Eine Monotherapie mit Tenofovir disoproxil fumarate (TDF) stellt eine hoch effiziente Therapie-option für multipel vorbehandelte Patienten mit chronischer Hepatitis-B-Virusinfektion (HBV) dar. Eine Resistenz gegen TDF wurde bislang nicht beschrieben, jedoch wird ein möglicher negativer Einfluss von Adefovir dipivoxil (ADV)-Resistenzvarianten auf die TDF-Ansprechrate diskutiert. Diese retrospektive Kohortenstudie untersucht die Dynamik von Nukleos(t)id-Analoga (NA)-Resistenzvarianten im HBV-Polymerasegen mit Fokus auf ADV-Resistenzvarianten bei 18 chronisch HBV-infizierten Patienten mit Therapieversagen auf eine vorangegangene Lamivudin (LAM)- und ADV-Therapie, sowie nur partiellem Therapieansprechen auf eine TDF-Monotherapie. Zur Detektion von NA-Resistenzvarianten wird eine HBV-Genomsequenzierung mit Tiefenpyrosequenzierung (Genome Sequencer FLX, Roche Diagnostics, Germany) (UDPS), direkte Sequenzierung (TRUGENETM HBV Genotyping Kit, OpenGeneTM DNA Sequencing Sys-tem, Siemens Healthcare Diagnostic, USA) (TG) und Line Probe Assay (INNO-LiPa DRv2 und v3, Innogenetics, Belgium) (INNO-LiPA) durchgeführt. Unter TDF kommt es zu einer quantitati-ven Shift zugunsten der ADV-Resistenzvarianten mit konstant bleibendem Anteil und deutlich höher persistierender Virämie zu Monat 12 im Vergleich zu Patienten ohne ADV-Resistenzvarianten. Vor allem werden die Varianten rtA181V und rtN236T selektiert, jedoch nicht die Variante rtA181T. Die absolute Anzahl der LAM-Resistenzvarianten hingegen halbiert sich. Varianten mit einem initial per UDPS detektierten Anteil von >20% der patientenspezifi-schen HBV-Population werden meist selektiert und nehmen im Verlauf den Hauptanteil der Quasispezies ein. UDPS stellte ein potentes Medium der Detektion, Identifikation und Quantifi-zierung von HBV-Varianten dar und ist INNO-LiPa und TG überlegen. Es ergibt sich kein Hin-weis auf TDF-Resistenzvarianten, jedoch zeigt das Vorliegen von ADV-Resistenzvarianten ei-nen tendentiell negativen Einfluss auf die virale Kinetik. Weitere größere Langzeitstudien sind zur Bestätigung dieser Beobachtung notwendig. / Tenofovir disoproxil fumarate (TDF) is a highly efficient treatment option for nucleos(t)ide analogue (NA) pre-treated patients with chronic hepatitis B virus (HBV) infection. Little is known about the reasons for persistent virus replication in some rare cases. As of today, no TDF resistance variants have been identified, but a possible linkage to Adefovir dipivoxil (ADV) resistance associated variants negatively influencing HBV-DNA suppression by TDF has been suspected, based on the similarity of the chemical structure. In this retrospective cohort study the dynamics of NA resistance variants in the HBV polymerase gene with focus on ADV resistance variants were assessed. For this, we have chosen a cohort including patients with multiple failures to treatment with different NAs. Thus, data of 18 patients with previous treatment failure to LAM and ADV was analysed, showing a persistent viremia (HBV-DNA >35 copies/mL) despite switch to TDF monotherapy (median HBV-DNA at month 12 3,5±0,8 (2,1-4,9) log10 copies/mL). Sequencing analysis was performed with ultra-deep pyrosequencing (UDPS) (Genome Sequencer FLX, 454 Life Science, Roche Diagnostic, Branford, CT), direct sequencing (TG) (TRUGENETM HBV Genotyping Kit, OpenGeneTM DNA Sequencing System, Siemens Healthcare Diagnostic, USA) and line probe assay (INNO-LiPA) (INNO-LiPa DRv2/v3, Innogenetics, Belgium). Using TDF monotherapy, a quantitative shift in favour to ADV resistance variants was observed in this cohort. The percentage of substitutions conferring resistance to ADV at baseline (BL) and at the time of the last sequencing endpoint (EP) of the HBV genome remained constant (BL 35%, 13/37, EP 36%, 9/25). The variants rtA181V and rtN236T were mostly selected, whereas rtA181T was not selected. The total amount of substitutions conferring resistance to Lamivudin (LAM) showed a strong decline, however remained the majority part of all NA resistance variants (BL 51% (19/37), EP 40% (10/25)). The percentage of ETV resistance variants increased slightly (BL 14% (5/37), EP 24% (6/25)). Known ADV, Lam and ETV resistance variants emerged in variable abundance (1,0-99,6%) of quasispecies during TDF therapy. A homogenization of HBV quasispecies took place. Especially mutations occurring in higher abundance (>20% of viral population) were mostly selected (BL 51% (19/37), EP 80% (20/25)). No new HBV variants with possible association to resistance against TDF were identified, but patients with ADV resistance variants showed the highest HBV-DNA level at month 12 of TDF therapy (median HBV-DNA 3,57±0,72 (2,14-3,96) log10 copies/mL, not significant). A negative influence of ADV resistance variants on viral suppression with TDF monotherapy may be assumed, however more long-term studies are needed to confirm the role of ADV resistance variants in TDF therapy. UDPS is a potent medium for detection, identification and quantification of dominant to low level variants in HBV-DNA. It is superior to direct sequencing and line probe assay in the detection of variants.

Eine Monotherapie mit Tenofovir disoproxil fumarate (TDF) stellt eine hoch effiziente Therapie-option für multipel vorbehandelte Patienten mit chronischer Hepatitis-B-Virusinfektion (HBV) dar. Eine Resistenz gegen TDF wurde bislang nicht beschrieben, jedoch wird ein möglicher negativer Einfluss von Adefovir dipivoxil (ADV)-Resistenzvarianten auf die TDF-Ansprechrate diskutiert. Diese retrospektive Kohortenstudie untersucht die Dynamik von Nukleos(t)id-Analoga (NA)-Resistenzvarianten im HBV-Polymerasegen mit Fokus auf ADV-Resistenzvarianten bei 18 chronisch HBV-infizierten Patienten mit Therapieversagen auf eine vorangegangene Lamivudin (LAM)- und ADV-Therapie, sowie nur partiellem Therapieansprechen auf eine TDF-Monotherapie. Zur Detektion von NA-Resistenzvarianten wird eine HBV-Genomsequenzierung mit Tiefenpyrosequenzierung (Genome Sequencer FLX, Roche Diagnostics, Germany) (UDPS), direkte Sequenzierung (TRUGENETM HBV Genotyping Kit, OpenGeneTM DNA Sequencing Sys-tem, Siemens Healthcare Diagnostic, USA) (TG) und Line Probe Assay (INNO-LiPa DRv2 und v3, Innogenetics, Belgium) (INNO-LiPA) durchgeführt. Unter TDF kommt es zu einer quantitati-ven Shift zugunsten der ADV-Resistenzvarianten mit konstant bleibendem Anteil und deutlich höher persistierender Virämie zu Monat 12 im Vergleich zu Patienten ohne ADV-Resistenzvarianten. Vor allem werden die Varianten rtA181V und rtN236T selektiert, jedoch nicht die Variante rtA181T. Die absolute Anzahl der LAM-Resistenzvarianten hingegen halbiert sich. Varianten mit einem initial per UDPS detektierten Anteil von >20% der patientenspezifi-schen HBV-Population werden meist selektiert und nehmen im Verlauf den Hauptanteil der Quasispezies ein. UDPS stellte ein potentes Medium der Detektion, Identifikation und Quantifi-zierung von HBV-Varianten dar und ist INNO-LiPa und TG überlegen. Es ergibt sich kein Hin-weis auf TDF-Resistenzvarianten, jedoch zeigt das Vorliegen von ADV-Resistenzvarianten ei-nen tendentiell negativen Einfluss auf die virale Kinetik. Weitere größere Langzeitstudien sind zur Bestätigung dieser Beobachtung notwendig.:INHALTSVERZEICHNIS 2 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 5 TABELLENVERZEICHNIS 6 1 BIBLIOGRAPHISCHE ZUSAMMENFASSUNG 8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 9 2 EINFÜHRUNG 10 2.1 Epidemiologie der chronischen Hepatitis-B-Virusinfektion 10 2.2 Aufbau, Replikation und Resistenzentwicklung des Hepatitis-B-Virusgenoms 10 2.3 Antivirale Therapie 13 2.4 Sequenziermethoden 14 3 AUFGABENSTELLUNG 15 4 MATERIAL UND METHODE 16 4.1 Studiendesign und Beschreibung der Kohorte 16 4.2 Evaluation der TDF-Monotherapie und Resistenzanalyse 17 4.3 Statistische Auswertung 18 4.4 Verbrauchsmaterialien und Reagenzien 18 4.5 Puffer 22 4.6 Geräte 22 4.7 Durchführung der Laborarbeiten 24 4.8 HBV-DNA Quantifizierung und Bestimmung biochemischer Parameter 24 4.9 Extraktion von Nukleinsäuren aus Serumproben 24 4.10 Tiefenpyrosequenzierung mittels Genome Sequencer FLX System (454 Life Science, Roche Diagnostic, Branford, CT) 25 4.10.1 GS FLX HBV-DNA-Library 25 4.10.2 GS FLX Emulsions-PCR 31 4.10.3 GS FLX Sequenzierung 37 4.10.4 GS FLX Datenauswertung 41 4.11 Direkte Sequenzierung mittels TRUGENETM HBV Genotyping Kit (OpenGeneTM DNA Sequencing System, Siemens Healthcare Diagnostic, USA) 42 4.11.1 PCR-Amplifikation 42 4.11.2 CLIP-Amplifikations-Reaktion 42 4.11.3 Genotyp-und Variantenanalyse 44 4.12 Sequenzierung mittels Line Probe Assay INNO-LiPa HBV DRv2 und v3 (Innogenetics, Belgium) 44 4.12.1 HBV-DNA Amplifikation 45 4.12.2 Denaturierung und Hybridisierung 46 4.12.3 Farbentwicklung 46 5 ERGEBNISSE 47 5.1 Patientencharakteristika zur Baseline 47 5.2 Virologisches Ansprechen 48 5.3 Biochemisches Ansprechen 49 5.4 Serologisches Ansprechen 50 5.5 Therapie-Adhärenz und medikamentöse Verträglichkeit 50 5.6 Ergebnisse der Tiefenpyrosequenzierung mit Genome Sequencer FLX System (454 Life Science, Roche Diagnostic, Branford, CT) 50 5.6.1 Verschiedene Einzelverläufe der NA-Resistenzvarianten 55 5.6.2 Kombiniert oder isoliert auftretenden NA-Resistenzvarianten 57 5.6.3 Entwicklung der ADV-Resistenzvarianten 61 5.6.4 Entwicklung der LAM-Resistenzvarianten 66 5.6.5 Entwicklung der ETV-Resistenzvarianten 68 5.6.6 Shift der NA-Resistenzvarianten und Auswirkung auf die Dynamik der HBV-DNA 70 5.6.7 Entwicklung der potentiellen NA-Resistenzvarianten 72 5.6.8 Entwicklung der HBsAg-Varianten 75 5.6.9 Entwicklung der HBV-Quasispezies 77 5.7 Ergebnisse der direkten Sequenzierung mit TRUGENETM HBV Genotyping Kit (OpenGeneTM DNA Sequencing System, Siemens Healthcare Diagnostic, USA) 80 5.8 Ergebnisse des Line Probe Assays mit INNO-LiPa HBV DRv2 und v3 (Innogenetics, Belgium) 81 5.9 Vergleich der Sequenziermethoden 81 6 DISKUSSION 83 6.1 Patientenkohorte und Ansprechen auf die TDF-Monotherapie 83 6.2 Entwicklung und Einfluss der ADV-Resistenzvarianten unter TDF-Monotherapie 84 6.3 Entwicklung und Einfluss der LAM-Resistenzvarianten unter TDF-Monotherapie 90 6.4 Entwicklung und Einfluss der ETV-Resistenzvarianten unter TDF-Monotherapie 92 6.5 Entwicklung und Einfluss der HBV-Wildtyp-Varianten unter TDF-Monotherapie 93 6.6 Entwicklung und Einfluss der potentiellen NA-Resistenzvarianten 94 6.7 Entwicklung und Einfluss der HBsAg-Varianten 96 6.8 Einfluss von multiplen Vortherapien unter TDF-Monotherapie 98 6.9 Entwicklung und Einfluss der HBV-DNA-Serumkonzentration 98 6.10 Entwicklung und Einfluss von HBV-Quasispezies unter TDF-Monotherapie 100 6.11 Vergleich der Sequenziermethoden 101 7 ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT 106 8 LITERATURVERZEICHNIS 109 9 EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG 114 10 CURRICULUM VITAE 115 11 ANTEILSERKLÄRUNG AN ERFOLGTEN PUBLIKATIONEN 116 12 DANKSAGUNG 117 / Tenofovir disoproxil fumarate (TDF) is a highly efficient treatment option for nucleos(t)ide analogue (NA) pre-treated patients with chronic hepatitis B virus (HBV) infection. Little is known about the reasons for persistent virus replication in some rare cases. As of today, no TDF resistance variants have been identified, but a possible linkage to Adefovir dipivoxil (ADV) resistance associated variants negatively influencing HBV-DNA suppression by TDF has been suspected, based on the similarity of the chemical structure. In this retrospective cohort study the dynamics of NA resistance variants in the HBV polymerase gene with focus on ADV resistance variants were assessed. For this, we have chosen a cohort including patients with multiple failures to treatment with different NAs. Thus, data of 18 patients with previous treatment failure to LAM and ADV was analysed, showing a persistent viremia (HBV-DNA >35 copies/mL) despite switch to TDF monotherapy (median HBV-DNA at month 12 3,5±0,8 (2,1-4,9) log10 copies/mL). Sequencing analysis was performed with ultra-deep pyrosequencing (UDPS) (Genome Sequencer FLX, 454 Life Science, Roche Diagnostic, Branford, CT), direct sequencing (TG) (TRUGENETM HBV Genotyping Kit, OpenGeneTM DNA Sequencing System, Siemens Healthcare Diagnostic, USA) and line probe assay (INNO-LiPA) (INNO-LiPa DRv2/v3, Innogenetics, Belgium). Using TDF monotherapy, a quantitative shift in favour to ADV resistance variants was observed in this cohort. The percentage of substitutions conferring resistance to ADV at baseline (BL) and at the time of the last sequencing endpoint (EP) of the HBV genome remained constant (BL 35%, 13/37, EP 36%, 9/25). The variants rtA181V and rtN236T were mostly selected, whereas rtA181T was not selected. The total amount of substitutions conferring resistance to Lamivudin (LAM) showed a strong decline, however remained the majority part of all NA resistance variants (BL 51% (19/37), EP 40% (10/25)). The percentage of ETV resistance variants increased slightly (BL 14% (5/37), EP 24% (6/25)). Known ADV, Lam and ETV resistance variants emerged in variable abundance (1,0-99,6%) of quasispecies during TDF therapy. A homogenization of HBV quasispecies took place. Especially mutations occurring in higher abundance (>20% of viral population) were mostly selected (BL 51% (19/37), EP 80% (20/25)). No new HBV variants with possible association to resistance against TDF were identified, but patients with ADV resistance variants showed the highest HBV-DNA level at month 12 of TDF therapy (median HBV-DNA 3,57±0,72 (2,14-3,96) log10 copies/mL, not significant). A negative influence of ADV resistance variants on viral suppression with TDF monotherapy may be assumed, however more long-term studies are needed to confirm the role of ADV resistance variants in TDF therapy. UDPS is a potent medium for detection, identification and quantification of dominant to low level variants in HBV-DNA. It is superior to direct sequencing and line probe assay in the detection of variants.:INHALTSVERZEICHNIS 2 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 5 TABELLENVERZEICHNIS 6 1 BIBLIOGRAPHISCHE ZUSAMMENFASSUNG 