Les substituts valvulaires disponibles actuellement comportent encore plusieurs lacunes. La disponibilité restreinte des allogreffes, les risques de coagulation associés aux valves mécaniques et la durabilité limitée des bioprothèses en tissu animal sont toutes des problématiques que le génie tissulaire a le potentiel de surmonter. Avec la méthode d'auto-assemblage, le seul support des cellules consiste en leur propre matrice extracellulaire, permettant la fabrication d'un tissu entièrement libre de matériau exogène. Ce projet a été précédé par ceux des doctorantes Catherine Tremblay et Véronique Laterreur, ayant respectivement développé une méthode de fabrication de valves moulées par auto-assemblage et une nouvelle version de bioréacteur. Au cours de cette maîtrise, le nouveau bioréacteur a été adapté à une utilisation stérile avec des tissus vivants et la méthode de fabrication de valves moulées a été modifiée puis éprouvée avec la production de 4 prototypes. Ces derniers n'ont pas permis d'obtenir des performances satisfaisantes en bioréacteur, motivant la conception d'une nouvelle méthode. Plutôt que de tenter de répliquer la forme native des valves cardiaques, des études récentes ont suggéré une géométrie tubulaire. Cela permettrait une fabrication simplifiée, une implantation rapide, et un encombrement minimal en vue d'opérations percutanées. Cette approche minimaliste s'accorde bien avec la méthode d'auto-assemblage, qui a déjà été utilisée pour la production de vaisseaux de petits diamètres. Un total de 11 tubes ont été produits par l'enroulement de feuillets fibroblastiques auto-assemblés, puis ont été transférés sur des mandrins de diamètre inférieur, leur permettant de se contracter librement. La caractérisation de deux tubes contrôles a démontré que cette phase de précontraction était bénéfique pour les propriétés du tissu en plus de prévenir la contraction en bioréacteur. Les prototypes finaux pouvaient supporter un écoulement physiologique pulmonaire. Cette nouvelle méthode montre que le procédé d'auto-assemblage a le potentiel d'être utilisé pour fabriquer des valves cardiaques tubulaires. / High hopes are placed on tissue engineered heart valves to circumvent the restricted availability of allografts, the coagulation risks caused by mechanical valves and the limited durability of pericardial bioprostheses. With the self-assembly method, the only support for the cells is the extracellular matrix they themselves produce, allowing the tissue to be completely free from exogenous materials during its entire fabrication cycle. The project was preceded by those of the doctorate students Catherine Tremblay and Véronique Laterreur, who developed a new method to produce auto-assembled molded valves and a new version of the bioreactor used by our group, respectively. During this master, the new bioreactor has been adapted to a sterile use with living tissues and the molded valves method has been modified and tested with the production of 4 prototypes, which didn't provide satisfying results during their bioreactor trials. A new fabrication method was thus developed. Recently, the tubular shape has been suggested as a simple and effective geometry for tissue engineered heart valves, allowing easy fabrication, fast implantation, and minimal crimped footprint from a transcatheter delivery perspective. This minimalistic design is also well-suited for the self-assembly method, which has already proven its potential for small diameter vascular grafts. A total of 11 tubular constructs were produced by rolling self-assembled human fibroblastic sheets on solid mandrels. After maturation, the tissues were transferred onto smaller diameter mandrels to allow their free contraction. The characterization of two control tubes revealed that while preventing further contraction in the bioreactor, this precontraction phase was also beneficial for the tissue properties. The final prototypes could withstand a physiological pulmonary flow. This new method shows that the self-assembly process could be used to achieve functional tubular heart valves.

Le gène RNF213 a été identifié comme un facteur de risque associé au développement de maladies cérébrovasculaires (MCV) notamment, la maladie de Moyamoya (MMM) et les anévrismes intracrâniens (AIC). Malgré une incompréhension des fonctions biologiques exactes, la ring finger protein 213 (RNF213) serait impliquée dans la régulation de la prolifération cellulaire, de l’angiogenèse et de l’inflammation. Les travaux présentés dans cette thèse se concentrent sur le développement de modèles vasculaires in vitro afin de mieux caractériser le rôle de RNF213 dans MCV. L’hypothèse est que l’invalidation de la protéine RNF213 dans des cellules endothéliales (CE) cerébrales pourrait recréer certains phénotypes associés au développement de la MMM et à la formation d’AIC. Des cellules endothéliales microvasculaires humaines de cerveau (hCMEC/D3) invalide en RNF213 (RNF213-/- ) ont été initialement générées par la méthode Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats et la protéine associée Cas9 (CRISPR-Cas9) double nickase. La première partie des travaux porte sur le rôle que jouerait RNF213 dans l’homéostasie de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et dans les étapes précoces de la pathogenèse associée à la MMM. Plus précisément, la perte des jonctions adhérentes provoquée par l’invalidation de RNF213 dans les hCMEC/D3 a été évaluée in vitro sur plusieurs paramètres, tels que la morphologie endothéliale, l’expression génique des protéines de jonctions, la localisation cellulaire, la perméabilité, l’infiltration immunitaire et le sécrétome des cytokines inflammatoires. Les résultats ont démontré que la déficience en RNF213 provoque une diminution de l’expression de la platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1) qui affecte conséquemment la formation adéquate du complexe jonctionnel. De plus, une diminution de l’expression des gènes de la claudine-5, de la b-caténine et de la plakoglobine a été mesurée. La perte de RNF213 est également accompagnée d’un relargage de plusieurs cytokines proinflammatoires. En deuxième lieu, les travaux de cette thèse ont également démontré que RNF213 joue un rôle prépondérant dans le processus angiogénique des hCMEC/D3. Ceci a été étudié sous plusieurs angles d’approches, tels que la prolifération et la migration