Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-09-16T15:51:30Z No. of bitstreams: 1 2015_AthosSilvadeOliveira.pdf: 12748933 bytes, checksum: 9219eb4b52c4419292e5b3c66c671f0e (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-11-24T15:34:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_AthosSilvadeOliveira.pdf: 12748933 bytes, checksum: 9219eb4b52c4419292e5b3c66c671f0e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-24T15:34:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_AthosSilvadeOliveira.pdf: 12748933 bytes, checksum: 9219eb4b52c4419292e5b3c66c671f0e (MD5) / Tomato spotted wilt virus (TSWV) bem como outras espécies de tospovírus (Família Bunyaviridae) é responsável por perdas substanciais na produção de vegetais ao redor do mundo. Tospovírus são transmitidos de maneira circulativa e propagativa por tripes (Ordem Thysanoptera). Como para outros patógenos, ações contra tospovírus exigem um olhar holístico, envolvendo uma combinação de táticas culturais, fitosanitárias, químicas e biológicas, quando apropriadas, além do uso de cultivares resistentes. Entretanto, o controle de doenças causadas por tospovírus tem se mostrado difícil, dado o grande espectro de hospedeiros desses vírus e a grande eficiência dos tripes vetores em transmiti-los. Além disso, a dependência e o aumento no uso de inseticidas de baixo custo tem exacerbado a presença de tospovírus pela forte pressão de seleção sobre os tripes vetores que se tornam resistentes a diferentes inseticidas. Para solucionar de forma simples todas as questões financeiras e ambientais associadas ao uso abusivo de inseticidas para o controle de tripes, esforços têm aumentado para a obtenção de cultivares geneticamente resistentes como um componente integral das estratégias de controle de doenças. Até o momento existem duas fontes de resistência disponíveis para o melhoramento genético de hortaliças à TSWV. Uma dessas fontes é o cluster genético Sw-5, o qual foi encontrado em Solanum peruvianum L., uma espécie de tomate selvagem do Peru, e tem sido introduzido em cultivares de S. lycopersicum L. (tomate comercial). Após mapeamento gênico, pelo menos cinco parálogos compõem o cluster genético Sw-5 em S. peruvianum, os quais foram nomeados de Sw-5a a Sw-5e. Esses parálogos codificam receptores do tipo NB-LRR, uma classe de proteínas citoplasmática que ativam resistência após reconhecimento direto ou indireto de patógenos que tenham ultrapassado as primeiras barreiras de defesa do sistema imune vegetal. Transformação de plantas de tabaco com os parálogos Sw-a e Sw-5b revelou que somente o último ativa resistência contra isolados de TSWV. Com a disponibilidade do genoma do tomate, genes ortólogos também foram mapeados em S. lycopersicum. Esta tese inicia-se com uma descrição detalhada do sistema imune vegetal e descobertas anteriores sobre o cluster genético Sw-5 (Capítulo 1). Como parte da introdução, os problemas causados por tospovírus e suas características são descritas. Tendo essas informações como ponto de partida, esta tese focou no entendimento de pontos-chaves da resistência mediada pela proteína Sw-5b contra tospovírus com uma atenção especial nos eventos moleculares e celulares envolvidos atrás desse mecanismo de resistência. Análises funcionais foram realizadas para esclarecer as delimitações genéticas entre os ortólogos funcionais e não funcionais do cluster Sw-5 no reconhecimento de tospovírus e ativação de resistência. Já que transformantes de N. tabacum com o gene Sw-5b feitos anteriormente não apresentaram resposta hipersensitiva (HR) após inoculação com TSWV, plantas de N. benthamiana foram transformadas com o gene Sw-5b buscando linhas transgênicas que poderiam responder com HR e assim facilitar a identificação do determinante de avirulência (Avr) de TSWV (Capítulo 2). Enquanto N. tabacum foi transformada com o gene Sw-5b sob controle de seus próprios elementos regulatórios, N. benthamiana foi transformada com o gene Sw-5b sob controle do promotor 35S do Cauliflower mosaic virus (CaMV). De forma interessante, as plantas transformadas de N. benthamiana apresentaram forte HR após inoculação de suas folhas com TSWV e outras quatro espécies de tospovírus: Alstroemeria necrotic streak virus (ANSV), Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Groundnut ringspot virus (GRSV) and Impatiens necrotic spot virus (INSV) (Capítulos 2 e 7). Para identificação do Avr, os genes de TSWV foram clonados e expressos individualmente em folhas de N. benthamiana expressando Sw-5b e em isolinhas de tomate resistentes (contendo Sw-5) para monitoramento de HR. Como resultado, HR foi induzida após expressão da proteína não-estrutural NSM do isolado BR-01 de TSWV que induz resistência, mas não do isolado GRAU de TSWV que quebra resistência (Capítulo 2). Foco sobre a proteína NSM seguiu no capítulo 3. Versões truncadas dessa proteína foram transientemente co-expressas com Sw-5b em folhas de N. benthamiana (wild type). Tais versões truncadas excluíam domínios anteriormente associados com formação de túbulos, movimento viral célula-célula e sistêmico. Proteínas NSM truncadas faltando até 50 aminoácidos (aa) de ambos N e C terminais (NSM inteira contém 301 aa) ainda induziram HR, sugerindo que funções associadas ao movimento viral e comportamento como Avr são características independentes para NSM. No capítulo 4 experimentos foram realizados para caracterizar uma nova espécie de tospovírus observado em plantas de feijão que apresentavam sintomas de mosaico necrótico em São Paulo, Brasil (2006). Microscopia eletrônica de folhas sintomáticas revelou partículas pleiomórficas agrupadas em vesículas. Devido ao fato de feijão ser um hospedeiro não usual e pelo resultado negativo em testes de ELISA para outras espécies já conhecidas por circular no Brasil, testes biológicos, sorológicos e moleculares foram realizados para caracterização de uma provável nova espécie de tospovírus. Este vírus apresentou um estreito espectro de hospedeiros, infectando sistemicamente três de vintes espécies de plantas indicadoras e apresentou propriedades sorológicas únicas quando comparado com outras espécies de tospovírus encontradas no Brasil. O sequenciamento do genoma deste tospovírus revelou uma nova espécie que, junto com Soybean vein necrosis-associated virus (SVNaV), representa uma nova linhagem evolutiva de tospovírus circulando no continente americano. Este tospovírus foi tentativamente chamado Bean necrotic mosaic virus (BeNMV). Já que a proteína Sw-5b reconhece pelo menos cinco espécies de tospovírus de origem “americana”, a proteína NSM do BeNMV também foi testada para monitoramento de HR através de sua co-expressão com Sw- 5b em folhas de N. benthamiana. O resultado, entretanto, mostrou que a proteína NSM do BeNMV não é um Avr cognato da proteína Sw-5b. No capítulo 5 é mostrado que a proteína Sw-5b induz HR dependentemente e independentemente da presença de NSM. A forma independente foi observada através da coexpressão da proteína Sw-5b com supressores de silenciamento gênico (p19 e NSS), os quais aumentaram a acumulação celular da proteína Sw-5b, induzindo auto-HR. Esta observação permitiu o screening de indução de HR e reconhecimento de NSM como eventos independentes para as outras proteínas Sw-5. Enquanto Sw-5a induziu auto-HR, ela não foi capaz de reconhecer NSM como Avr. De forma diferente, o ortólogo mais conservado das proteínas Sw- 5a e Sw-5b de S. lycopersicum susceptível a TSWV, nomeado Sw-5aS, não induziu qualquer tipo de HR. Através da co-expressão dos domínios individuais de Sw-5b, CC, NB-ARC, LRR ou de versões combinadas (CC-NB-ARC e NB-ARC-LRR) com NSM e com o supressor de silenciamento gênico p19, o papel desses domínios na indução de HR e no reconhecimento de NSM foram determinados. Enquanto NB-ARC foi suficiente para induzir auto-HR, NB-ARC-LRR induziu tanto auto quanto HR dependente de NSM, indicando que o domínio LRR especifica o reconhecimento do Avr. Já o domínio CC suprimiu HR induzida por NB-ARC em cis e trans, apontando para uma função regulatória de CC. A superexpressão do domínio NB-ARC de Sw- 5aS não resultou em HR, similar ao resultado da proteína Sw-5aS completa. Após alinhamento dos domínios NB-ARC, três variações de aminoácidos (aa) foram encontradas entre as proteínas Sw-5a, Sw-5b e Sw-5aS, os quais foram revertidos no último. Quando a glutamina da posição 599 foi convertida em uma arginina (Q599R), igual a proteína Sw-5b nesta posição, o domínio NB-ARC da proteína Sw-5aS tornou-se funcional para indução de HR. Modelagem deste domínio revelou que esta mutação encontra-se fora do domínio de ligação de ADP/ATP, o qual é importante para o switching entre os estados on e off dos domínios NB-ARC. Finalmente, a fusão do domínio LRR da proteína Sw-5b na variante Q599R do domínio NBARC de Sw-5aS resultou em auto-HR e HR dependente de NSM. Os construtos codificando os domínios da proteína Sw-5b também foram usados para estudos subcelulares no capítulo 6. Para este propósito, todas as proteínas estavam fusionadas a Green Fluorescence Protein (GFP) na porção N-terminal para tornar possível a visualização por microscopia confocal em tecido folhear. Enquanto a proteína Sw-5b inteira, os domínios CC, NB-ARC e LRR e o combinado CC-NB-ARC apresentaram distribuição nucleocitoplasmática, NB-ARC-LRR localizou-se somente no citoplasma, sugerindo que CC sinaliza o importe nuclear. Os domínios NB-ARC e LRR também foram investigados para uma possível interação direta com NSM através da técnica Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC). Enquanto interação direta não foi observada entre LRR e NSM, o domínio NB-ARC aparentou interagir com NSM. As especificidades para o reconhecimento de NSM como Avr são discutidas no capítulo 7, levando em consideração aspectos evolutivos de tomates e tospovírus. Um modelo da ativação da proteína Sw-5b é postulado no texto tendo como base a dissecção desta proteína e os ensaios de localização subcelular, além de sua putativa interação direta com NSM. / Tomato spotted wilt virus (TSWV) along with other tospovirus species (family Bunyaviridae) is responsible for substantial losses in crop production around the world. Tospoviruses are transmitted in a propagative and circulative manner by thrips vectors (Order Thysanoptera). As for other pathogens, disease management against tospoviruses pursues a holistic approach involving a combination of cultural, phytosanitary, chemical, and biological tactics, when suitable in addition to the use of resistant crops. Nevertheless, successful control has proven difficult given the broad host range of these viruses and their effective spread by thrips vectors. More importantly, increased reliance on the use of low-cost insecticides has exacerbated tospovirus spread by causing thrips resistance. To ease the financial and environmental constraints associated with insecticide abuse to control thrips, efforts have been increased to obtain genetically resistant cultivars as an integral component of disease management strategies. So far there are two resistance sources available for commercial breeding of vegetables against TSWV. One of these sources is the Sw-5 gene cluster, which has been found in Solanum peruvianum L., a wild species of tomato from Peru, and has been introgressed in S. lycopersicum L. cultivars (commercial tomatoes). After gene mapping, it has been reported that at least five paralogs compose the Sw-5 gene cluster in S. peruvianum, which were named Sw- 5a to Sw-5e. These paralogs encode NB-LRR receptors, a class of cytoplasmic proteins that activate disease resistance upon direct or indirect recognition of pathogens that have overcome the first lines of defense of the plant immune system. Transformation of tobacco plants with the paralogs Sw-5a and Sw-5b, revealed that only the latter triggers resistance against TSWV isolates. With the availability of the tomato genome, highly conserved orthologs have been mapped in S. lycopersicum as well. This thesis started off with a detailed description of the plant immune system and previous findings about the Sw-5 gene cluster (Chapter 1). As part of this introduction, the problems caused by tospoviruses, to which Sw-5b locus confers resistance and the characteristics of these viruses have been described. With this knowledge as a starting point, this thesis focused on unraveling the key features of Sw-5b-mediated resistance against TSWV with special attention to the molecular and cellular events underlying the resistance mechanism. Functional analyses have been performed towards clarification of the genetic delimitations between functional and non-functional Sw-5 orthologs considering tospovirus recognition and resistance triggering. Since earlier made N. tabacum transformants containing Sw-5b did not show a hypersensitive response (HR) upon challenging with TSWV, N. benthamiana have been transformed with Sw-5b aiming to obtain transgenic lines that would respond with a visual HR and thereby facilitate the identification of the avirulence determinant (Avr) from TSWV (Chapter 2). While N. tabacum plants were transformed with Sw-5b gene under control of its own regulatory elements, the N. benthamiana plants were transformed with the Sw-5b gene under control of the Cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter. Interestingly, the Sw-5btransformed N. benthamiana plants presented a strong HR upon challenging with TSWV and four other tospoviruses: Alstroemeria necrotic streak virus (ANSV), Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Groundnut ringspot virus (GRSV) and Impatiens necrotic spot virus (INSV) (Chapter 2 and 7). To identify the Avr, TSWV genes were cloned and expressed individually in leaves of Sw-5b-transformed N. benthamiana plants and Sw-5-resistant tomato isolines for HR monitoring. As a result, HR was triggered upon expression of the non-structural protein NSM from the resistance-inducing TSWV isolate BR-01, but not from the resistance-breaking TSWV isolate GRAU (Chapter 2). The research on NSM was continued in Chapter 3, in which truncated versions of this protein were transiently co-expressed with Sw-5b in wild type N. benthamiana leaves. These truncations lacked domains previously associated with tubule formation, cell-tocell and systemic viral movement. Truncated NSM proteins lacking up to 50 amino acids (aa) from either the N- or C-terminus (full NSM is 301 aa in size) still triggered Sw-5b-mediated HR, suggesting that viral movement functions of NSM and its fate as Avr are independent from each other. Chapter 4 described experiments to characterize a new tospovirus collected from bean plants showing necrotic mosaic symptoms during a field survey in São Paulo, Brazil (2006). Electron microscopy of symptomatic leaves revealed pleomorphic particles packed in vesicles. Due to its unusual natural host for a “Brazilian” tospovirus and being negative in ELISA for tospovirus species known to be circulating in Brazil, biological, serological, and molecular tests were performed to further characterize this putatively new tospovirus species. The virus appeared to have a narrow host-range, systemically infecting only three out of twenty test-plants of various species and presented unique serological properties when compared to other known tospovirus species. The genome sequencing of this tospovirus revealed a completely new species, which, together with Soybean vein necrosis-associated virus (SVNaV), represents a second evolutionary lineage of tospoviruses circulating in the American continent. This new tospovirus was tentatively named Bean necrotic mosaic virus (BeNMV). Since the Sw-5b protein recognizes at least five tospovirus species of “American” origin, the NSM protein of BeNMV was also tested for HR-triggering through co-expression with Sw-5b in N. benthamiana leaves. The outcome, however, indicated that the NSM protein of BeNMV is not a cognate Avr of the Sw-5b protein. In Chapter 5 it is shown that the Sw-5b protein triggers both NSM-dependent and - independent HR. The latter was achieved by co-expression of Sw-5b with RNA silencing suppressors (p19 and NSS), which increased the Sw-5b cellular accumulation and lead to auto- HR. This observation allowed the screening of HR-triggering and NSM-recognition as uncoupled events for other Sw-5 proteins as well. While Sw-5a could trigger auto-HR, it lacked the ability to recognize NSM as Avr. On the other hand, the highest conserved ortholog of Sw-5a and Sw-5b from susceptible S. lycopersicum, named here as Sw-5aS, lacked both auto-HR and NSMdependent HR. By co-expression of the individual Sw-5b domains CC, NB-ARC, LRR or combined versions (CC-NB-ARC and NB-ARC-LRR) with NSM and the silencing suppressor p19, the role of these domains in HR-triggering and NSM-recognition was determined. While NBARC was sufficient for auto-HR, NB-ARC-LRR triggered both auto- and NSM-dependent HR, indicating that LRR specifies the Avr recognition. The CC domain suppressed HR triggered by NB-ARC in cis and trans, pointing towards a regulatory function for CC. The overexpression of the NB-ARC domain from Sw-5aS did not result in HR, similar to the outcome with the full-length Sw-5aS protein. After alignment of the NB-ARC domain, three mismatches were found between Sw-5a, Sw-5b, and Sw-5aS which were reverted in the latter. When the glutamine at position 599 was converted into an arginine (Q599R), to mimic the situation in the Sw-5b protein at this position, the Sw-5aS NB-ARC domain became functional for auto-HR triggering. Modeling of this domain revealed that this mutation was outside of the ADP/ATP binding site, which is important for the switching between “on” and “off” states of NB-ARC domains. Finally, the fusion of the LRR domain of Sw-5b to the Q599R variant of the Sw-5aS NB-ARC domain resulted in both auto- and NSM-dependent HR. The constructs encoding the various Sw-5b domains were used for subcellular studies in Chapter 6. To this end, all constructs encoded proteins were fused with Green Fluorescence Protein (GFP) at their N-terminus, to enable easy visualization by confocal microscopy in leaf tissue. Whereas the full-length Sw-5b protein, the individual domains CC, NB-ARC, and LRR and the combined CC-NB-ARC version showed a nucleocytoplasmic distribution, NB-ARC-LRR localized only in the cytoplasm, suggesting that CC signalizes nuclear import. The subdomains NB-ARC and LRR were also investigated for a possible direct interaction with NSM using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC). While for LRR interaction with NSM was not observed, the NB-ARC domain seemed to directly bind to NSM. The specificities for NSM recognition have been discussed in Chapter 7 taking into consideration evolutionary aspects of tomatoes and tospoviruses. A model for Sw-5b activation is postulated throughout the text based on the dissection of this protein in HR-triggering and subcellular localization assays and on its putative direct interaction with NSM.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-04-07T12:59:49Z No. of bitstreams: 1 2016_TadeuAraujoSouza.pdf: 1810896 bytes, checksum: 875d57d95829fcdd5ba22d41167265c1 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-04-07T16:48:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_TadeuAraujoSouza.pdf: 1810896 bytes, checksum: 875d57d95829fcdd5ba22d41167265c1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-07T16:48:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_TadeuAraujoSouza.pdf: 1810896 bytes, checksum: 875d57d95829fcdd5ba22d41167265c1 (MD5) / O tomateiro (Solanum lycopersicum) é um das hortaliças mais cultivadas em todo o mundo, inclusive no Brasil, principalmente pelas suas características nutricionais e pela sua importância sócio econômica. Essa cultura pode ser alvo de uma grande diversidade de pragas, incluindo alguns grupos de vírus. Entre os principais encontram-se as espécies dos gêneros Begomovirus, Tospovirus e Crinivirus. Os crinivírus são vírus emergentes, com duas espécies conhecidas em tomateiro Tomato chlorosis virus (ToCV) e Tomato infectious chlorosis virus (TICV) e que foram identificadas em meados da década de 90, nos Estados Unidos. No Brasil, até o momento, apenas ToCV foi relatado infectando o tomateiro. Geneticamente, o ToCV é composto por duas moléculas de RNA fita simples, encapsidadas em partículas virais longas e flexuosas. A transmissão é feita por três espécies de moscas-brancas: Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum e T. abutiloneus. Em tomateiro, o principal sintoma caracteriza-se por manchas cloróticas que desenvolvem uma clorose internerval intensa, visualizada principalmente nas folhas baixeiras. O primeiro relato de ToCV no Brasil ocorreu em 2008 e, desde então, este vírus tem sido encontrado nas principais regiões produtoras de tomate do país, porém ainda é pouco estudado. Devido a essa demanda de pesquisa, o objetivo desse trabalho foi determinar a gama de hospedeiros do ToCV no Brasil. Foram avaliadas 50 espécies dentre elas, plantas cultivadas e não cultivadas, inoculadas com ToCV pelo inseto vetor (B. tabaci biótipo B). Do total de plantas avaliadas, nove espécies foram suscetíveis ao isolado testado de ToCV, indicando a potencial capacidade dessas plantas de atuarem como hospedeiras alternativas de ToCV em campo. Concluiu-se então que é necessária maior preocupação com as plantas Amaranthus hibridus, Solanum americanum, Nicandra physaloides e Physalis angulata, pois além de suscetíveis a ToCV, são plantas altamente infestantes em lavouras de tomate e potenciais hospedeiras alternativas do vírus na ausência ou na presença da cultura. Na ausência de tomateiro nas áreas de produção, o virus pode permanecer nas hospedeiras alternativas e, na presença de tomateiro, tais hospedeiras são potencias fontes de inóculo de ToCV. O sinergismo entre ToCV e o tospovírus Tomato spotted wilt virus (TSWV) foi recentemente relatado na Espanha. Nessa interação, há aparentemente um favorecimento da infecção de TSWV em plantas resistentes (com gene Sw-5), quando previamente infectadas por ToCV. Por se tratar de um relato preocupante, parte desse trabalho foi então desenvolvido para avaliar esse sinergismo entre ToCV e tospovírus em tomateiro. Foram selecionadas as cultivares resistentes a tospovírus, Predador e Viradoro, e a cultivar suscetível Dominador, utilizada como controle nos ensaios. As cultivares de tomateiro resistentes foram previamente infectadas por ToCV pelo inseto vetor e, posteriormente, inoculadas com os tospovírus Tomato chlorotic spot virus (TCSV) e Groundnut ringspot virus (GRSV). Após a inoculação, as plantas resistentes não foram infectadas pelos tospovírus, avaliadas visualmente e por teste sorológico (Dot-Elisa). Adicionalmente, foi utilizado outro modelo biológico com Nicotiana benthamina não transgênica e transgênica, transformada constitutivamente com o gene Sw-5. As plantas transgênicas resistentes previamente infectadas por ToCV e posteriomente inoculadas com os tospovírus apresentaram sintoma de lesão local, indicando resistência e ausência de infecção sistêmica. A infecção prévia de ToCV não alterou a expressão do gene Sw-5, responsável por conferir resistência a tospovírus em plantas de tomate e N. benthamiana. Estudos para identificar hospedeiras alternativas de ToCV e compreender o comportamento dos vírus em casos de infecção mista constituem ações indispensáveis para o sucesso de qualquer estratégia de controle. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The tomato (Solanum lycopersicum) is one of the most cultivated vegetables around the world, including Brazil, mainly by their nutritional characteristics and socio-economic importance. This crop is affected by a large variety of pests and pathogens, including some viruses. The major species are found within the genus Begomovirus, Tospovirus and Crinivirus. The criniviruses are emerging viruses, with two known species in tomato Tomato chlorosis virus (ToCV) and Tomato infectious chlorosis virus (TICV). They were identified in the mid 90s, in the United States. In Brazil, only ToCV was reported in tomatoes. Genetically, ToCV consists of two single-stranded RNA molecules, encapsidated in long and flexuous viral particles. They are transmitted by three whitefly species: Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum and T. abutiloneus. In tomato, the main symptoms are characterized by chlorotic spots, which evolve to strong internerval chlorosis, mainly visualized in the lower leaves. The first report of ToCV in Brazil was made in 2006 and since then the virus has been found in the main producing regions of tomato of the country. However, it has been poorly studied. Due to this demand, the aim of this study was to determine the host range of ToCV in Brazil. A total of 50 species of cultivated and non-cultivated plants was tested in inoculation with ToCV by the insect vector (B. tabaci biotype B). Nine species were shown to be susceptible to ToCV infection, indicating the potential ability of these plants to act as alternative hosts of ToCV in the field. Therefore, it was concluded that the growers are concerned with the following plants: Amaranthus hibridus, Solanum americanum, Nicandra physaloides and Physalis angulata. They were all susceptible to ToCV, and are frequently found in tomato crops. They are potential virus alternative hosts in the absence of tomato plants, and when tomatoes are present, they can act as inoculum source of ToCV to these plants. The possible synergism between ToCV and the tospovirus Tomato spotted wilt virus (TSWV) was recently reported. In this interaction, apparently a ToCV infection foster TSWV infection in TSWV-resistant plants (contatining the Sw-5 gene). The interaction between two or more viruses can result in unexpected pathological consequences and because of this possible impact in the Brazilian tomato production, we evaluated this synergism between ToCV and tospovirus in tomatoes in the Brazilian conditions. The tospovirus-resistant cultivars Predador and Viradoro were selected, and the susceptible cultivar Dominador was used as control in the assays. Resistant tomato cultivars were previously infected with ToCV by the insect-vector and then inoculated with tospoviruses Tomato chlorotic spot virus (TCSV) and Groundnut ringspot virus (GRSV). After inoculation, the resistant plants were not infected, confirmed by visual inspection and a sorologic test (Dot-Elisa). In addition, a similas test was performed using transgenic and non-transgenic Nicotiana benthamiana plants, which are constitutively transformed with the gene Sw-5. The resistant transgenic plants previously infected with ToCV and subsequently inoculated with TCSV and GRSV showed local lesion symptoms, indicating resistance and absence of systemic infection. The prior infection of the resistant plants with ToCV did not alter the expression of the Sw-5 gene. It is believed that this absence of resistance breakdown is possibly associated with the tomato variety and the viral species that were used. The identification of alternative hosts of ToCV and undertanding the interaction of the viruses in cases of mixed infection are essential information to enable the success of any virus control strategy.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2010. / Submitted by Luiza Moreira Camargo (luizaamc@gmail.com) on 2011-07-04T18:12:40Z No. of bitstreams: 1 2010_RobertadaCruzPereira ok.pdf: 1709311 bytes, checksum: c1bb464ecec358ca605fe0db691a07bb (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-07-08T19:41:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_RobertadaCruzPereira ok.pdf: 1709311 bytes, checksum: c1bb464ecec358ca605fe0db691a07bb (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-08T19:41:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_RobertadaCruzPereira ok.pdf: 1709311 bytes, checksum: c1bb464ecec358ca605fe0db691a07bb (MD5) / A mancha bacteriana do tomateiro é causada por, pelo menos, quatro espécies de Xanthomonas (Xanthomonas euvesicatoria, X. vesicatoria, X. perforans e X. gardneri), sendo uma das doenças mais importantes tanto para o tomate de mesa, quanto para o de indústria no Brasil. Oitenta e um isolados oriundos de campos comerciais de tomate para mesa, coletados em 23 localidades nas Regiões Sul, Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste do Brasil, entre os anos de 2005 a 2009, foram identificados para determinar a ocorrência dessas espécies. Esses isolados foram caracterizados por rep-PCR (BOX e REP), PCR com iniciadores específicos e testes de patogenicidade em genótipos suscetíveis de tomateiro e pimentão. Alta frequência de X. perforans (49,4%) e X. gardneri (40,7%) foi observada. Somente dois isolados corresponderam a X. euvesicatoria e seis a X. vesicatoria. Apenas na Região Sudeste do país foi detectada a presença das quatro espécies. Todos os isolados causaram sintomas em tomate, e somente isolados de X. euvesicatoria e 30 isolados de X. gardneri causaram sintomas em pimentão. Para determinação das raças, avaliou-se a presença/ausência dos genes avrRxv (presentes na raça T1) e avrXv3 e reação no genótipo de tomateiro CNPH 1500, portador do gene Xv3. Todos os isolados de X. perforans induziram reação de hipersensibilidade neste genótipo, indicando que pertencem à raça T3, o que foi, na maioria dos casos, confirmado por avrXv3-PCR. Isolados de X. vesicatoria e X. gardneri foram classificados como raça T2, pois nenhum produto foi detectado por PCR (genes avrRxv e avrXv3). Dentre os 81 isolados, portanto, foram identificadas as raças T1, T2 e T3, não sendo encontradas as raças T4 e T5. Avaliou-se também a sensibilidade in vitro de todos os isolados ao cobre e estreptomicina. Utilizou-se sulfato de cobre nas concentrações 50, 100 e 200 μg/mL e sulfato de estreptomicina nas concentrações 25, 50 e 100 μg/mL, considerando-se resistentes os isolados que apresentaram crescimento confluente em três repetições. Nenhum isolado foi resistente ao cobre na concentração de 200 μg/mL. Entretanto, 97,53% dos isolados foram resistentes a 100 μg/mL e 98,77% foram resistentes à concentração de 50 μg/mL. A frequência de isolados resistentes à estreptomicina foi 8,64% (100 μg/mL), 76,54% (50 μg/mL) e 83,95% (25 μg/mL). Isolados representantes das quatro espécies apresentaram resistência a ambos, cobre e estreptomicina. Este é o primeiro levantamento e caracterização de espécies de Xanthomonas em tomate de mesa no Brasil. ___________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Tomato bacterial spot is caused by at least four Xanthomonas species (Xanthomonas euvesicatoria, X. vesicatoria, X. perforans and X. gardneri), and is one of the most important diseases of both processing and fresh market tomato crops in Brazil. Eighty one isolates, collected from 23 commercial tomato fields, located in southern, southeastern, central-west and northeastern regions of the country, from 2005 to 2009, were identified to determine the occurrence of these species. These isolates were characterized through rep-PCR-based fingerprint analysis (BOX and REP-PCR), PCR with species-specific primers and pathogenicity tests on tomato and pepper susceptible varieties. Highest frequencies were observed for X. perforans (49.4%) and X. gardneri (40.7%). Only two isolates were X. euvesicatoria and six were X. vesicatoria. The occurrence of all four species was detected only in the southeast region of Brazil. All isolates were pathogenic on tomato. On pepper, only those of X. euvesicatoria and 30 isolates of X. gardneri caused bacterial spot symptoms. Isolates were also classified in races by avrRxv (present in race T1) and avrXv3-PCR amplification and by hypersensitive reaction on tomato genotype carrying the Xv3 gene. All X. perforans isolates induced hypersensitive response on this genotype, indicating that they belong to race T3, and in most cases confirmed by avrXv3-PCR. Xanthomonas vesicatoria and X. gardneri isolates were classified as race T2 since no PCR products were detected for avrRxv or avrXv3. Among the 81 isolates, races T1, T2 and T3 were identified, while races T4 and T5 of X. perforans were not detected. Sensitivity of all isolates to copper and streptomycin was evaluated by in vitro assays, with 50, 100 and 200 μg/mL of copper sulfate and 25, 50 and 100 μg/mL of streptomycin sulfate, with three replicates. Resistance was detected when bacterial growth was observed in all three replicates. None of the isolates was resistant to copper at 200 μg/mL. However, 97.53% were resistant to copper at 100 μg/mL and 98.77% were resistant to copper at 50 μg/mL. The frequencies of isolates resistant to streptomycin were 8.64% (100 μg/mL), 76.54% (50 μg/mL) and 83.95% (25 μg/mL). Isolates representing all four Xanthomonas species showed resistance, both to copper and streptomycin. This is the first survey and characterization of xanthomonads on fresh market tomatoes in Brazil.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-05-10T16:28:52Z No. of bitstreams: 1 2016_MônicaAlvesdeMacedo.pdf: 2460081 bytes, checksum: 2dc1ee3be1e436c154643736063b6c8a (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-05-11T11:41:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_MônicaAlvesdeMacedo.pdf: 2460081 bytes, checksum: 2dc1ee3be1e436c154643736063b6c8a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-11T11:41:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_MônicaAlvesdeMacedo.pdf: 2460081 bytes, checksum: 2dc1ee3be1e436c154643736063b6c8a (MD5) / Até meados da última década, as tospoviroses e begomoviroses eram as duas viroses que mais preocupavam os tomaticultores brasileiros. No entanto, em 2006, outra virose, a crinivirose, foi identificada em plantas de tomate no estado de São Paulo. Hoje, as viroses com maior incidência em tomateiro são a begomovirose e a crinivirose. O manejo adequado de doenças transmitidas por vetores ainda é um desafio devido à grande carência de informações sobre os processos epidemiológicos dessas doenças sob condições de campo. Em vista dessa carência de informação, os principais objetivos desse trabalho foram estudar os processos epidemiológicos envolvidos na begomovirose e crinivirose em tomateiro com o intuito de obter informações que possam ajudar na elaboração de estratégias de manejo para a redução dos prejuízos causados por viroses em tomateiro. Os temas deste trabalho foram divididos em três capítulos. O capítulo 1 foi destinado à revisão bibliográfica. O capítulo 2 descreve o estudo do progresso espacial e temporal de begomovirose em tomateiro de crescimento determinado. O capítulo 3 foi destinado ao estudo do progresso temporal e espacial de begomovirose e crinivirose em tomateiro de crescimento do tipo indeterminado. Nos estudos de distribuição e espacial de viroses, parcelas de 15 x 15 plantas foram demarcadas e avaliadas semanalmente, quanto à presença ou ausência de sintomas característicos das viroses. Um monitoramento da população de moscas-brancas, coleta e detecção de vírus em plantas daninhas e cultivadas presentes dentro e/ou ao redor das parcelas experimentais foi realizado. Tomatosevererugosevirus (ToSRV) e Tomatochlorosisvirus (ToCV) foram respectivamente a espécie de begomovirus predominante e a única espécie de crinivirus encontrada nas amostras coletadas. Algumas plantas cultivadas e não cultivadas estavam infectadas com ToSRV ou ToCV, indicando que são potenciais plantas hospedeiras alternativas. Não foi observada correlação positiva entre a incidência de begomovirose ou crinivirose e a flutuação das populações de mosca-branca. Nas áreas monitoradas, o progresso da doença foi invariavelmente rápido, com um padrão levemente agregado das plantas sintomáticas de begomovirus (tomateiro estaqueado e rasteiro) / ou crinivirus (tomateiro estaqueado). Não foi verificada diferença significativa nas análises temporais e espaciais entre as duas espécies virais ou entre áreas de produção. No entanto, foi observada uma diferença significativa entre parcelas experimentais localizadas no centro (PC) e na borda (PE) dos pivôs centrais (área de cultivo) em tomateiro para processamento. Os resultados de análises temporais mostraram que os valores de incidência e área abaixo da curva de progresso da doença de begomovirus foram menores em PC do que em PE. Em análises espaciais, plantas sintomáticas em PC foram mais agregadas que em PE. Todos esses resultados sugerem fortemente que a distribuição de plantas sintomáticas de begomovirus em PC e PE é governada por diferentes mecanismos de disseminação. Embora essas análises temporal e espacial comparativas entre parcelas localizadas na borda e centro só tenham sido realizadas em tomateiro rasteiro, acredita-se que a dinâmica das begomoviroses e criniviroses em tomateiro estaqueado segue mesmo padrão. Em especial, verificou-se que o padrão de distribuição da crinivirose e da begomovirose é semelhante, mesmo as duas viroses apresentando modos de transmissão distintos pela mosca-branca. Esse padrão foi similar ao observado em PE, indicando que a dispersão primária assume papel relevante na disseminação das duas doenças. Levando em consideração os resultados obtidos no trabalho recomenda-se como manejo de viroses em tomateiro: a realização de um planejamento de plantio evitando associação de cultivos susceptíveis a begomovirus e também com bons hospedeiros do inseto-vetor; a prevenção de plantio escalonado; a eliminação de restos culturais e plantas de tomate voluntárias; e o controle do inseto vetor durante todo o cultivo do tomateiro dentro e fora da lavoura até a eliminação total das plantas. Todas essas medidas de manejo devem ser realizadas de forma integrada e regional para o sucesso de controle das viroses em tomateiro. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Tospovirus and begomovirus diseases are the two most important viral diseases that affect Brazilian tomato crops in the last two decades. However, in 2006, another viral disease caused by a crinivirus was identified infecting tomato plants in the state of São Paulo, Brazil. Today, the viral diseases with higher incidence in tomato are the ones caused by begomoviruses and criniviruses. Management of vector-borne diseases remains a challenge due to the great lack of information on epidemiological aspects of these diseases under field conditions. In view of this lack of information, the main objectives of this work were to study the epidemiological processes involved in begomovirus and crinivirus diseases in tomato; evaluate the effect of a tomato-free-period in the incidence of the diseases caused by begomovirus and tospovirus in this crop; and evaluate the potential of five plant species as alternative host for Tomato severe rugose virus (ToSRV) and Bean golden mosaic virus (BGMV) in order to obtain information that could help in the development of management strategies to reduce the losses caused by these viral diseases. The subjects of this study were divided into five chapters. Chapter 1 contains the literature review. The chapter 2 describes the spatial and temporal distribution of the begomovirus disease in processing tomato production areas. Chapter 3 reports the temporal and spatial progress of begomovirus and crinivirus diseases in fresh market tomato production areas. In chapters 2 and 3, plots of 15 x 15 plants were marked and weekly evaluated for the presence or absence of characteristic symptoms of these diseases in the plants. Monitoring of the whitefly populations, collection and detection of viruses in weeds and in cultivated plants present inside or around of the experimental plots were carried out. These studies revealed that ToSRV and Tomato chlorosis virus (ToCV) were the predominant begomovirus species and the only crinivirus species found in the areas. Some cultivated and uncultivated plants were infected with ToSRV or ToCV, indicating that they are potential alternative host plants. There was no positive correlation between the incidence of begomovirus or crinivirus disease and the fluctuation of the whitefly population. In the monitored areas, the progress of the diseases was invariably fast, with a slightly aggregated pattern of symptomatic plants infected by begomovirus or crinivirus. There was no significant difference in the temporal and spatial analysis between the two viral species or among the tomato production areas. However, a significant difference was observed between the experimental plots located in the center (PC) and the edge (PE) of the central pivot described in Chapter 2. These results have shown that the values of incidence and the area under disease progress curve of begomovirus were lower in PC than in PE. In the spatial analyses, symptomatic plants in PC were more aggregated than in PE. All these results strongly suggest that the distribution of begomovirus symptomatic plants in PC and PE is ruled out by different spreading mechanisms. Although these temporal and spatial analyses of comparative plots located at the edge and in the center have only been carried out in processing tomato areas, it is believed that the spread of begomovirus and crinivirus disease in fresh market tomato crops follows the same pattern. In particular, it was found that the distribution pattern of crinivirus and begomovirus is similar, although they have different transmission mechanisms by whiteflies. The spatial distribution pattern of these diseases was similar to that observed in begomovirus disease in PE in processing tomato areas, indicating that the primary dispersion assumes an important role in the spread of the two diseases. In Taking all these results together, for the management of tomato viruses it is recommended: avoid areas with susceptible hosts for begomoviruses and good insect-vector hosts; prevention of continuous planting; elimination of crop residues and voluntary tomato plants; insect vector control during the cultivation of tomato inside and outside the field until the total elimination of the crop. All these management measures should be undertaken in an integrated and regional basis for a successful control of these viruses in tomato.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-02-03T14:00:48Z No. of bitstreams: 1 2016_ThaisPereiraMartins.pdf: 1887975 bytes, checksum: 70c34a740639c7a34264c3c76f0c3839 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-14T19:07:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_ThaisPereiraMartins.pdf: 1887975 bytes, checksum: 70c34a740639c7a34264c3c76f0c3839 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-14T19:07:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_ThaisPereiraMartins.pdf: 1887975 bytes, checksum: 70c34a740639c7a34264c3c76f0c3839 (MD5) / O tomateiro é uma solanácea cultivada em várias partes do mundo, com fruto rico em compostos com propriedades antioxidantes e anticancerígenas. A tomaticultura está sujeita a várias doenças que podem limitar sua produção, diversos vírus têm sido descritos e estão amplamente disseminados nos campos de produção. As viroses estão dentre as doenças de maior importância, pois são de difícil controle e não existem produtos anti-virais disponíveis no mercado. A diagnose das espécies virais é realizada comumente por técnicas tradicionais e modernas, testes sorológicos como o ELISA e testes moleculares como a RT-PCR e a PCR são utilizados para detecção de patógenos previamente caracterizados. As limitações dessas técnicas aparecem quando se trata da detecção e identificação de um novo vírus. Identificar o agente causador de uma nova doença, onde não se tem informações sobre a morfologia, composição ou características químicas e físicas do patógeno, utilizando tais técnicas juntamente com microscopia eletrônica constitui uma tarefa difícil que pode demorar meses ou anos. Devido a essas dificuldades, novas abordagens para melhorar a identificação dos agentes causadores de novas doenças foram desenvolvidas. A abordagem metagenômica utilizando o método de Sanger gerou uma série de realizações importantes, porém, ao final do século XX, o sequencimento de alto desempenho (Next generation sequencing – NGS) foi lançado para suprir as limitações desse método. O sequenciamento de alto desempenho sequencia massalmente a população de ácidos nucleícos presentes em uma amostra, gerando sequências curtas de uma ou de ambas as extremidades, conhecidas como reads. O advento dessa forma de sequenciar transformou os estudos metagenômicos de grande escala em procedimentos práticos e de baixo custo. Com o objetivo de conhecer a população viral (viroma) e de obter genomas virais completos ou parciais, o sequenciamento de alto desempenho foi implementado para detectar patógenos virais em tomateiros de Brazlândia (DF), Campinas (SP) e Araguari (MG). Amostras de tomateiros que apresentavam sintomas típicos de infecções virais foram coletadas e agrupadas em cinco amostras compostas: BRAZ, com plantas de Brazlândia e AHOL, TOCA1, TOCA2, com plantas de Campinas e CAM-RNY2, com plantas de Araguari. As amostras compostas foram submetidas ao processo de semi-purificação de partículas virais, à extração de RNA e posteriormente foram enviadas para sequenciamento na plataforma Illumina HiSeq2000, na Macrogen (Coréia do Sul). Diversos vírus de ocorrência habitual nos campos de produção brasileiros foram detectados: os tospovírus Groundnut ringspot virus, o Tomato spotted wilt virus; o tobravírus Pepper ringspot virus; o crinivírus Tomato chlorosis virus; os begomovírus Sida micrantha mosaic virus e o Tomato severe rugose virus; o tymovírus Tomato blistering mosaic virus; e os potyvírus Pepper yellow mosaic virus e Potato virus Y. O Pepper mild mottle virus foi detectado como um resultado inesperado, devido à predominância de tobamoviroses causadas por Tomato mosaic virus em tomateiro. Dois contigs da amostra BRAZ geraram suspeitas de existência de uma nova espécie de ilarvírus, devido a sua baixa identidade com Ageratum latent virus e Parietaria mottle virus. O amalgavírus Southern tomato virus foi detectado em todas as bibliotecas e dois genomas semi-completos foram montados (STV-DF e STV-MG). Esses genomas mostraram alta identidade de nucleotídeos entre si e com os demais isolados de STV depositados no banco de dados. O STV é um vírus de RNA fita-dupla de aproximadamente 3,5 Kbp, pertencente ao gênero Amalgavirus, que foi descrito na América do Norte (Estados Unidos e México). Não há evidências de transmissão mecânica ou por enxertia desse vírus, porém, estudos anteriores confirmaram elevadas taxas de transmissão vertical (70% – 90%). Os relatos desse vírus têm crescido nos últimos anos, foi relatado também na França, na Espanha, na China, na Itália e em Bangladesh. A detecção sempre em co-infecção com outros vírus e a ausência de sintomas em plantas positivas para o vírus gerou dúvidas a respeito de sua patogenicidade, porém sua alta taxa de transmissão vertical e a expansão de sua distribuição gerou preocupações para a indústria do tomate. Maiores estudos são necessários para definir o efeito de sua presença em lotes de sementes comerciais e o seu potencial de patogenicidade. Com o objetivo de caracterizar o isolado de STV encontrado no Brasil, a presença desse vírus foi confirmada e foi realizado um estudo filogenético, além da detecção por RT-PCR em plantas coletadas no campo e em sementes comerciais de tomateiro utilizando dois pares de primers. Todas as amostras compostas originais testadas apresentaram resultados positivos para RT-PCR, com ambos os primers. A clonagem e sequenciamento de fragmento gerado a partir da amostra BRAZ possibilitou a obtenção dos nucleotídeos faltantes na sequência STV-DF. A análise filogenética da RNA polimerase pelo método da máxima verossimilhança, mostrou agrupamento dos isolados de STV-DF e STV-MG com as demais sequências de STV. Os isolados de STV permaneceram próximos a outros vírus pertencentes à família Amalgaviridae, que se mostraram mais próximos dos vírus da família Partitiviridae que do vírus pertencente à família Totiviridae. O vírus foi detectado em amostras coletadas em Brazlândia e Taquara (DF), em São José do Rio Preto (SP), em Corúmba de Goiás, Morrinhos e Goianápolis (GO) e em Reserva (PR) As plântulas testadas das cultivares Predador, Santa Clara, H-9992 e H-9553 também apresentaram resultados positivos para infecção por STV. A alta similaridade entre os isolados de STV encontrados e os existentes e a detecção desse vírus em plântulas de sementes comerciais indicam uma provável introdução do vírus através de materiais vegetais importados. Aproximadamente um sétimo dos vírus de plantas conhecidos são transmitidos por sementes de pelo menos uma espécie vegetal por ele infectada. A detecção desse vírus em plântulas oriundas de sementes comerciais demonstra a fragilidade do controle do material vegetal que entra no país. Quatorze países exportam sementes de tomate para o Brasil sem a análise de risco de pragas por estarem autorizados pelo MAPA. Embora a importação seja importante para a economia do país, a ineficiência das medidas fitossanitárias para autorizar a entrada das sementes pode trazer consequências desastrosas para agricultura brasileira. / The tomato is a solanaceous plant, rich in substances with antioxidant properties, and which is cultivated in several regions of the world. Susceptible to infection by different viruses, the tomato production has serious risks that limit its production. Viruses are among the most important diseases because of the difficulty in their control. The diagnosis of viral species is commonly carried out by traditional and modern techniques, such as serological and molecular tests such as PCR or RT-PCR, which are used to detect previously characterized pathogens. These tools have limitation in cases when there is a need for detection and identification of unknown viruses. The identification of the etiological agent of a new disease, i.e. without information on particle morphology, genome composition and chemical and physical properties, starting from electron microscopy, is a difficult task that can take months or years to accomplish. To circumvent these difficulties, new techniques were developed. The metagenomics approach, using the Sanger method, has generated a number of important achievements, but at the end of the 21st century, high-performance sequence was launched to overcome the limitations of this method. The Next generation sequencing (NGS) strategy enables the determination of sequences of the whole population of nucleic acids present in a sample, by generating sequences of one or both ends (named reads). The advent of this sequencing technique has transformed metagenomic studies of large-scale practical and with a low cost. In order to determine the viral population (virome) and assemble the complete or partial viral genomes present in tomato plants, high-performance sequencing has been implemented in plants collected in the regions Brazlândia (DF), Campinas (SP) and Araguari (MG). Tomato samples with typical symptoms of viral infections were collected and grouped into five composite samples: BRAZ, containing plants collected in Brazlândia; AHOL, TOCA1, TOCA2 from Campinas; and CAM-RNY2 from Araguari. The composite samples were subjected to the process of semi-purification of viral particles, extraction of RNA and sequencing on Illumina platform HiSeq2000 at Macrogen, Inc. (South Korea). Several viruses commonly found in Brazilian production fields were detected, such as tospovírus Groundnut ringspot virus and Tomato spotted wilt virus; the tobravírus Pepper ringspot virus; the crinivírus Tomato chlorosis virus; the begomovírus Sida micrantha mosaic virus and Tomato severe rugose virus; the tymovírus Tomato blistering mosaic virus; and the potyvírus Pepper yellow mosaic virus and Potato virus Y. The tobamovirus Pepper mild mottle virus was also detected, though this result was not expected due to the predominance of Tomato mosaic virus in tomato. Two contigs generated from BRAZ sample showed a proximity to the ilarvirus Ageratum latent virus and Parietaria mottle virus suggesting the presence of a new ilarvirus in the plants. The amalgavirus Southern tomato virus (STV) was detected in all libraries and two semi-complete genomes (STV-DF and STV-MG) were assembled. These genomes showed high nucleotide identity each other and among other STV sequences deposited in nucleotide databases. STV is a double-stranded RNA virus of approximately 3.5 kbp, belonging to the genus Amalgavirus, which was described in North America (United States and Mexico). There is no evidence for mechanical transmission or by grafting of this virus, however, previous studies have confirmed high vertical transmission rates (70% - 90%). The reports of this virus have increased in the last years, being reported in France, Spain, China, Italy and Bangladesh. Questions regarding its pathogenicity properties are unanswered since they are usually detected in co-infection with other viruses and because of the absence of symptoms in positively infected plants. Its high rate of vertical transmission and the expansion of its worldwide spread are of big concerns for the tomato industry. Further studies are needed to define the effect of their presence in batches of commercial seeds and its potential for pathogenicity. In order to characterize the STV isolates found in Brazil, the presence of this virus has been confirmed and we performed a phylogenetic study, in addition to the RT-PCR using two primer sets, detection in plants collected in the field and in commercial tomato seeds. The original composite test samples were all positive for RT-PCR with both primer sets. The gap on the STV NGS-sequence from Brazlândia was filled by cloning and sequencing of an RT-PCR amplified fragment. The phylogenetic analysis of the RNA-dependent RNA polymerase gene by the maximum likelihood method showed grouping of STV-DF and STV-MG sequences with other STV sequences reported throughout the world. The STV sequences were closely related to viruses of other genus within the family Amalgaviridae, and to those of Partitiviridae than to those of Totiviridae. The virus was detected in new samples from Brazlândia and Taquara (DF), in São José do Rio Preto (SP), in Corumba de Goiás, Morrinhos and Goianápolis (GO), and Paraná (PR). Seedlings tested for the detection of STV of the cultivars Predator, Santa Clara, H-9992 and H-9553 were positive. The high identity among the isolates and the high incidence rate of STV in seeds indicate a possible introduction of the virus from the tomato seeds. Approximately one in seven known plant viruses is transmitted by seeds of at least one plant species. The detection of this virus in commercial seed seedling demonstrates the fragility in the control system of importation of plant materials. Fourteen countries export tomato seeds to Brazil without the need of risk analysis of pests because they are authorized by MAPA. Although this importation is important for the tomato production chain, the inefficiency of phytosanitary regulation system by authorizing the entry of contaminated seeds can have disastrous consequences for the Brazilian agriculture.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-04-18T17:27:04Z No. of bitstreams: 1 2016_CamiladeMoraesRêgo.pdf: 1373455 bytes, checksum: 866646c292e87f395d38288f63900a94 (MD5) / Rejected by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br), reason: Por favor, Faça o uplod do arquivo desbloqueado. on 2016-04-18T20:15:02Z (GMT) / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-04-18T20:18:32Z No. of bitstreams: 1 2016_CamiladeMoraesRêgo.unlocked.pdf: 1287996 bytes, checksum: e3b9fd59779f32102638d15e8f57b636 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-04-19T21:31:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_CamiladeMoraesRêgo.unlocked.pdf: 1287996 bytes, checksum: e3b9fd59779f32102638d15e8f57b636 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-19T21:31:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_CamiladeMoraesRêgo.unlocked.pdf: 1287996 bytes, checksum: e3b9fd59779f32102638d15e8f57b636 (MD5) / O tomateiro (Solanum lycopersicum) é uma das principais hortaliças cultivadas no mundo. Entre as doenças que ocorrem nesta cultura, as viroses destacam-se pela dificuldade do seu controle. A begomovirose é uma das principais doenças virais do tomateiro, com alta incidência nas áreas produtoras do país. O uso de plantas resistentes é a estratégia mais eficiente e de baixo custo para minimizar as perdas causadas pelos begomovírus. Contudo, o crescente plantio de cultivares com resistência pode resultar na seleção de isolados virais específicos, acelerar a alteração da composição populacional dos begomovírus e culminar na quebra da resistência. Como ainda não há informações se essa seleção realmente ocorre nas condições brasileiras, este trabalho foi desenvolvido objetivando analisar e comparar as espécies de begomovírus presentes em amostras de tomateiro rasteiro das cultivares Heinz-9553 (suscetível a begomovirose) e BRS Sena (resistente a begomovirose) coletadas em Luziânia-GO, além de avaliar a diversidade genômica dentro de cada espécie encontrada. Verificou-se que nas plantas de BRS Sena a severidade da doença é menor e os sintomas são pouco evidentes. A diversidade de begomovírus nas amostras foi incialmente analisada através da técnica de RCA/RFLP e os resultados obtidos foram confirmados por PCR específica e clonagem. Duas espécies de begomovírus foram detectadas em ambas as cultivares estudadas, Tomato severe rugose virus (ToSRV) e Tomato mottle leaf curl virus (ToMoLCV), sendo ToSRV a mais predominante. Comparações entre as sequências mostraram que isolados virais (ToSRV ou ToMoLCV) obtidos de uma mesma planta são mais próximos, enquanto que isolados obtidos de cultivares diferentes são mais distantes. Nos dados de variação genética, avaliados pela ocorrência de mutações nos isolados de cada espécie, constatou-se a presença de inserções e deleções de nucleotídeos apenas em regiões intergênicas/não-codificantes do genoma de ToSRV e ToMoLCV. Mutações causadas por substituição de nucleotídeos foram observadas ao longo das ORFs do genoma de ambas as espécies. Um maior número de mutações por substituição ocorreu nas sequências do DNA-A de ToSRV e ToMoLCV obtidas de plantas resistentes. As ORFs AC1 (Rep) e AV1 (CP) das duas espécies de begomovírus apresentaram maior número de substituições de nucleotídeos. Quanto às análises filogenéticas, verificou-se que os begomovírus se agrupam com base na localização geográfica. O conjunto dos resultados indica que, possivelmente, os isolados virais obtidos da cultivar resistente estão passando por um processo inicial de variação genética decorrente da pressão seletiva imposta pelo uso de plantas resistentes. Contudo, para confirmar esta hipótese, novas análises precisam ser realizadas em populações maiores de ToSRV e ToMoLCV. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Tomato plant (Solanum lycopersicum) is one of the main vegetables grown in the world. Among the diseases that affect this culture, virus infections are particularly important due to the difficulty in their control. From these, a begomovirus disease is one of the major diseases of tomato plants, occurring in high incidence in the growing areas of the country. The use of resistant plants is the most efficient and cost-effective strategy to minimize losses caused by begomoviruses. However, an increasing cultivation of resistant cultivars may result in selection of specific viral isolates, accelerate changes in the begomovirus population composition, and lead to the breakdown of resistance. Since it is not known whether this selection actually occurs in our conditions, the aim of this work was to analyze and compare the begomovirus species present in processing tomato plants on two cultivars, Heinz-9553 (susceptible to begomovirus infection) and BRS Sena (resistant to begomovirus infection) collected in Luziânia-GO, and to evaluate the genome diversity within each species. It was observed that infected BRS Sena plants are less severely infected, and symptoms are mild. The diversity of begomoviruses in the samples was initially analyzed by RCA/RFLP and the results were confirmed by species-specific PCR and cloning. Two begomovirus species were detected in both cultivars, Tomato severe rugose virus (ToSRV) and Tomato mottle leaf curl virus (ToMoLCV), being ToSRV the most prevalent. Based on sequence comparisons, it was observed that the viral isolates (ToSRV or ToMoLCV) are closer when isolated from the same plant, whereas isolates from different cultivars are more distant. In the genetic variation analyses, measured by mutation occurrence in the isolates of each species, the presence of nucleotide insertions and deletions was only found in intergenic/non-coding regions of both ToSRV and ToMoLCV genome, while mutations caused by nucleotide substitution were observed throughout the ORFs in the genome of both species. A higher number of substitutions was found in DNA-A sequences of ToSRV and ToMoLCV from resistant plants. Most of the nucleotide substitutions were seen in AC1 (Rep) and AV1 (CP) ORFs of the two begomoviruses. Following phylogenetic analysis, it was clear that the begomoviruses are grouped together based on their geographical origin. The results indicate that most possibly viral isolates present in a resistant cultivar are going through an initial process of genetic variation due to the selective pressure imposed by the use of resistant plants. However, to confirm this hypothesis, further analyses are needed on larger populations of ToSRV and ToMoLCV.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2015. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2016-04-08T18:41:36Z No. of bitstreams: 1 2015_NidayAlineNunesFernandes_Parcial.pdf: 1573452 bytes, checksum: 7a7c55160f08039fb8540e238b5c798b (MD5) / Rejected by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br), reason: A pedido do cliente. on 2016-04-08T18:58:16Z (GMT) / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2016-04-08T19:18:38Z No. of bitstreams: 1 2015_NidayAlineNunesFernandes_Parcial.pdf: 1573452 bytes, checksum: 7a7c55160f08039fb8540e238b5c798b (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-05-09T13:25:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_NidayAlineNunesFernandes_Parcial.pdf: 1573452 bytes, checksum: 7a7c55160f08039fb8540e238b5c798b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-09T13:25:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_NidayAlineNunesFernandes_Parcial.pdf: 1573452 bytes, checksum: 7a7c55160f08039fb8540e238b5c798b (MD5) / O tomateiro (Solanumlycopersicum L., família Solanaceae) é a principal hortaliça produzida no Brasil. Embora cultivado em todos os estados em maior ou menor escala, os principais produtores são Goiás, São Paulo e Minas Gerais. O Brasil é o oitavo maior produtor mundial, com aproximadamente 65 mil hectares cultivados e produção que atinge aproximadamente 4,2 milhões de toneladas. No entanto, um dos principais entraves para o aumento de produção do tomateiro no país têm sido as perdas ocasionadas por um complexo de espécies virais do gênero Begomovirus, transmitidas por um recentemente caracterizado complexo de espécies crípticas da mosca-branca (Bemisiatabaci). O presente trabalho apresenta um panorama da diversidade de espécies de Begomovirus entre os anos de 2001 e 2015 nas diferentes regiões de cultivo do tomateiro após a invasão de populações exóticas de B. tabaci. Amostras foliares exibindo sintomas similares aos induzidos por infecção por begomovírus foram coletadas nas principais áreas produtoras, englobando todas as cinco regiões geográficas do Brasil. Todos os 1.055 isolados caracterizados apresentaram genoma bipartido típicos do Novo Mundo, não havendo um único registro de espécies com genoma monopartido. Embora as duas espécies virais predominantes tenham sido reportadas em todas as regiões, existe uma clara regionalização ecológica, sendo Tomatomottleleafcurlvirus de ocorrência mais frequente em condições de clima mais quente e Tomatosevererugosevirus predominante em condições de clima tropical de altitude e subtropical. Alguns vírus descritos antes da década de 1990 e algumas espécies reportadas causando as primeiras epidemias em tomateiro no Brasil após o ingresso de B. tabaci MEAM 1 no país não foram encontrados em nosso levantamento, sugerindo que determinadas espécies apresentaram ciclos epidêmicos transitórios e que posteriormente perderam importância epidemiológica e muitas estando provavelmente extintas em condições naturais. Como segunda parte do trabalho, o genoma completo do componente DNA-A de quatro novas espécies de begomovírus típicos do Novo Mundo foi descrito: Chino del tomate Amazonas virus (CdTAV), Tomatogoldenleafdistortionvirus (ToGLDV), Tomatogoldenleaf spot virus (ToGLSV)e Tomatobrightyellowmottlevirus (ToBYMoV). Também foram apresentados quatro novos variantes do begomovírus bipartido típico de malváceas Sida yellow net virus (SiYNV) infectando tomateiro, sendo este o primeiro registro formal de S. lycopersicum como hospedeira natural de SiYNV. Além disso, o presente trabalho engloba um levantamento da diversidade molecular de populações de B. tabacie das espécies de Begomovirus associadas com esse inseto vetor em diferentes regiões onde o tomateiro tem sido cultivado no Brasil. A análise das sequências do gene mitocondrial citocromo oxidase 1 (mtCOI) obtidas de ovos e ninfas de 62 populações de mosca-branca coletadas em tomateiros infestados indicou uma alta identidade (entre 99 e 100%) com a sequência consenso para populações da espécie MEAM 1. Outras espécies de B. tabaci nativas já descritas nos Neotrópicos não foram detectadas infestando o tomateiro em todas as regiões geográficas amostradas. Embora a diversidade de B. tabaci infestando o tomateiro tenha se mostrado extremamente reduzida, os dados de sequenciamento do DNA-A dos isolados virais presentes nas plantas infestadas indicaram a associação das diferentes populações do inseto vetor com um complexo de seis espécies de begomovírus previamente descritas. / Tomato (Solanumlycopersicum L., family Solanaceae) is the main vegetable crop produced in Brazil. Although grown in every stateto a greater or lesser extent, the major producers are Goiás, São Paulo and Minas Gerais states. Brazil is the eighth largest world producer, with approximately 65,000 hectares and production that affects approximately 4.2 million tons. However, one of the major obstacle to the increase in tomato production in the country have been the losses caused by a complexof viral species in genus begomovírus, transmitte dby a recently characterized complex of cryptic species of whitefly (Bemisiatabaci). This paper presents an overview of the diversity of begomovirus species between the years 2001 and 2015 in different tomato-producing regions after the invasion of exotic populations of B. tabaci. Leaf samples displaying symptoms similar to those induced by begomovirus infection were collected in the main producing areas, including all five Brazil geographic regions. All 1.016 isolates characterized showed typical New World bipartite genome, and no record of monopartite genome species. Although the two predominant viral species have been reported in all regions, there is a clear ecological regionalization, with Tomato mottle leaf curl virus most frequently occurring in warmer weather conditions and Tomato severerugose virus predominant in highland tropical and subtropical conditions. Some viruses described before the 1990s and some species causing the first reported outbreaks in tomato in Brazil after the entry of B. tabaci MEAM 1 in the country were not found in our survey, suggesting that certain species showed transient epidemic cycles and subsequently lost epidemiological importance and many probably being extinct in natural conditions. As a second part of this work, the complete genome of DNA-A component of four new typical New World begomovirus species were described: Chino del tomate Amazon virus (CdTAV), Tomato golden leaf distortion virus (ToGLDV), Tomato golden leaf spot virus (ToGLSV) and Tomato bright yellow mottle virus (ToBYMoV). We also presented four new variants of the typical malvaceousbegomovirusSida yellow net virus (SiYNV) infecting tomato, which is the first formal record of S. lycopersicum as natural host of SiYNV. Furthermore, this work includes a survey of molecular diversity of B. tabaci populations and of begomovirus species associated with this insect vector in different regions where tomato has been grown in Brazil. Sequence analysis of mitochondrial gene cytochrome oxidase 1 (mtCOI) obtained from eggs and nymphs of 62 whitefly populations collected from tomato plants infested indicated a high identity (between 99 and 100%) to the consensus sequence for MEAM 1 species populations. Other indigenous B. tabaci species already described in Neotropics were detected infesting tomato plants in all geographic regions sampled. While B. tabaci diversity infesting tomato plants has been extremely reduced, the DNA-sequencing data of the viral isolates present in infected plants indicate the association of different insect vector populations with a complex of six species of begomovirus previously described.