En raison de ses performances mécaniques exceptionnelles, la soie d’araignée constitue un biomatériau qu’il serait intéressant de reproduire industriellement. Il est cependant impératif de mieux connaître les relations existant entre sa structure et ses propriétés. D’ailleurs, en présence d’eau, cette fibre subit une contraction qui altère ses propriétés mécaniques de même que sa structure moléculaire. Comme cette contraction est intimement liée au processus de filage, une meilleure compréhension de la supercontraction mènerait à une meilleure connaissance de la soie elle-même. Toutefois, la quantité d’informations structurales quantitatives sur la soie dans la littérature est insuffisante. Plus précisément, les structures de la soie en solution et des fibres de soie n’ont jamais été comparées et peu d’études comparent la soie de plusieurs espèces d’araignées, autant à l’état natif que supercontracté. Les contributions des différents facteurs dictant la structure finale de la soie et l’amplitude de la supercontraction restent également mal définies, tout comme les impacts de ce phénomène sur la conformation et l’orientation des protéines. Les objectifs du projet visaient donc à combler ces lacunes en quantifiant la structure moléculaire de la soie dans ses différents états (en solution et fibres natives et supercontractées). Les travaux ont été réalisés à l’aide de la spectromicroscopie Raman sur la soie des araignées Nephila clavipes (NC) et Araneus diadematus (AD). Les résultats ont montré que la conformation des protéines en solution n’est pas déterminante pour la structure finale des fibres. Une proportion de feuillets β et une orientation plus élevées pour la soie de NC, comparativement à celle d’AD, ont aussi été trouvées, expliquant partiellement les différentes propriétés mécaniques et amplitudes de supercontraction observées pour ces fibres. Nos données suggèrent également que la supercontraction induit une légère augmentation de feuillets β, de même qu’une perte d’orientation significative, principalement au sein de la phase amorphe. / Due to its exceptional mechanical performance, spider silk is a biomaterial that would be interesting to reproduce industrially. To this end, the relationships between its structure and its properties have to be known accurately. Moreover, in the presence of water, this fiber undergoes a contraction which alters its mechanical properties as well as its molecular structure. As this contraction is intimately related to the spinning process, a better understanding of supercontraction would lead to a better knowledge of silk itself. However, several quantitative structural information regarding silk is lacking in the literature. More precisely, the structures of silk in solution and silk fiber have never been compared and only few studies compare the silk of several spider species, whether in its native or supercontracted state. The contributions of the different factors determining the final structure of silk and the amplitude of supercontraction also remain undefined, as are the impacts of this phenomenon on the conformation and orientation of silk proteins. The aims of this project were thus to overcome these shortcomings by quantifying the molecular structure of silk in its different states (in solution and native/supercontracted fibers). This work was carried out using Raman spectromicroscopy in order to analyze the silk of the spiders Nephila clavipes (NC) and Araneus diadematus (AD). The results showed that the conformation of the proteins in the dope is not critical for the final structure of the fiber. A higher proportion of β-sheets and orientation level for NC silk compared to that of AD were also found, partially explaining the different mechanical properties and amplitude of supercontraction observed for these fibers. Our data also suggest that supercontraction induces a slight increase in β-sheets, as well as a significant disorientation, mainly within the amorphous phase.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2011-2012 / Le fil de soie d'araignée est un matériau structural ayant des propriétés mécaniques de résistance et d'endurance exceptionnelles. Récemment, Nexia Biotechnologies Inc. a réussi à produire en grande quantité les deux protéines recombinantes (MaSpI et MaSpII) qui composent la soie d'araignée. Un défi important est de pouvoir convertir ces protéines en biomatériaux ayant les propriétés mécaniques désirées, ces dernières étant fortement dépendantes du processus de filage. In vivo, le filage de la soie implique le passage d'une solution protéique concentrée contenue dans la glande à travers une filière conduisant à une fibre insoluble. La conformation des protéines dans la glande serait déterminante pour l'optimisation de ce processus. Dans la première partie de notre projet, nous avons étudié pour la première fois la conformation des protéines de soie d'araignée in situ à l'intérieur de la glande ampullacée majeure ainsi que des deux protéines recombinantes en solution. À cette fin, nous avons utilisé des techniques sensibles à la conformation des protéines comme la spectromicroscopie Raman, la spectroscopie infrarouge et le dichroïsme circulaire vibrationnel (VCD). Les données obtenues par VCD montrent la présence d'hélices 3₁ gauche de type polyproline II (PPH), d'hélices a et de structures désordonnées. La présence de PPII pourrait influencer fortement le processus de filage. En effet, les angles dièdres de la structure PPII et des feuillets, p étant proches, la transition d'un état à l'autre nécessiterait peu d'énergie. La caractérisation des propriétés d'auto-assemblage des protéines recombinantes a également été effectuée. Ces résultats devraient conduire à une meilleure compréhension des paramètres qui gouvernent le processus de filage naturel des protéines de soie. Dans la deuxième partie du projet, nous avons étudié par spectromicroscopie Raman la conformation et l'orientation des protéines de soie dans différents types de fibres produites de l'araignée Araneus diadematus. Les résultats obtenus nous ont permis d'établir des corrélations entre la structure de la soie et les propriétés mécaniques des fibres.

