakness leading to respiratory and cardiac failure, resulting in death around 30 years of age. In the mdx mice model of DMD, diaphragm and cardiac muscles are severely affected in the later stages of the disease, showing intense fibrosis similar to that observed in human pathology. The aim of the present study was to investigate the effects of long-term treatment with suramin, an anti-fibrotic agent, in the diaphragm and cardiac muscles of the mdx mice. Mdx mice (n=20; 8 months of age) received intraperitoneal injections of suramin (60 mg/kg) for 3 months. Mdx controls (n=20; 8 months) and C57BL/10 (n=18; 8 months old) were injected with saline. C57BL/10 mice express dystrophin and are the control strain for the mdx mice. Suramin decreased CK levels and reduced the loss of muscle strength. Suramin reduced fibrosis and myonecrosis in diaphragm. In the cardiac muscle, suramin decreased fibrosis, inflammation and improved cardiac functional parameters (P, Q, R and S waves of the electrocardiogram). It is suggested that suramin may be a potential therapy for distrophinopaties, attenuating the dystrophic phenotype of the most affected cardiac and diaphragm muscles of the mdx mice, during later stages of the disease / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural