BORGES, K. B. Análise estereosseletiva da tioridazina e seus principais metabólitos: um estudo cinético de biotransformação empregando fungos. 2006. 124f. Dissertação (Mestrado) Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006. Atualmente, existe um grande interesse em estudar a biotransformação estereosseletiva de fármacos, incluindo os processos que reproduzem as vias de metabolização in vivo. Alguns desses estudos estão sendo realizados empregando microrganismos como, por exemplo, fungos. A cromatografia líquida de alta eficiência é umas das técnicas que pode ser empregada para a resolução, identificação e quantificação das espécies quirais formadas. A tioridazina (THD) é um fármaco quiral, com atividade antipsicótica utilizado para o tratamento da esquizofrenia. Possui como principais metabólitos a tioridazina-2-sulfóxido (THD-2-SO) e tioridazina-2-sulfona (THD-2-SO2), ambos com atividade antipsicótica, e a tioridazina-5-sulfóxido (THD-5-SO), que contribui para o efeito cardiotóxico do fármaco. Portanto, o presente trabalho tem por finalidade o desenvolvimento de um método de análise estereosseletiva da THD-2-SO e THD-5-SO em meio de cultura para avaliação do potencial de biotransformação da THD por alguns fungos. A melhor resolução dos estereoisômeros da THD-2-SO e THD-5-SO foi obtida utilizando a coluna CHIRALPAK® AS e fase móvel hexano : etanol : metanol (92:6:2, v/v/v) + 0,5% de dietilamina. A extração líquido líquido foi utilizada na preparação das amostras, tendo como solvente extrator o éter etílico. O método desenvolvido apresentou recuperação em torno de 100% para todos os compostos avaliados. Os coeficientes de variação e erros obtidos nos estudos de precisão e exatidão, intra e interensaios, foram inferiores a 10%. O método desenvolvido e validado foi empregado para avaliar o potencial de biotransformação da THD por 12 fungos endofíticos isolados de Tithonia diversifolia, Viguiera arenaria e Viguiera robusta e 1 fungo de solo (Penicillium waksmanii). Dentre os 13 fungos avaliados, quatro merecem destaque por apresentarem um potencial de biotransformação estereosseletivo mais evidenciado: Phomopsis sp. (TD2) apresentou maior mono-5-sulfoxidação para as formas (S)-(SE) e (R)-(FE) (9,3% e 5,8%, respectivamente);Glomerella cingulata (VA1) apresentou maior mono-5-sulfoxidação para as formas (S)-(SE) + (R)-(FE) (39,7%); Diaporthe phaseolorum (VR4) apresentou maior mono-2-sulfoxidação para as formas (S)-(SE) e (R)-(FE) (84,4% e 82,5%, respectivamente) e Aspergillus fumigatus (VR12) apresentou maior mono-2-sulfoxidação das formas (S)-(FE) (20,7%) e (R)-(SE) (34,4%). / BORGES, K. B. Stereoselective analysis of thioridazine and its major metabolites: a kinetic study of biotransformation by fungi. 2006. 124p. Dissertation (Masters degree) Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006. The interest in stereoselective biotransformation of drugs including the processes that reproduce the in vivo metabolism has been increased. To study drug metabolism several models have been used. Among them, studies carried out using microorganisms, mainly fungi have been standing out. High-Performance Liquid Chromatography can be used for the resolution, identification and quantification of the chiral species formed. The thioridazine (THD) is a chiral drug used as antipsychotic for the treatment of schizophrenia. The main metabolites of THD are thioridazine-2-sulfoxide (THD-2-SO), thioridazine-2-sulfone (THD-2-SO2) and thioridazine-5-sulfoxide (THD-5-SO). The THD-2-SO and THD-2-SO2 possesss antipsychotic activity and THD-5-SO contributes to the cardiotoxicity of drug more than the parent compound. Therefore, the aim of the present work was to develop a method for the stereoselective analysis of THD-2-SO and THD-5-SO in culture medium to study biotransformation of THD by some fungi. The simultaneous determination of thioridazine-2-sulfoxide and thioridazine-5-sulfoxide was performed on a CHIRALPAK® AS column using a mobile phase constituted of hexane: ethanol: methanol (92:6:2, v/v/v) + 0.5% diethylamine. Diethyl ether was used as extraction solvent. Recoveries around 100% were obtained for all the evaluated species. The coefficients of variation and relative errors in precision and accuracy studies (within-day and between-day) were below 10%. The validated method was used to evaluate the biotransformation of THD by 12 endophytic fungi isolated from Tithonia diversifolia, Viguiera arenaria and Viguiera robusta and 1 fungus isolated from soil (Penicillium waksmanii). Among the 13 fungi evaluated, four of them deserve prominence for presenting an evidenced stereoselective biotransformation potential: Phomopsis sp. (TD2) presented greater mono-5-sulfoxidation to the forms (S)-(SE) e (R)-(FE) (9.3% and 5.8%, respectively); Glomerella cingulata (VA1) presented greater mono-5-sulfoxidation to the forms (S)-(SE) + (R)-(FE) (39.7%); Diaporthe phaseolorum (VR4) presented greater mono-2-sulfoxidation to the forms (S)-(SE) and (R)-(FE) (84.4% and 82.5%, respectively) and Aspergillus fumigatus (VR12) presented greater mono-2-sulfoxidation to the forms (S)-(FE) (20.7%) and (R)-(SE) (34.4%).

BORGES, K. B. Análise estereosseletiva da tioridazina e seus principais metabólitos: um estudo cinético de biotransformação empregando fungos. 2006. 124f. Dissertação (Mestrado) Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006. Atualmente, existe um grande interesse em estudar a biotransformação estereosseletiva de fármacos, incluindo os processos que reproduzem as vias de metabolização in vivo. Alguns desses estudos estão sendo realizados empregando microrganismos como, por exemplo, fungos. A cromatografia líquida de alta eficiência é umas das técnicas que pode ser empregada para a resolução, identificação e quantificação das espécies quirais formadas. A tioridazina (THD) é um fármaco quiral, com atividade antipsicótica utilizado para o tratamento da esquizofrenia. Possui como principais metabólitos a tioridazina-2-sulfóxido (THD-2-SO) e tioridazina-2-sulfona (THD-2-SO2), ambos com atividade antipsicótica, e a tioridazina-5-sulfóxido (THD-5-SO), que contribui para o efeito cardiotóxico do fármaco. Portanto, o presente trabalho tem por finalidade o desenvolvimento de um método de análise estereosseletiva da THD-2-SO e THD-5-SO em meio de cultura para avaliação do potencial de biotransformação da THD por alguns fungos. A melhor resolução dos estereoisômeros da THD-2-SO e THD-5-SO foi obtida utilizando a coluna CHIRALPAK® AS e fase móvel hexano : etanol : metanol (92:6:2, v/v/v) + 0,5% de dietilamina. A extração líquido líquido foi utilizada na preparação das amostras, tendo como solvente extrator o éter etílico. O método desenvolvido apresentou recuperação em torno de 100% para todos os compostos avaliados. Os coeficientes de variação e erros obtidos nos estudos de precisão e exatidão, intra e interensaios, foram inferiores a 10%. O método desenvolvido e validado foi empregado para avaliar o potencial de biotransformação da THD por 12 fungos endofíticos isolados de Tithonia diversifolia, Viguiera arenaria e Viguiera robusta e 1 fungo de solo (Penicillium waksmanii). Dentre os 13 fungos avaliados, quatro merecem destaque por apresentarem um potencial de biotransformação estereosseletivo mais evidenciado: Phomopsis sp. (TD2) apresentou maior mono-5-sulfoxidação para as formas (S)-(SE) e (R)-(FE) (9,3% e 5,8%, respectivamente);Glomerella cingulata (VA1) apresentou maior mono-5-sulfoxidação para as formas (S)-(SE) + (R)-(FE) (39,7%); Diaporthe phaseolorum (VR4) apresentou maior mono-2-sulfoxidação para as formas (S)-(SE) e (R)-(FE) (84,4% e 82,5%, respectivamente) e Aspergillus fumigatus (VR12) apresentou maior mono-2-sulfoxidação das formas (S)-(FE) (20,7%) e (R)-(SE) (34,4%). / BORGES, K. B. Stereoselective analysis of thioridazine and its major metabolites: a kinetic study of biotransformation by fungi. 2006. 124p. Dissertation (Masters degree) Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006. The interest in stereoselective biotransformation of drugs including the processes that reproduce the in vivo metabolism has been increased. To study drug metabolism several models have been used. Among them, studies carried out using microorganisms, mainly fungi have been standing out. High-Performance Liquid Chromatography can be used for the resolution, identification and quantification of the chiral species formed. The thioridazine (THD) is a chiral drug used as antipsychotic for the treatment of schizophrenia. The main metabolites of THD are thioridazine-2-sulfoxide (THD-2-SO), thioridazine-2-sulfone (THD-2-SO2) and thioridazine-5-sulfoxide (THD-5-SO). The THD-2-SO and THD-2-SO2 possesss antipsychotic activity and THD-5-SO contributes to the cardiotoxicity of drug more than the parent compound. Therefore, the aim of the present work was to develop a method for the stereoselective analysis of THD-2-SO and THD-5-SO in culture medium to study biotransformation of THD by some fungi. The simultaneous determination of thioridazine-2-sulfoxide and thioridazine-5-sulfoxide was performed on a CHIRALPAK® AS column using a mobile phase constituted of hexane: ethanol: methanol (92:6:2, v/v/v) + 0.5% diethylamine. Diethyl ether was used as extraction solvent. Recoveries around 100% were obtained for all the evaluated species. The coefficients of variation and relative errors in precision and accuracy studies (within-day and between-day) were below 10%. The validated method was used to evaluate the biotransformation of THD by 12 endophytic fungi isolated from Tithonia diversifolia, Viguiera arenaria and Viguiera robusta and 1 fungus isolated from soil (Penicillium waksmanii). Among the 13 fungi evaluated, four of them deserve prominence for presenting an evidenced stereoselective biotransformation potential: Phomopsis sp. (TD2) presented greater mono-5-sulfoxidation to the forms (S)-(SE) e (R)-(FE) (9.3% and 5.8%, respectively); Glomerella cingulata (VA1) presented greater mono-5-sulfoxidation to the forms (S)-(SE) + (R)-(FE) (39.7%); Diaporthe phaseolorum (VR4) presented greater mono-2-sulfoxidation to the forms (S)-(SE) and (R)-(FE) (84.4% and 82.5%, respectively) and Aspergillus fumigatus (VR12) presented greater mono-2-sulfoxidation to the forms (S)-(FE) (20.7%) and (R)-(SE) (34.4%).

Orientador: Prof. Dr. Tiago Rodrigues / Among the main problem faced during the treatment of cancer patients is resistance to chemotherapy. Among the multiple drug resistance mechanisms (MDR), the best characterized involves the activity of P-glycoprotein (Pgp), the product of the MDR1 gene expression. The reversal of MDR due to Pgp inhibition has been observed by several drugs, including phenothiazines, which has currently been the focus of studies suggesting their use in antitumor therapy. Studies with copolymers of ethylene oxide and propylene oxide, termed poloxamers, demonstrated the ability to inhibit Pgp on MDR cells suggesting their use in antitumor formulations. Thus, this work aims to study cell death induced by phenothiazines inserted in nanostructured systems (liposomes, gold nanoparticles and polymeric micelles) in human myeloblastic leukemia cells K562 and Lucena 1, only the last one overexpressing the MDR1 gene. The results showed that the polymeric micellar systems consisting of poloxamers are more suitable for potentiation of the effect of phenothiazines. The characterization of micellar systems assays indicated that the structures are organized in a lamellar shape and the particle size is about 60 nm at 25°C and 25 nm at 37°C. The in vitro release assays showed that formulations were able to decrease the releasing by 80% when compared to phenothiazines in the free form. Formulations containing PL407/L81 (poloxamer 407 and Pluronic®L81) showed higher capacity to enhance the cytotoxic effect of phenothiazines. The formulation containing trifluoperazine (TFP) inserted in PL407/L81 system caused a significant decrease in the EC50 when compared to the free form only after 48 hours of incubation in K562 lines and Lucena 1. The formulation containing thioridazine (TR) significantly alter the EC50 for 24 hours in the cell line K562 and the both strains after 48 hours of incubation. For formulation containing chlorpromazine (CPZ) was significantly decreased upon incubation for 24 to 48 hours in both cell lines. The death induction profile was similar for all phenothiazines suggesting predominantly apoptosis and late apoptosis. The PL407 / L81 system was able to inhibit the activity of Pgp in resistant strain Lucena 1, this effect was also observed for TR and TFP which had the effect potentiated after insertion in the system containing PL407/L81. However, CPZ has not been capable of inhibiting Pgp in the absence of system PL407/L81 indicating that this system is essential for the enhancement of the cytotoxic effect of CPZ in the line Lucena 1. The tests on non-tumor cell line showed that the mononuclear PL407 / L81 system does not have cytotoxicity, and also is able to decrease the cytotoxic effects of phenothiazines. These data indicate that system containing PL407 and L81 has the greatest potential for application in anti-tumor therapy with the additional benefit of reduced cytotoxic effect on normal cells. / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2015. / Um dos principais problemas enfrentados no tratamento de pacientes com câncer é a resistência a quimioterápicos. Entre os mecanismos de resistência a múltiplas drogas (MDR), o melhor caracterizado envolve a atividade da glicoproteína P (Pgp), produto da expressão do gene MDR1. A reversão da MDR por inibição da Pgp foi observada por diversos fármacos, entre eles as fenotiazinas que atualmente tem sido alvo de estudos que sugerem sua utilização na terapia antitumoral. Estudos com co-polímeros constituídos por óxido de etileno e óxido de propileno, denominados poloxamers, demonstraram a capacidade de inibição da Pgp em células MDR sugerindo sua aplicação em formulações contendo antitumorais. Dessa forma, este trabalho tem como objetivo estudar a morte celular induzida por fenotiazinas inseridas em sistemas nanoestruturados (lipossomas, nanopartículas de ouro e micelas poliméricas) em células leucêmicas mieloblásticas humanas K562 e Lucena 1, sendo que apenas a última apresenta superexpressão do gene MDR1. Os resultados indicaram os sistemas micelares poliméricos constituídos de poloxamers são mais adequados para potencialização do efeito das fenotiazinas. Os ensaios de caracterização dos sistemas micelares indicaram que as estruturas se organizam de forma lamelar e possuem tamanho de partícula de aproximadamente 60 nm, a 25°C, e de 25 nm, a 37°C. Nos ensaios de liberação in vitro, as formulações diminuíram 80% da liberação quando comparadas a liberação das fenotiazinas na forma livre. As formulações contendo PL407/L81 (poloxamer 407 e Pluronic®L81) apresentaram maior capacidade de potencialização do efeito citotóxico das fenotiazinas. A formulação contendo trifluoperazina (TFP) inserida no sistema PL407/L81 promoveu diminuição significativa do EC50 em relação à forma livre apenas após 48 horas de incubação nas linhas K562 e Lucena 1. A formulação contendo tioridazina (TR) alterou significativamente o EC50 em 24 horas na linhagem K562 e em ambas a linhagens após 48 horas de incubação. Para a formulação contendo clorpromazina (CPZ) a diminuição foi significativa na incubação por 24 e 48 horas, em ambas as linhagens. O perfil de indução de morte foi semelhante para todas as fenotiazinas sugerindo, predominantemente, apoptose tardia e apoptose. O sistema PL407/L81 foi capaz de inibir a atividade da Pgp na linhagem resistente Lucena 1, este efeito também foi observado para TR e TFP que tiveram o efeito potencializado após a inserção no sistema contendo PL407/L81. Contudo, CPZ não foi capaz de inibir a Pgp na ausência do sistema PL407/L81 indicando que este sistema é essencial para a potencialização do efeito citotóxico da CPZ na linhagem Lucena 1. A avaliação na linhagem mononuclear normal mostrou que o sistema PL407/L81 não apresenta citotoxidade e, ainda, é capaz de diminuir o efeito citotóxico das fenotiazinas. Estes dados indicam que sistema contendo PL407 14,5% e L81 0,5%, possui maior potencial para aplicação na terapia antitumoral com o benefício adicional de diminuição do efeito citotóxico em células normais.