Le domaine C-terminal de MaSpI, la protéine majeure du fil de trame de l'araignée, joue un rôle clé dans le contrôle de la solubilité de cette protéine et l'alignement des fibres de soie. La formation de ces fibres est initiée par des perturbations physicochimiques, telles que des changements de pH, des variations de force ionique et l’accroissement de forces de cisaillement, qui sont toutes rencontrées dans les conduits de la glande ampullacée majeure. La réaction structurale du domaine C-terminal de MaSpI en réponse à ces stimuli reste inconnue. Nous avons donc établi un protocole de purification du segment C-terminal recombinant de la protéine MaSpI de Nephila clavipes qui limite son agrégation. De cette façon, des études structurales ainsi que sur le niveau d'oligomérisation de la protéine ont pu être effectuées dans différentes conditions de pH. Les résultats ont permis de mettre en évidence un possible état conformationnel distinct, dit globule fondu.

Les travaux présentés portent sur l'étude de la structure moléculaire des fibres de soie et de la soie en solution. La spectroscopie infrarouge à réflexion totale atténuée a permis d'étudier la deutération de la soie de l'araignée Nephila clavipes et du ver à soie Bombyx mori. Nous avons pu identifier la présence de structures amorphes, de feuillets β cristallins et de feuillets β interfaciaux dans les deux fibres en plus de calculer leurs proportions et leur orientation. Le dichroïsme circulaire vibrationnel et l'activité optique Raman ont été utilisés pour étudier la structure secondaire de la soie en solution puisque ces techniques sont très sensibles à la conformation des protéines. Les spectres des protéines recombinantes rMaSpI et rMaSpII, analogues aux protéines de la soie d'araignée, et de la soie d'araignée et de Bombyx mori indiquent que la soie forme des hélices 3i en solution dans l'eau et dans l'eau lourde.

La soie d'araignée naturelle est un biomatériau aux propriétés mécaniques exceptionnelles. Elle combine extensibilité et résistance, ce qui la rend supérieure à beaucoup d'autres fibres synthétiques déjà existantes. Puisqu'il est difficile de faire l'élevage des araignées, les biologistes moléculaires ont contourné cette difficulté, en isolant les gènes codant les protéines de soie d'araignée (MaSpI et MaSplI) et en les insérant dans des organismes vivants. Le nouveau défi est de réussir à fabriquer une fibre aussi résistante et extensible que la soie naturelle. La compagnie Nexia Biotechnologies Inc. a réussi l'exploit d'insérer les gènes dans les cellules mammaires de chèvres, d'isoler les protéines de soie d'araignée des autres composantes du lait et de fabriquer des fibres régénérées. En collaboration avec cette compagnie, nous avons étudié par spectromicroscopie Raman la conformation et l'orientation des protéines de soie de fibres régénérées fabriquées industriellement. Nous avons comparé ces résultats avec la soie d'araignée naturelle. L'orientation et la conformation des fibres régénérées sont comparables à la soie naturelle, mais les propriétés mécaniques de ces fibres ne sont pas aussi bonnes. La deuxième partie du projet consistait à étudier l'auto-assemblage des protéines MaSpI et MaSplI produites par Nexia Biotechnologies Inc. à l'interface air-eau en utilisant la technique des films de Langmuir. La microscopie à angle de Brewster (BAM) nous a permis d'étudier la morphologie des films. Nous avons aussi étudié la structure et l'orientation moléculaire des protéines dans les films in situ à l'aide de la spectroscopie infrarouge de réflexion absorption avec modulation de polarisation (PM-IRRAS). Afin de vérifier ces résultats, nous avons transféré les films sur un substrat de germanium, ce qui nous a permis d'utiliser la spectroscopie infrarouge à réflexion totale atténuée (ATR) pour étudier la conformation des protéines et de calculer l'orientation des feuillets fi et des hélices a. Les résultats ont montré que les deux protéines forment des feuillets (3, même à très faible pression de surface. Cependant, lors de la compression des films, les deux protéines se comportent différemment : le pourcentage de feuillets (3 augmente pour la protéine MaSpI alors que pour la protéine MaSplI, il y a une augmentation de la structure en hélice a et une diminution du contenu en feuillet p\