8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 9 2 EINFÜHRUNG 10 2.1 Epidemiologie der chronischen Hepatitis-B-Virusinfektion 10 2.2 Aufbau, Replikation und Resistenzentwicklung des Hepatitis-B-Virusgenoms 10 2.3 Antivirale Therapie 13 2.4 Sequenziermethoden 14 3 AUFGABENSTELLUNG 15 4 MATERIAL UND METHODE 16 4.1 Studiendesign und Beschreibung der Kohorte 16 4.2 Evaluation der TDF-Monotherapie und Resistenzanalyse 17 4.3 Statistische Auswertung 18 4.4 Verbrauchsmaterialien und Reagenzien 18 4.5 Puffer 22 4.6 Geräte 22 4.7 Durchführung der Laborarbeiten 24 4.8 HBV-DNA Quantifizierung und Bestimmung biochemischer Parameter 24 4.9 Extraktion von Nukleinsäuren aus Serumproben 24 4.10 Tiefenpyrosequenzierung mittels Genome Sequencer FLX System (454 Life Science, Roche Diagnostic, Branford, CT) 25 4.10.1 GS FLX HBV-DNA-Library 25 4.10.2 GS FLX Emulsions-PCR 31 4.10.3 GS FLX Sequenzierung 37 4.10.4 GS FLX Datenauswertung 41 4.11 Direkte Sequenzierung mittels TRUGENETM HBV Genotyping Kit (OpenGeneTM DNA Sequencing System, Siemens Healthcare Diagnostic, USA) 42 4.11.1 PCR-Amplifikation 42 4.11.2 CLIP-Amplifikations-Reaktion 42 4.11.3 Genotyp-und Variantenanalyse 44 4.12 Sequenzierung mittels Line Probe Assay INNO-LiPa HBV DRv2 und v3 (Innogenetics, Belgium) 44 4.12.1 HBV-DNA Amplifikation 45 4.12.2 Denaturierung und Hybridisierung 46 4.12.3 Farbentwicklung 46 5 ERGEBNISSE 47 5.1 Patientencharakteristika zur Baseline 47 5.2 Virologisches Ansprechen 48 5.3 Biochemisches Ansprechen 49 5.4 Serologisches Ansprechen 50 5.5 Therapie-Adhärenz und medikamentöse Verträglichkeit 50 5.6 Ergebnisse der Tiefenpyrosequenzierung mit Genome Sequencer FLX System (454 Life Science, Roche Diagnostic, Branford, CT) 50 5.6.1 Verschiedene Einzelverläufe der NA-Resistenzvarianten 55 5.6.2 Kombiniert oder isoliert auftretenden NA-Resistenzvarianten 57 5.6.3 Entwicklung der ADV-Resistenzvarianten 61 5.6.4 Entwicklung der LAM-Resistenzvarianten 66 5.6.5 Entwicklung der ETV-Resistenzvarianten 68 5.6.6 Shift der NA-Resistenzvarianten und Auswirkung auf die Dynamik der HBV-DNA 70 5.6.7 Entwicklung der potentiellen NA-Resistenzvarianten 72 5.6.8 Entwicklung der HBsAg-Varianten 75 5.6.9 Entwicklung der HBV-Quasispezies 77 5.7 Ergebnisse der direkten Sequenzierung mit TRUGENETM HBV Genotyping Kit (OpenGeneTM DNA Sequencing System, Siemens Healthcare Diagnostic, USA) 80 5.8 Ergebnisse des Line Probe Assays mit INNO-LiPa HBV DRv2 und v3 (Innogenetics, Belgium) 81 5.9 Vergleich der Sequenziermethoden 81 6 DISKUSSION 83 6.1 Patientenkohorte und Ansprechen auf die TDF-Monotherapie 83 6.2 Entwicklung und Einfluss der ADV-Resistenzvarianten unter TDF-Monotherapie 84 6.3 Entwicklung und Einfluss der LAM-Resistenzvarianten unter TDF-Monotherapie 90 6.4 Entwicklung und Einfluss der ETV-Resistenzvarianten unter TDF-Monotherapie 92 6.5 Entwicklung und Einfluss der HBV-Wildtyp-Varianten unter TDF-Monotherapie 93 6.6 Entwicklung und Einfluss der potentiellen NA-Resistenzvarianten 94 6.7 Entwicklung und Einfluss der HBsAg-Varianten 96 6.8 Einfluss von multiplen Vortherapien unter TDF-Monotherapie 98 6.9 Entwicklung und Einfluss der HBV-DNA-Serumkonzentration 98 6.10 Entwicklung und Einfluss von HBV-Quasispezies unter TDF-Monotherapie 100 6.11 Vergleich der Sequenziermethoden 101 7 ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT 106 8 LITERATURVERZEICHNIS 109 9 EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG 114 10 CURRICULUM VITAE 115 11 ANTEILSERKLÄRUNG AN ERFOLGTEN PUBLIKATIONEN 116 12 DANKSAGUNG 117