cellulaire, la formation de micro-capillaires sur un support Matrigel® et dans un modèle tridimensionnel (3D) reconstruit par génie tissulaire, l’expression génique et le sécrétome angiogénique. Les résultats ont démontré une diminution du taux de division cellulaire et une augmentation de la migration. Les études in vitro ont démontré également, pour la première fois, une augmentation significative de la formation de micro-capillaires et de la sécrétion abondante de facteurs pro-angiogénique, tels que le vascular endothelial growth factor (VEGF). Plus précisément, les hCMEC/D3 déficientes en RNF213 forment un réseau plus vaste, dense et étendu de micro-capillaires sur un support de Matrigel®. iii Lorsqu’ensemencées dans un modèle 3D plus complexe structurellement, les hCMEC/D3 forment un réseau pouvant s’apparenter au réseau de capillaires compensatoire retrouvé chez les patients MMM. Dans l’ensemble, l’invalidation du gène RNF213 dans un modèle in vitro 3D de cellules endothéliales cérébrales permet de reproduire certains phénotypes pathologiques de la MMM et devient donc ainsi le 1er modèle in vitro pour l’étude de cette maladie et des autres maladies associées à RNF213. Finalement, nous avons mis au point un nouveau modèle de vaisseaux sanguins de petit calibre reconstruit par génie tissulaire (TEBV) pour son utilisation dans l’étude in vitro de maladies vasculaires et de MCV complexes. L’ensemencement de fibroblastes ou de cellules musculaires lisses (CML) directement sur un mandrin de polyéthylène téréphtalate glycol (PETG) prétraité aux rayons ultraviolets C (UV-C) a permis de former des feuillets circulaires, manipulables et superposables. Avec cette technique, nous avons généré des TEBV complets avec les trois principales couches, soit l’adventitia, la media et l’intima tunica, qui possèdent des propriétés histologiques et mécaniques similaires aux artères humaines natives. Ce modèle optimisé et uniformisé de TEBV permettra de modéliser des pathologies vasculaires complexes, telles que la MMM et les AIC. En effet, la génération de vaisseaux complets à partir de cellules pathologiques ou de cellules éditées génétiquement pourrait faciliter la caractérisation de la pathogenèse et aider au développement de médicaments. / RNF213 has been associated as a susceptibility gene for the development cerebrovascular diseases (CVDs), in particular, moyamoya disease (MMD) and intracranial aneurysms (ICA). While the exact biological functions of RNF213 remain to be demonstrated, it is known to be involved in the regulation of cell proliferation, angiogenesis and inflammation. The work presented in this thesis focuses on the development of vascular models in vitro to better characterize the role of RNF213 in CVDs. The hypothesis is that the complete invalidation of the RNF213 protein in brain endothelial cells (EC) could recreate evident phenotypes associated with the development of MMD and the formation of ICA. We have initially generated human brain microvascular endothelial cells (hCMEC/D3) deficient in RNF213 (RNF213-/- ) using the robust CRISPR-Cas9 double nickase method. At first, our work described the role that RNF213 would play in the homeostasis of the blood-brain barrier (BBB) maintenance and in the early stages of MMD pathogenesis. More specifically, the loss of adherent junctions caused by the invalidation of RNF213 in hCMEC/D3 was evaluated in vitro on several parameters, such as endothelial morphology, gene expression of junctional proteins, cellular localization, permeability, immune infiltration and the secretome of inflammatory cytokines. Our data demonstrated that RNF213 deficiency provokes a significant decrease in the platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1) expression, which consequently affects the proper formation of the junctional complex. A decrease in the expression of the claudin-5, b-catenin and plakoglobin genes was also measured. In addition, RNF213 loss is accompanied with a release of several pro-inflammatory cytokines. Thereafter, the present work also demonstrated that RNF213 plays a preponderant role in the angiogenic process of hCMEC/D3. Angiogenesis has also been characterized on several aspects, such as proliferation, migration, formation of micro-capillaries on a Matrigel®-based support and in a 3D model reconstructed by tissue engineering, gene expression and secretion of angiogenic factors. Our data demonstrates a decrease in cell division rate and an increase in cell migration. In vitro studies have also shown, for the first time, a significant increase in micro-capillary formation and abundant secretion of pro-angiogenic factors, such as the vascular endothelial growth factor (VEGF). More precisely, the hCMEC/D3 deficient in RNF213 forms a wider, denser and more extensive network of micro-capillaries on a Matrigel®-based support. When seeded in a more structurally complex 3D model, hCMEC/D3 form a network that can resemble to the compensatory capillary network found in MMM patients. Overall, the invalidation of the RNF213 gene in a 3D in vitro model of cerebral endothelial cells makes it possible to reproduce certain pathological phenotypes of MMM and v therefore becomes the 1st in vitro model for the study of this disease and other diseases associated with RNF213. Finally, we developed a new model of small-caliber blood vessels reconstructed by tissue engineering (TEBV) to be used to study vascular diseases and complex CVD in vitro. The direct seeding of fibroblasts or smooth muscle cells (CML) onto a polyethylene terephthalate glycol (PETG) mandrel that was pretreated with ultraviolet C (UV-C) radiation facilitate the formation of circular cell sheets, which could be manipulated and stacked in top of each other. Using this novel technique, we were able to successfully generate complete TEBVs with the three main arterial layers: the adventitia, the media and the intima tunica. Taken together, our TEBV model has histological and mechanical properties similar to native human arteries. Furthermore, this optimized and standardized 3D vascular construct will accelerate the scientific progress to modelized complex vascular pathologies, such as MMD and AIC. Indeed, the generation of complete vessels derived from pathological cells or genetically edited cells could facilitate the characterization of pathogenesis and help in the development of drugs.