Les propriétés mécaniques remarquables de la soie d'araignée font d'elle la fibre les plus prisée de toutes les fibres naturelles et synthétiques. Une compagnie canadienne de biotechnologie, Nexia a réussi à utiliser des chèvres comme système d'expression pour les protéines de soie d'araignée. Malheureusement, les propriétés mécaniques des fibres produites à partir de la soie de Nexia n'étaient pas à la hauteur de celles des fibres naturelles. Dans le but de produire des fibres synthétiques avec des propriétés mécaniques semblables à celles de la soie naturelle, l'étude du comportement des protéines de soie en solution et sous forme solide est nécessaire. C'est pourquoi des études structurales par RMN en solution et solide des protéines de Nexia et de soie naturelle ont été effectuées. Les résultats suggèrent que les structures désordonnées et en hélices de polyproline II en solution sont importantes pour l'étape préfilage et que ces structures se changent en feuillets-β pour former des cristaux qui confèrent la haute contrainte à la rupture des fibres de soie d'araignée. Les résultats suggèrent aussi la nécessité de forcer les interactions intermoléculaires soit mécaniquement et/ou en changeant les conditions physicochimiques des solutions de protéines pour former des feuillets-β orientés. Des études de RMN et de DLS nous ont permis d'obtenir des diamètres hydrodynamiques pour les protéines de soie en solution et suggèrent un processus de filage alliant des changements de pH, de sels et une augmentation des forces de cisaillement qui forcent les protéines à s'assembler et former des fibres. La baisse de pH dans le processus de filage favoriserait une population oligomérique des protéines. De plus, le sel aiderait à l'entreposage des protéines avant le filage et son absence forcerait les protéines à s'assembler et former un gel. La partie non répétitive conservée C-terminale des protéines de soie semble être d'une grande importance vue la conservation de cette partie de la protéine à travers les derniers 240 millions d'années d'évolution. Un résumé des études effectuées sur ce segment de protéine est également présenté. Des éléments nouveaux dans le processus de filage sont discutés à la lumière des résultats obtenus dans cette thèse.

La soie d’araignée attire grandement l'intérêt de la communauté scientifique en raison de ses propriétés mécaniques exceptionnelles. Celles de la soie d’araignée sont supérieures à celles de la soie du ver à soie et résultent notamment du niveau d’orientation des protéines. Cependant, l’homogénéité de l’orientation moléculaire le long des fibres pourrait également être un facteur déterminant. Pour vérifier cette hypothèse, la variation longitudinale de l’orientation moléculaire a été comparée pour des fibres synthétiques et naturelles par spectromicroscopie Raman. Ensuite, pour mieux comprendre le processus de filage naturel, lequel joue un rôle clé dans la formation de la fibre et sur ses propriétés mécaniques, l’effet de la déformation sur des films de soie régénérée de ver à soie Bombyx mori a été étudié. La spectromicroscopie Raman et le dichroïsme linéaire infrarouge avec modulation de polarisation ont ainsi permis de caractériser les cinétiques de la transition structurale et de l’orientation moléculaire induites par l’étirement. / Silk produced by spiders has aroused the interest of the scientific community with its excellent mechanical properties. Spider silk has better mechanical properties than that of the mulberry silkworm. The β-sheets, known to contribute to the stiffness of the fibers, are preferentially aligned parallel to the fiber axis. According to fracture mechanics, the strength could however be limited if the molecular orientation is not homogeneous along the fiber. We have studied the homogeneity of molecular orientation for silk fibers and synthetic fibers. The spinning process is certainly the key element in the formation of a fiber with excellent mechanical properties. To get a better understanding of this process, we have studied the effect of deformation on regenerated silk films of Bombyx mori. By using Raman spectromicroscopy and polarization modulation infrared linear dichroism, we were able to distinguish two phenomena, which are the formation and the orientation of β-sheets upon application of mechanical stress.