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2010. / Submitted by Luiza Moreira Camargo (luizaamc@gmail.com) on 2011-07-04T17:47:09Z No. of bitstreams: 1 2010_NidayAllineNunesFernandes.pdf: 4304016 bytes, checksum: 19ab08c8d2743f9b7e0e0637e8bf1295 (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-07-08T00:40:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_NidayAllineNunesFernandes.pdf: 4304016 bytes, checksum: 19ab08c8d2743f9b7e0e0637e8bf1295 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-08T00:40:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_NidayAllineNunesFernandes.pdf: 4304016 bytes, checksum: 19ab08c8d2743f9b7e0e0637e8bf1295 (MD5) / Até o inicio da década de 1990 as begomoviroses apresentavam ocorrência esporádica e sem importância econômica no tomateiro (Solanum lycopersicum L.). No entanto, um complexo de espécies de Begomovirus foi identificado no Brasil após a introdução no país de Bemisia tabaci biótipo B. Um elevado grau de relacionamento genético tem sido observado entre algumas espécies de Begomovirus reportadas em tomateiro e aquelas registradas em plantas invasoras associadas com o cultivo desta hortaliça. Desta forma, existem fortes evidências de transferência natural de segmentos genômicos entre as espécies virais presentes nestas diferentes plantas hospedeiras. O cultivo de tomateiro para consumo in natura no Brasil é conduzido em uma grande amplitude de condições agroclimáticas incluindo a região Amazônica, a Zona da Mata e o Semi-árido nordestino, a região do „Cerrado‟ (no Centro-Oeste) e, principalmente, as condições subtropicais do Sudeste e Sul do país. O objetivo deste trabalho foi prospectar e caracterizar a variabilidade genética das espécies de Begomovirus registradas na cultura do tomateiro para consumo in natura no Brasil (no período entre 2001 e 2010) e em duas plantas daninhas dos gêneros Cleome (presente em regiões de clima quente) e Leonurus (presente em regiões subtropicais). Os isolados foram caracterizados via PCR com primers universais para segmentos conservados do DNA-A e DNA-B e via sequenciamento de um segmento do DNA-A. Estes „primers‟ foram desenhados para anelar com sequencias conservadas presentes na região 5‟-terminal do gene AV1 (CP) e na região 3‟-terminal do gene AC1 (Rep), englobando uma região com 1100 pares de base. Duzentas e cinquenta e duas amostras foliares de tomateiro foram coletadas nas principais áreas produtoras nas cinco regiões do Brasil. Os resultados indicaram que todos os isolados de tomateiro apresentam genoma bipartido, não havendo ainda nenhum registro de espécies de genoma monopartido. Existe uma aparente regionalização das espécies virais, com algumas sendo predominantes em condições de clima mais quente e outras em condições de clima subtropical. As espécies Tomato golden mosaic virus (descrita antes do ingresso do biótipo B no Brasil) e Tomato yellow spot virus não foram detectadas neste levantamento. Sete potenciais novas espécies, ainda não descritas anteriormente, estão emergindo no país, sendo que algumas já apresentam ampla distribuição geográfica enquanto que outras ainda vêm se mantendo de maneira endêmica. Existem algumas estirpes que estão divergindo dos isolados das espécies originais a ponto de representarem potenciais novas espécies. Estirpes de espécies de Begomovirus reportadas inicialmente em outras plantas cultivadas e/ou plantas daninhas estão aparentemente se adaptando e infectando tomateiro. No gênero Cleome foi identificado um complexo de isolados contendo pelo menos três novas espécies filogeneticamente relacionadas com vírus presentes infectando plantas do gênero Sida (Malvaceae) e com a espécie Tomato yellow spot virus (ToYSV). Os isolados de L. sibiricus apresentaram elevada identidade (95,1 a 97,1%) com estirpes de ToYSV (previamente descritas infectando tomateiro e feijoeiro). Desta forma, L. sibiricus é uma hospedeira de isolados de begomovírus que apresentam estreita relação genética com espécies infectando plantas cultivadas no Brasil. De modo geral, os resultados obtidos confirmam a extraordinária variabilidade de Begomovirus de genoma bipartido do Novo Mundo e o complexo cenário que ainda permanece na etiologia das begomoviroses do tomateiro. Este estudo ainda reforça a importância das plantas daninhas e nativas da flora como fontes de material genético viral necessário para a emergência de novas espécies com diferentes características biológicas, ecológicas e moleculares. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / In Brazil, the begomoviruses in tomatoes (Solanum lycopersicum L.) were minor diseases up to the 1990´s. However, an extremely diverse complex of Begomovirus species has arised after the introduction into the country of the whitefly Bemisia tabaci biotype B. The high degree of relationship of some tomato and weed-infecting begomoviruses suggests a natural transfer of genetic material among these viral isolates. In Brazil, fresh-market tomatoes are grown under a wide array of agroclimatic conditions ranging from warm and humid equatorial area in the Amazon River Basin to the semi-arid Northeast region. It is also cultivated in the dry and mild climates of the Brazilian Savannah (“Cerrado”) in Center-West region and mainly in the subtropical mild climates of Southeast and South regions. The main objective of the present work was to evaluate the nation-wide genetic variability of Begomovirus species infecting fresh-market tomatoes during the years 2001 and 2010 and also in two genera of weed plants: Cleome (present in warm regions) and Leonurus (present in subtropical areas). This survey was done via PCR with universal primers targeting conserved regions of both DNA-A and DNA-B components and via sequencing analysis of a PCR amplicon of 1100 base pairs encompassing a region of the DNA-A component between the 5‟-end of the AV1 (CP) gene and the 3‟-end of the AC1 (Rep) gene. Two-hundred-fifty two leaf samples were collected in the main tomato production areas in all Five Brazilian regions. All isolates had bipartite genome with no report of monopartite species. Some viral species formely described in Brazil were not detected in this survey, including Tomato golden mosaic virus (described before the entrace of the biotype B) and Tomato yellow spot virus. There is a geographic distribution of some viral species displayed a regional pattern, with one group of species being prevalent in warm conditions and other group being prevalent in subtropical areas. Seven potential new viral species are emerging in tomatoes, with some of them already showing a wide geographic distribution, whereas others are yet endemic and restricted to some specific areas. A group of strains are diverging from the original viral species and many isolates might represent new species according to the current taxonomic rules. Strains of Begomovirus species originally reported on other cultivated plant species and weeds are also moving into tomatoes. A complex of at least three viral species was characterized in the genus Cleome with species genetically related to Tomato yellow spot virus (ToYSV) and with viruses reported infecting the genus Sida (Malvaceae). Leonurus sibiricus isolates displayed high identity levels (from 95.1 a 97.1%) with ToYSV strains previously reported infecting tomatoes and beans. Therefore, L. sibiricus is an alternative host of viral species closely related to viruses able to infect cultivated crops in Brazil. In general, the results indicated the extraordinary diversity of the bipartite Begomovirus species from the New World area. The scenario of tomato-infecting begomoviruses remains extremely diverse in Brazil, difficulting the precise diagnosis of particular members within this species complex. The present study also reinforces the importance of native flora and weed species as sources of viral genetic material necessary for the intense upsurge of new species with distinct biological, ecological, and molecular properties.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2010. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-09-30T20:53:20Z No. of bitstreams: 1 2010_CristinaSilveiraGravina.pdf: 5188902 bytes, checksum: 56164ddde6e4c0ca1de3b1b1b3f5380e (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-10-14T12:48:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_CristinaSilveiraGravina.pdf: 5188902 bytes, checksum: 56164ddde6e4c0ca1de3b1b1b3f5380e (MD5) / Made available in DSpace on 2011-10-14T12:48:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_CristinaSilveiraGravina.pdf: 5188902 bytes, checksum: 56164ddde6e4c0ca1de3b1b1b3f5380e (MD5) / A irrigação, além de ter efeito sobre a produção e ser fundamental para o equilíbrio e sustentabilidade do cultivo de tomate orgânico, pode auxiliar no controle de insetos-praga. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes sistemas de irrigação e níveis de água no solo na ocorrência de Tuta absoluta e de Spodoptera eridania e na produção de tomate de mesa, híbrido Duradouro, cultivado em sistema orgânico. O experimento foi conduzido na área de agricultura orgânica da Embrapa Hortaliças, Brasília-DF, no período de maio a outubro de 2009. O delineamento experimental foi blocos ao acaso, com três repetições e tratamentos dispostos em arranjo fatorial 5 x 2. Foram avaliadas cinco configurações de sistemas de irrigação (gotejamento com uma linha lateral por fileira de plantas GO1L;gotejamento com duas linhas laterais por fileira de planta GO2L; gotejamento com uma linha lateral com cobertura do solo com plástico preto – GOM; micro aspersão abaixo do dossel com uma linha lateral entre fileiras de plantas MIC; aspersão convencional fixa acima do dossel– ASP) e dois níveis de água no solo (tensão de 15-30 kPa umidade elevada; tensão de 30-60 kPa umidade moderada). Foram avaliados a flutuação populacional de Tuta absoluta(adultos, ovos e lagartas) e os seus danos, os danos nos frutos causados por Spodopteraeridania, a produtividade e a classificação de frutos, quanto ao tamanho e defeitos, e o índice de produtividade da água. Verificou-se que os tratamentos irrigados por gotejamento apresentaram maior quantidade de adultos, ovos e lagartas de Tuta absoluta, assim como maior porcentagem de danos nas folhas e nos frutos. O GOM apresentou maior porcentagem de frutos danificados por Spodoptera eridania. O MIC e o GOM proporcionaram maior produtividade total, sendo que o GOM apresentou menor número de frutos comercializáveis e o MIC apresentou maior massa média de frutos comercializáveis. O MIC e o GO2L proporcionaram a maior produtividade de frutos comercializáveis. O nível elevado de água no solo apresentou maior produtividade total e de frutos comercializáveis, maior massa média de frutos comercializáveis e frutos totais/m2. Com relação ao tamanho dos frutos, o GOM apresentou o maior percentual de frutos grandes e o GO1L apresentou o maior percentual de frutos pequenos e miúdos. O nível moderado apresentou maior percentual de frutos miúdos e pequenos e o nível elevado apresentou maior percentual de frutos médios e pequenos. Os sistemas GOM e o GO1L apresentaram os maiores índices de produtividade da água. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Irrigation is crucial to keep the balance and sustainability in organic tomato cropping systems. In addition to that, irrigation improves yield and could contribute to pest control. The aim of this research was to evaluate the effect of irrigation systems and water levels in the incidence of pests and in hybrid Duradouro’s yield. The experiment was carried out at EmbrapaVegetable organic field, in Brasilia – DF, from May to October 2009. The experimental design was a complete randomized blocks with three replicates and treatments displayed in a factorial 5 x 2. Five combination of irrigation systems were accomplished: one drip line per plant row – GO1L; two drip lines – GO2L; one drip line with black plastic mulch – GOM; micro spray under canopy with one line between plant rows – MIC; and solid-set sprinkler above canopy – ASP) and two levels of water in the soil (tension of 15-30 kPa – high humidity; and tension of 30-60 kPa – moderate humidity). Fluctuation of Tuta absoluta (adults, eggs and larvae) and leaf and fruit damages, fruit damages caused by Spodoptera eridania, fruits’sorting by size and defects, yield and water yield index were also evaluated. It was observedthat the drip irrigated treatments showed the highest number of adults, eggs and larvae of Tutaabsoluta as well the highest percentage of insect damages on leaves and fruits. The GOM had the highest percentage of fruits damaged by Spodoptera eridania. Both MIC and GOM treatments showed the highest total yield, however GOM showed the lowest rate of commercial fruits while MIC showed the highest mass fresh weight of commercial fruits.MIC and GO2L provided the highest commercial fruits yield. High humidity showed the highest total yield, commercial fruits yield, mass fresh weight of commercial fruits and total fruits per square meter. GOM had the highest percentage of large fruits and GO1L had the highest percentage of small and very small fruits. Moderate humidity had the high est percentage of small and very small fruits and high humidity had the highest percentage of large and medium fruits. The GOM e o GO1L systems presented the highest water yield index.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Humanas, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-10-30T11:12:44Z No. of bitstreams: 1 2012_DanielAnacletodaCostaLage.pdf: 2068890 bytes, checksum: b5b726a1819c6a700f71e0a68091048d (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-10-30T11:54:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_DanielAnacletodaCostaLage.pdf: 2068890 bytes, checksum: b5b726a1819c6a700f71e0a68091048d (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-30T11:54:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_DanielAnacletodaCostaLage.pdf: 2068890 bytes, checksum: b5b726a1819c6a700f71e0a68091048d (MD5) / O atual entendimento da epidemiologia da requeima (Phytophthora infestans) e do oídio (Leveillula taurica) em tomateiro (Solanum lycopersicum) é fortemente baseado em estudos conduzidos em regiões temperadas, havendo a necessidade de mais estudos em condições climáticas subótimas e em cultivo orgânico. O inverno na região dos Cerrados brasileiro é caracterizado por um clima seco e elevada amplitude térmica. Essa condição é desfavorável ao desenvolvimento da grande maioria das doenças fúngicas e bacterianas do tomateiro. Um eficiente manejo da água de irrigação neste período pode permitir a obtenção de elevadas produtividades e menores problemas fitossanitários, o que se torna uma excelente oportunidade para o desenvolvimento da agricultura orgânica. O objetivo deste trabalho foi avaliar epidemias de oídio e de requeima em tomateiro orgânico sob diferentes sistemas e estratégias de irrigação em condições de ambiente seco. A avaliação da severidade de doenças com emprego de escalas diagramáticas proporciona facilidade, simplicidade e maior dinâmica de trabalho, assegurando medições com boa precisão, acurácia e reprodutibilidade, sem a necessidade de amostragens destrutivas. A escala diagramática proposta por James em 1971 para requeima é muito utilizada, mas não existe nenhuma escala disponível para oídio do tomateiro. Duas escalas foram desenvolvidas para avaliação da severidade do oídio, separadamente para folhas e folíolos de tomateiro. As escalas foram construídas a partir de coletas de folhas com diversos níveis de severidade e, com base nos limites máximos e mínimos observados em campo, foram propostos seis níveis de severidade: 1%, 5%, 10%, 20%, 40% e 60%. A validação das escalas foi realizada com auxílio de 16 avaliadores que as utilizaram para avaliação de folhas e folíolos com diferentes níveis de severidade da doença. O emprego das escalas diagramáticas proporcionou o aumento da acurácia e da precisão da maioria dos avaliadores e permitiu a reprodutibilidade das estimativas de severidade de oídio tanto para folíolos quanto para folhas de tomateiro. As escalas foram utilizadas no estudo do progresso temporal do oídio em diferentes sistemas e estratégias de irrigação nos anos de 2009, 2010 e 2011. Estes foram instalados em área de cultivo orgânico da Embrapa Hortaliças (Brasília, DF), em blocos ao acaso com doze tratamentos, três repetições e cem plantas por parcela. Em 2009 e 2010, foram avaliados os seguintes sistemas: gotejamento com uma linha lateral (GO1L) ou duas linhas laterais (GO2L) por fileira de plantas; gotejamento com uma linha lateral com “mulch” plástico (GOM) ou “mulch” orgânico de palhada de milho (GOP); sulco (SU); microaspersão subcopa (MI); e aspersão convencional acima do dossel (AS). Para o manejo da irrigação foram adotadas duas estratégias, com base na tensão de água do solo, designadas como umidade elevada (tensão matricial de 15-30 kPa) e moderada (tensão matricial de 30-60 kPa). Os sistemas SU e GOP foram manejados apenas com umidade moderada. No ano de 2011, os sistemas GO1L, GO2L, GOM, manejados com umidade moderada, e GOP foram substituídos pelos sistemas: microaspersão acima do dossel (MA) e dois sistemas combinados de gotejamento com microaspersão acima do dossel, sendo um irrigado por alternância de sistemas (GMA) e o outro em que a microaspersão visou apenas o controle de oídio (GMC). A avaliação da severidade do oídio foi realizada semanalmente, sendo obtidas as seguintes variáveis epidemiológicas: severidade da doença na metade do curso da epidemia (Y50), severidade máxima (Ymáx), área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) e taxa de progresso da doença (r) com base no modelo Gompertz. Constatou-se que o controle do oídio foi promovido pelos sistemas que molharam completamente a parte aérea do tomateiro, independentemente do tamanho das gotas geradas por cada sistema. A dinâmica temporal da requeima foi estudada com emprego da escala diagramática de James (1971) nos anos de 2009 e 2011, nos seguintes sistemas: GO1L; GO2L; GOM; SU; MI; e AS. A severidade da doença foi avaliada semanalmente e o modelo de progresso temporal do tipo Gompertz foi ajustado aos dados observados sendo comparadas as variáveis Y50, Ymáx, AACPD e r. Não ocorreram epidemias de requeima no ano de 2010. Com base nos dados de 2009 e 2011, verificou-se que a irrigação por aspersão promoveu maior desenvolvimento de epidemias de requeima, mesmo em ambiente seco em comparação com os sistemas GO/SU. As irrigações por gotejamento e por sulco desfavoreceram a doença consistentemente em ambos os anos. Os tratamentos irrigados no sistema MI apresentaram intensidades intermediárias de requeima entre AS e GO/SU. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The present understanding of the epidemiology of tomato (Solanum lycopersicum) late blight (LB – Phytophthora infestans) and powdery mildew (PM – Leveillula taurica) is strongly based on studies conducted in temperate climates, while epidemics on suboptimal environmental conditions (for the disease) and organic cropping have been scarcely studied. Winter in the Brazilian Cerrado is characterized by dry weather and wide daily thermal ranges. These conditions are unfavorable to the establishment of most fungal and bacterial diseases of the tomato crop, and therefore, combined with an efficient irrigation water management, leads to high fruit yields and reduced phytosanitary problems. These conditions are marked as excellent to organic cropping. The objective of this work was to evaluate field epidemics of powdery mildew and late blight in organic tomato in different systems and strategies of irrigation, in dry weather. Disease severity evaluations by means of diagrammatic scales increase precision, accuracy and reproducibility, while avoiding destructive sampling. One such scale is already available for LB (James, 1971) and is widely used, but no such scale is available for tomato PM caused by Leveillula taurica. Two separate scales were developed for assessing PM severity in tomato leaves and leaflets. From a wide field collection of PM affected leaves, and based on the minimum and maximum severity levels observed, six severity levels are proposed, independently for the leaf and leaflet: 1%, 5%, 10%, 20%, 40% e 60%. Validation was done by 16 subjects, who rated sets of leaves and leaflets with varying PM severity levels. Employment of the scales resulted in enhancement of accuracy and precision of most raters, and also allowed for better reproducibility of the estimates both for detailed (leaflet) and broad (complete leaf) levels. The scales were then employed to study temporal progress of PM in tomato under different irrigation systems and water levels for three consecutive years from 2009 to 2011. Experiments were carried out in the organic cropping area of Embrapa Hortaliças (Brasília, DF), in randomized complete blocks with 12 treatments, three replicates and 100 plants per plot. In 2009 and 2010 the following irrigation systems were studied: drip irrigation, with one lateral plastic tape line (GO1L) or two tape lines (GO2L) per line of plants; drip irrigation, with one lateral tape line and plastic (GOM) or straw (GOP) mulch; furrow irrigation (SU); small droplet, microsprinkler irrigation, below plant canopy (MI); and conventional (above plant canopy) overhead irrigation (AS). Two irrigation strategies were combined with most systems named above, based on the soil water tensions: high soil moisture, irrigated at soil matric tensions of 15-30 kPa, and moderate soil moisture, irrigated at 30-60 kPa. Two systems (SU and GOP) were managed in moderate soil moisture only. In 2011, systems GO1L, GO2L, GOM, managed at the moderate level, and GOP, were replaced by the following systems: microsprinkler above plant canopy (MA) and two systems combining drip and microsprinkler irrigation above plant canopy, one alternating every other system for irrigation (GMA) and the other in which the microsprinkler was aimed only at PM control (GMC). Powdery mildew severity was estimated weekly, and the following epidemiological variables were obtained: disease severity at half of the epidemic course (Y50), maximum disease severity (Ymax), area under disease progress curve (AUDPC) and disease progress rate (r) based on the Gompertz model. Results showed that best PM control was promoted by irrigation systems that wetted aerial plant parts most completely, irrespective of the water droplet size. The study of the temporal dynamics of tomato LB was done with the aid of James (1971) scale in 2009 and 2011, in the following systems: GO1L; GO2L; GOM; SU; MI; and AS. Late blight severity was assessed weekly, the Gompertz model was fit to the disease data and the following variables were compared: Y50, Ymax, AACPD and r. No LB epidemics were observed in 2010. Conventional overhead irrigation promoted the development of severe epidemics, even in dry weather in comparison with GO and SU systems. Drip and furrow irrigations had the lowest values of all epidemiological variables consistently in both years. Plots irrigated by the MI system displayed intermediate LB levels, between AS and GO/SU.