Orientador: Prof. Dr. Tiago Rodrigues / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2016. / O câncer é uma das principais causas de morte da população mundial, sendo considerado um problema de saúde pública. As células tumorais adquirem diversas características que as permitem se proliferar desordenadamente e invadir outros tecidos, como a resistência à morte celular. As fenotiazinas são fármacos utilizados há muito tempo para o tratamento de desordens psiquiátricas. Dados da literatura demonstram que estes compostos apresentam diversos efeitos biológicos relevantes, como a atividade antitumoral. Estudos do nosso grupo têm evidenciado efeitos extremamente importantes das fenotiazinas e análogos sobre mitocôndrias, como aumento das concentrações de cálcio no citosol. Em nosso estudo prévio com mitocôndrias isoladas, foi demonstrado que estes compostos promovem a permabilização da membrana mitocondrial pela abertura do poro de transição de permeabilidade com consequente dissipação do potencial de membrana mitocondrial, efluxo de cálcio e liberação de citocromo c. Posteriormente, em um estudo recente, demonstramos a citotoxicidade destes compostos em células de hepatoma, acompanhada de alterações na morfologia celular, permeabilização da membrana plasmática e imediata dissipação do potencial de membrana mitocondrial. Dentre as fenotiazinas estudadas por nosso grupo, a que apresentou maior potência foi a tioridazina (TR), sendo assim a droga escolhida para este estudo, cujo objetivo foi estudar os mecanismos moleculares envolvidos na morte celular induzida pela tioridazina em células leucêmicas, investigando o papel das proteínas da família BCL-­2 neste processo, bem como as alterações nas vias de sinalização associadas à morte celular, como estresse do retículo endoplasmático (RE). A TR foi capaz de induzir a apoptose de maneira concentração e tempo­dependente, além de inibir a progressão do ciclo celular nas células leucêmicas K562. Além disso, a morte celular induzida pela tioridazina foi acompanhada de dissipação do potencial de membrana mitocondrial e alterações na expressão das proteínas da família BCL-­2 e ativação das proteínas quinases JNK, ERK1/2 e p38. Nossos resultados também demonstraram que TR é capaz de promover a ativação da proteína pró-­apoptótica BAX e liberação da proteína mitocondrial Omi, eventos característicos da permeabilização da membrana mitocondrial externa. Adicionalmente, observamos que TR foi capaz de promover severo estresse do RE, acompanhado de aumento na expressão das principais proteínas envolvidas na sinalização em resposta a este evento e consequente morte celular. Neste trabalho podemos concluir que a tanto a via mitocondrial como o estresse do retículo endoplasmático contribuem para a morte celular induzida pela TR nas células K562. Estes resultados demonstraram o potente efeito citotóxico da tioridazina nas células leucêmicas e evidenciaram o promissor potencial terapêutico dessa classe de drogas como antitumorais. / Cancer is the leading cause of death worldwide and it is considered a public health problem. Tumor cells exhibit a variety of features that enable tumor growth and dissemination, like resistance to cell death mechanisms. Phenothiazines is a group of drugs that have been used in the treatment of psychiatric disorders for a long time. Literature data demonstrate that these compounds exhibit relevant biological effects including antitumor activity. Publications from our group have evidenced extremely important effects of phenotiazines and analogues on mitochondria related to the increase of calcium cytosolic concentration promoted by this drug. In our earlier work with isolated mitochondria, it was demonstrated that these drugs promote the mitochondrial membrane permeability due to the opening of permeability transition pore complex with consequent dissipation of mitochondrial transmembrane potential, calcium efflux and cytochrome c release. Additionally, in our latest publication, we demonstrated the cytotoxicity of phenothiazines in hepatoma cells, accompanied by cellular morphological alterations, plasma membrane permeability and immediate dissipation of mitochondrial transmembrane potential. Among the studied phenothiazines, the most potent was thioridazine, which was chosen for the present work. The goal of this work was to underlie the molecular mechanisms of thioridazine-­induced cell death in leukemic cells, evaluating the role of BCL-­2 family proteins, as well as changes in signaling pathways associated to cell death, including endoplasmic reticulum (ER) stress. This compound was able to induce apoptosis in a concentration and time-­dependent manner, and also inhibit the cell cycle progression in K562 cells. Furthermore, tioridazine-­induced cell death was accompanied by dissipation of mitochondrial transmembrane potential, alterations in BCL-­2 proteins expression as well as activation of the kinases JNK, ERK1/2 and p38. Our results also demonstrated that thioridazine was able to activate the pro ­apoptotic protein BAX and the release of the mitochondrial protein Omi, resulting in mitochondrial outer membrane permeabilization. In addition, we observed that thioridazine was able to induce a severe ER stress, promoting an increase in the expression of the major sensor proteins in this signaling pathway, leading to cell death. We can conclude that both mitochondrial and ER stress contributes to thioridazine-­induced cell death in K562 cells. Besides the importance of our results to the elucidation of phenothiazines-­induced tumor cells death, it also confirms the promising therapeutic potential of this class of drugs as antitumor agents.