Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-05-03T14:36:51Z No. of bitstreams: 1 2016_IsabelGarciaSousa.pdf: 4300650 bytes, checksum: f4e909f6055b9bc65b4d09b0e9497120 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-05-26T18:15:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_IsabelGarciaSousa.pdf: 4300650 bytes, checksum: f4e909f6055b9bc65b4d09b0e9497120 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-26T18:15:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_IsabelGarciaSousa.pdf: 4300650 bytes, checksum: f4e909f6055b9bc65b4d09b0e9497120 (MD5) / As células T CD3+ desempenham um papel importante nas respostas imunológicas associadas à doença autoimune e ao transplante de órgãos. Dados clínicos sugerem que a terapia anti-CD3 é uma opção de tratamento promissora para estas situações, entretanto o mecanismo imunoregulador ainda é incerto. O transplante de órgãos é uma terapia que vem se difundindo como o avanço da medicina. O desenvolvimento de novas técnicas cirúrgicas associadas a drogas imunossupressoras tornou rotineiro o transplante de órgãos. Não obstante, a sobrevivência do enxerto em longo prazo geralmente requer imunossupressão ao longo da vida, e raramente, os receptores exibem uma espontânea '' tolerância operacional '' com função do enxerto estável na ausência de imunossupressão. A falta de marcadores biológicos desse fenômeno se opõe a identificação de pacientes potencialmente tolerantes em que a imunossupressão poderá ser diminuída, e impede o desenvolvimento de novas estratégias de indução de tolerância. Em casos de transplantes de rins a tolerância operacional tem sido associada com a regulação de genes de diferenciação de células T e um aumento do número de células T periféricas totais, naïve e efetoras. Assim, o nosso objetivo foi avaliar biomarcadores de tolerância em diferentes grupos clínicos com transplantes renais: enxerto estável sob imunossupressão (ST), rejeição crônica do transplante renal (CR) e enxerto estável sem imunossupressão (OT). O perfil de expressão gênica de células T do sangue periférico de 15 pacientes renais transplantados (tolerantes operacional, rejeição crônica, função do enxerto estável com imunossupressão) e cinco indivíduos saudáveis foi analisado. Um subconjunto das amostras foi usado para análise de RNA-Seq. Três comparações entre os diferentes grupos de pacientes possibilitou a identificação de alguns genes diferencialmente expressos. Nós confirmamos a expressão desses genes por qPCR em tempo real. Estes biomarcadores foram aplicados na predição de tolerância por qPCR em tempo real em outros pacientes. Nós identificamos um pequeno painel de biomarcadores usando um perfil de expressão gênica em células T do sangue periférico de pacientes transplantados renais espontaneamente tolerantes. A rara coorte livre de drogas imunossupressoras com cinco pacientes transplantados de diferentes regiões do Brasil validaram específicos biomarcadores de tolerância periférica. A assinatura gênica aqui obtida sugere um padrão de apoptose por respostas das células T na rejeição crônica, bem como um viés de Treg na tolerância operacional. Estes genes podem também contribuir para o processo de tolerância, possivelmente através da regulação de fenótipos específicos de células Tregs periféricas ou alterando o limiar para a ativação de células T. Este conjunto de genes associados com a tolerância operacional podem ainda ter utilidade como uma ferramenta de monitoramento minimamente invasiva para guiar a titulação de imunossupressão. Além disso, a validação dessa ferramenta para a minimização da imunossupressão segura em ensaios clínicos prospectivos se justifica. Nas células T, os microRNAs (miRNAs) regulam várias vias, incluindo as associadas com a tolerância imunológica. Assim, o nosso objetivo foi também, avaliar as alterações na expressão de miRNAs em células T de dadores saudáveis, após o tratamento com anticorpos anti-CD3 humano. As células mononucleares do sangue periférico foram cultivadas na presença do anticorpo monoclonal OKT3, ou um fragmento recombinante do anticorpo humanizado anti-CD3. Após estes tratamentos, o perfil de expressão de 31 espécies de miRNAs foram avaliadas em células T utilizando ensaios TaqMan. Oito desses miRNAs testados (miR-155, miR-21, o miR-146 A de miR-210, miR-17, o miR-590-5p, miR-106 e miR-301A) foram regulados (estatisticamente significativos) negativa ou positivamente em relação a células não tratadas. Em conclusão, a estimulação de células T com anticorpos anti-CD3 humano altera os padrões de expressão de miRNAs, incluindo espécies associadas com vias de regulação do sistema imunológico. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / CD3+ T cells play a major role in immune responses associated with autoimmune disease and organ transplantation. Clinical data have suggested that anti-CD3 therapy is a promising treatment option for these situation, but it's immuno regulatory mechanism is still unclear. Organ transplantation is a therapy that has been disseminated to the advancement of medicine. The development of new surgical techniques associated with immunosuppressive drugs become routine organ transplantation. But, long-term allograft survival generally requires life long immunosuppression. Rarely, recipients display spontaneous ‘‘operational tolerance’’ with stable graft function in the absence of immunosuppression. The lack of biological markers of this phenomenon precludes identification of potentially tolerant patients in which immunosuppression could be tapered and hinders the development of new tolerance-inducing strategies. In kidney transplants operational tolerance has been associated with up regulation of T cell differentiation genes and an increased number of total, naïve and effector peripheral T cells. Thus our aim was evaluate tolerance biomarkers in different clinical groups with renal transplants: stable under immunosuppression (ST), chronic rejection of the renal transplant (CR) and stable renal transplant without immunosuppression (OT). The gene expression profile of peripheral blood T cells from 15 renal transplant patients (operational tolerance, chronic rejection, stable graft function in mmunosuppression) and five healthy individuals were analyzed. A subset of samples was used for RNA-Seq analysis. Three comparisons between different groups of patients allowed the identification of some differentially expressed genes. We confirm the differentially expression of genes by real-time qPCR. We have identified a small biomarker panel using gene expression profiling of T cell in the peripheral blood from spontaneously tolerant renal transplant recipients. The rare immunosuppressive drug free cohort of five transplant patients from different regions of Brazil, have validated specifics biomarkers of peripheral tolerance. The gene signature here obtained suggests a pattern of apoptosis by T cell cytotoxic responses in chronic rejection, well as T reg bias in operational tolerance. These genes may also contribute to the process of tolerance possibly by regulating specific phenotypes of peripheral regulatory T cells or altering the threshold for T cell activation. This set of genes associated with operational tolerance may have utility as a minimally invasive monitoring tool for guiding immunosuppression titration. Further the validation of this tool for safe immunosuppression minimization in prospective clinical trials is warranted. In T cells, microRNAs (miRNAs) regulate several pathways, including those associated with immune tolerance. Thus our aim was also evaluate changes in miRNA expression in T cells of healthy donors following treatment with anti-human CD3 antibodies. Peripheral blood mononuclear cells were cultured in the presence of the monoclonal antibody OKT3 or a recombinant fragment of humanized anti-CD3. Following these treatments, the expression profiles of 31 miRNA species were assessed in T cells using TaqMan arrays. Eight of the tested miRNAs (miR-155, miR-21, miR-146a, miR-210, miR-17, miR-590-5p, miR-106b and miR-301a) were statistically significative up- or downregulated relative to untreated cells. In conclusion, stimulation of T cells with anti-human CD3 antibodies alters miRNA expression patterns, including of miRNA species associated with immune regulatory pathways.

A indução de tolerância ao aloenxerto, no contexto do transplante clínico, é um dos maiores desafios da imunologia. Existem pacientes transplantados que mesmo após a retirada de imunossupressores mantêm a função estável do aloenxerto. Este estado é chamado de tolerância operacional. Nosso objetivo foi analisar se os indivíduos em tolerância operacional tem um perfil imunológico molecular diferencial em relação aos outros grupos clínicos, visando identificar potenciais mecanismos envolvidos na manutenção desse estado de não agressão ao órgão transplantado. Analisamos 10 doadores renais saudáveis (Sau) e 32 indivíduos transplantados renais, sendo 4 tolerantes operacionais (TO), 11 com rejeição crônica (RC), 12 com função renal estável e imunossupressão convencional (Est) e 5 com função renal estável e baixa imunossupressão (BI). Analisamos a expressão gênica, em células mononucleares do sangue, de um painel de moléculas predominantemente imunorreguladoras ou próinflamatórias (REGULA/INFLAMA), por PCR em tempo real, em duas amostras, com intervalos de 4-6 meses. Quantificamos as células T CD4+CD25+Foxp3+, por citometria de fluxo, e estudamos a ativação de duas vias de sinalização, IL-6/STAT3 e IL-4/STAT6, por PhosFlow, nos diferentes grupos de estudo. Nós observamos algumas diferenças significativas entre os indivíduos TO e os outros grupos de estudo, (p<0,05). A expressão dos genes de TGF- e TGF-R foi maior no grupo de indivíduos TO em comparação aos grupos Est e BI, analisando-se 2 tempos distintos. A expressão de GATA-3 foi maior no grupo TO comparado a todos os outros grupos de estudo. A expressão gênica de Foxp3 foi maior no grupo TO comparado aos grupos RC e BI, apenas quando analisamos as 2 amostras. Neste painel REGULA/INFLAMA, o grupo TO teve um predomínio de modificações do tipo REGULA, em ambos os tempos estudados, e maior estabilidade na expressão gênica entre as 2 amostras. Em relação as células T CD4+CD25+Foxp3+, os grupos RC e Est tiveram menores números absolutos e porcentagens em comparação aos outros grupos. O grupo TO teve uma quantidade dessas células semelhantes aos grupos Sau e BI. No estudo das vias de sinalização observamos que a fosforilação de STAT6, na região de monócitos, foi menor em indivíduos TO quando comparada a todos os outros grupos estudados. O painel de moléculas REGULA/INFLAMA, utilizado neste estudo, permitiu determinar um perfil imunológico molecular com características predominantemente imunorreguladoras no grupo TO. O perfil de fosforilação da via de sinalização IL-4/STAT6 nos indivíduos TO, na região de monócitos, nos permite interpretar que essas vias sejam mobilizadas de forma diferente, podendo participar deste estado de não agressão ao enxerto. A redução de células T CD4+CD25+Foxp3+ nos indivíduos com imunossupressão convencional (grupos RC e Est) nos permite interpretar que a imunossupressão afeta essa população celular, potencialmente imunorreguladora. O maior número de células T CD4+CD25+Foxp3+, nos indivíduos TO e BI nos permite sugerir que essas células tenham um papel importante no estado de tolerância operacional. Também o fator de transcrição GATA-3 parece desempenhar um importante papel na indução/manutenção do estado de TO, sugerindo que um desvio Th2 seja relevante para a manutenção deste estado. Os nossos resultados nos permitem interpretar que o estado de tolerância operacional tem uma repercussão sistêmica e que essas moléculas parecem ser relevantes e talvez dominantes neste estado de homeostase no contexto do transplante renal humano. / standard immunosuppression, lead us to suggest that these cells may be affected by immunosuppression. Moreover, the higher numbers of CD4+CD25+Foxp3+ T cells observed in TO and BI individuals suggest that these cells may have an important role in the induction/maintenance of these two homeostatic states of minimal, or of no aggression to the graft. Furthermore, the higher mRNA expression of GATA-3, in the TO group, suggests that a Th2 deviation may also be relevant to the maintenance of operational tolerance. Our results allowed us to interpret that the state of operational tolerance has systemic repercussion, and that the molecules studied in our work may be relevant to the process of homeostasis in the context of human kidney transplantation.