La soie d’araignée, notamment la soie produite par la glande ampullacée majeure (Am), est reconnue comme ayant une ténacité élevée, une bonne résistance mécanique tout en demeurant extensible. Sa structure moléculaire et ses propriétés sont influencées par des facteurs externes comme l’humidité relative et la vitesse de filage. La fibre, par exemple, se contracte de près de la moitié de sa longueur lorsqu’elle est exposée à une humidité élevée, un phénomène nommé supercontraction. Cette étude vise à mieux connaître les propriétés de la soie naturelle et à développer éventuellement une fibre synthétique équivalente. Nous avons caractérisé les fibres de soie Am par spectromicroscopie Raman en lumière polarisée et par résonance magnétique nucléaire (RMN) à l’état solide. La première technique permet de quantifier l’orientation des protéines de soie et de caractériser leur structure secondaire. La RMN permet de déterminer la structure secondaire et la dynamique de relaxation des acides aminés. Les fibres Am de deux espèces d’araignées, Nephila clavipes et Araneus diadematus, ont été obtenues par filage forcé à différentes vitesses (de 0,3 à 2,0 cm/s) et soumises à des taux d’humidité relative supérieurs à 90%. Deux groupes d’araignées ont été marqués isotopiquement avec des solutions de 1-13C-Gly et 1-13C-Ala afin d’analyser la structure et la dynamique d’acides aminés particulièrement importants. Les résultats montrent que l’amplitude de la supercontraction augmente avec la vitesse de filage. Les données indiquent qu’à 1,0 cm/s, l’orientation moléculaire est maximale et qu’elle diminue au-dessus et au-dessous de cette vitesse. Ceci suggère qu’il existe une vitesse de filage pour laquelle les propriétés sont optimales. Les temps de relaxation T1 et T1r des échantillons marqués concordent avec les résultats de spectromicroscopie Raman et suggèrent que les microcristaux de feuillets b de la soie subissent une contraction qui renforce les liaisons intermoléculaires en présence d’eau. / Spider silk, especially the silk produced by the major ampullate glands (Am), is known to have high tenacity, good resistance, and yet remains extensible. Its molecular structure and properties are influenced by external factors such as relative humidity and spinning speed. Fibers, for example, shrink by almost half their length when exposed to high humidity, a phenomenon called supercontraction. This study is intended to better understand the properties of natural spider silk and therefore aid the development of an equivalent synthetic fiber. We characterized Am silk fibers by polarized-light Raman spectromicroscopy and solid-state nuclear magnetic resonance (NMR). The first technique allows for quantification of the orientation of the protein chains and characterization of their secondary structure. Solid-state NMR is used to determine the secondary structure and dynamics of amino acids. The silk of two spider species, Nephila clavipes and Araneus diadematus, was obtained by forced spinning at different speeds (from 0.3 to 2.0 cm/s) and subjected to relative humidity levels greater than 90%. Two groups of spiders were isotopically labeled with 1-13C-Gly and 1-13C-Ala solutions in order to analyze the structure and dynamics of particularly important amino acids. The supercontraction results show that the amplitude of the supercontraction increases with the reeling speed. The data show that at a reeling speed of 1.0 cm/s, the molecular orientation is maximum and decreases above and below this value. This suggests that there is a spinning speed where the properties are optimal. The measurements of the relaxation times T1 and T1r of the labelled samples are consistent with Raman spectromicroscopy results and suggest that b-sheet microcrystals of silk undergo a contraction which strengthens the intermolecular bonds in the presence of water.