A indução de tolerância ao aloenxerto, no contexto do transplante clínico, é um dos maiores desafios da imunologia. Existem pacientes transplantados que mesmo após a retirada de imunossupressores mantêm a função estável do aloenxerto. Este estado é chamado de tolerância operacional. Nosso objetivo foi analisar se os indivíduos em tolerância operacional tem um perfil imunológico molecular diferencial em relação aos outros grupos clínicos, visando identificar potenciais mecanismos envolvidos na manutenção desse estado de não agressão ao órgão transplantado. Analisamos 10 doadores renais saudáveis (Sau) e 32 indivíduos transplantados renais, sendo 4 tolerantes operacionais (TO), 11 com rejeição crônica (RC), 12 com função renal estável e imunossupressão convencional (Est) e 5 com função renal estável e baixa imunossupressão (BI). Analisamos a expressão gênica, em células mononucleares do sangue, de um painel de moléculas predominantemente imunorreguladoras ou próinflamatórias (REGULA/INFLAMA), por PCR em tempo real, em duas amostras, com intervalos de 4-6 meses. Quantificamos as células T CD4+CD25+Foxp3+, por citometria de fluxo, e estudamos a ativação de duas vias de sinalização, IL-6/STAT3 e IL-4/STAT6, por PhosFlow, nos diferentes grupos de estudo. Nós observamos algumas diferenças significativas entre os indivíduos TO e os outros grupos de estudo, (p<0,05). A expressão dos genes de TGF- e TGF-R foi maior no grupo de indivíduos TO em comparação aos grupos Est e BI, analisando-se 2 tempos distintos. A expressão de GATA-3 foi maior no grupo TO comparado a todos os outros grupos de estudo. A expressão gênica de Foxp3 foi maior no grupo TO comparado aos grupos RC e BI, apenas quando analisamos as 2 amostras. Neste painel REGULA/INFLAMA, o grupo TO teve um predomínio de modificações do tipo REGULA, em ambos os tempos estudados, e maior estabilidade na expressão gênica entre as 2 amostras. Em relação as células T CD4+CD25+Foxp3+, os grupos RC e Est tiveram menores números absolutos e porcentagens em comparação aos outros grupos. O grupo TO teve uma quantidade dessas células semelhantes aos grupos Sau e BI. No estudo das vias de sinalização observamos que a fosforilação de STAT6, na região de monócitos, foi menor em indivíduos TO quando comparada a todos os outros grupos estudados. O painel de moléculas REGULA/INFLAMA, utilizado neste estudo, permitiu determinar um perfil imunológico molecular com características predominantemente imunorreguladoras no grupo TO. O perfil de fosforilação da via de sinalização IL-4/STAT6 nos indivíduos TO, na região de monócitos, nos permite interpretar que essas vias sejam mobilizadas de forma diferente, podendo participar deste estado de não agressão ao enxerto. A redução de células T CD4+CD25+Foxp3+ nos indivíduos com imunossupressão convencional (grupos RC e Est) nos permite interpretar que a imunossupressão afeta essa população celular, potencialmente imunorreguladora. O maior número de células T CD4+CD25+Foxp3+, nos indivíduos TO e BI nos permite sugerir que essas células tenham um papel importante no estado de tolerância operacional. Também o fator de transcrição GATA-3 parece desempenhar um importante papel na indução/manutenção do estado de TO, sugerindo que um desvio Th2 seja relevante para a manutenção deste estado. Os nossos resultados nos permitem interpretar que o estado de tolerância operacional tem uma repercussão sistêmica e que essas moléculas parecem ser relevantes e talvez dominantes neste estado de homeostase no contexto do transplante renal humano. / standard immunosuppression, lead us to suggest that these cells may be affected by immunosuppression. Moreover, the higher numbers of CD4+CD25+Foxp3+ T cells observed in TO and BI individuals suggest that these cells may have an important role in the induction/maintenance of these two homeostatic states of minimal, or of no aggression to the graft. Furthermore, the higher mRNA expression of GATA-3, in the TO group, suggests that a Th2 deviation may also be relevant to the maintenance of operational tolerance. Our results allowed us to interpret that the state of operational tolerance has systemic repercussion, and that the molecules studied in our work may be relevant to the process of homeostasis in the context of human kidney transplantation.