SILVA, Eduardo Augusto Torres da. Estudo comparativo de parâmetros elétricos na absorção de substratos Na+/H+-dependentes em epitélio jejunal e ileal de coelho em câmaras de ussing. 2002. 183 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2002. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-06-08T12:21:48Z No. of bitstreams: 1 2002_tese_eatsilva.pdf: 1397975 bytes, checksum: 88b2f878e9fc8b0a4c3e133e69d60a35 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-06-11T15:30:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2002_tese_eatsilva.pdf: 1397975 bytes, checksum: 88b2f878e9fc8b0a4c3e133e69d60a35 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-11T15:30:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2002_tese_eatsilva.pdf: 1397975 bytes, checksum: 88b2f878e9fc8b0a4c3e133e69d60a35 (MD5) Previous issue date: 2002 / Cholera is a disease that became endemic in Brazil Northeastern after the pandemic initiated in Peru in 1991. Choleratoxin causes a potent intestinal secretion effect, resulting in significant loss of hydro-electrolyte balance and hypovolemic lock in patients with cholera. We postulate that the administration of substrates, such as amino acids and di-peptide-based glutamine, may increase intestinal sodium and water absorption, resulting in partial decrease of hydro-electrolyte loss in this disease. The aim of this work is to study the phar-macodinamic of Na+ and/or H+-dependent substrates in the rabbit normal small bowel and in the pre-treated with choleratoxin. The administration of substrates with sodium-dependent absorption could, partially, counterbalance the water and electrolyte losses. Others substrates such as di- and tri-peptides presenting mechanisms of proton-dependent absorption also reveal similar properties. The above facts encouraged the development of this comparative study about the ef-fect of cholera toxin on jejunum and ileum absorptive functions. The proximal jejunum and distal ileum loops were isolated in vivo and injected with 5 ml of cholera toxin (1 mg/ml) in saline (experimental group) or equal volume of saline alone (control group). After 1 hour of toxin incubation, the jejunum and ileum loops were excised, freed of their serosa membrane and opened. The fragments were mounted in perfusion chambers with temperature and oxygen control. The mucosal side was perfused with glucose-free physiological solution (substituted by manitol) and the serosas side by physiological solution with glucose. After stabilization, substrates from 1x10-5 to 1.7x10-3 M were cumulatively added. The electric parameters of short circuit current (icc), transepitelial potential difference (VTE) and transepitelial resistance (RTE) were measured in Ussing chambers be-fore and during the period of substrate addition. It was observed that: 1) the presence of cholera toxin increased significantly those parameters, except for RTE, in ileum fragments; 2) the addition of substrates presenting sodium-dependent absorption onto cholera toxin pre-incubated fragments always provoked an increase of RTE larger than that observed with control fragments. The same oc-curred with VTE, except for reduction of icc; and 3) the di-peptide alanyl-glutamine did not alter the RTE but increased significantly the icc both in normal and pre-incubated preparations. These results indicate a probable link between the transport mechanisms of Na+-dependent substrates and the regulatory mechanisms of the paracellular resistance, phenomena not observed in H+-dependent substrate absorption. / A cólera é uma doença que se tornou endêmica no Nordeste do Brasil após a pandemia iniciada no Peru em 1991. A toxina do Vibrio cholerae (TC) causa potente ação secretória no intestino delgado, podendo levar a desequilíbrio hidro-eletrolítico e choque hipovolêmico nos pacientes com cólera. Postulamos que a administração de substratos, tais como aminoácidos e di-peptídeos à base de glutamina, possa aumentar a absorção de sódio e água no intestino, reduzindo parcialmente as perdas hidro-eletrolíticas na doença. Este trabalho tem como objetivo estudar a farmacodinâmica da absorção de substratos Na+ e/ou H+-dependentes no intestino delgado de coelho normal e naquele pré-tratado com a TC. A administração de substratos com mecanismos de absorção Na+-dependentes pode contrabalançar parcialmente as perdas hídricas e eletrolíticas. Outros substratos, tais como os di- e tri-peptídeos, que apresen-tam mecanismos de absorção próton-dependentes, também possuem propriedades se-melhantes. Estas reflexões nos levaram a estudar os efeitos da toxina de cólera sobre os parâmetros elétricos de dois segmentos intestinais (jejuno e íleo). Alças de jejuno proximal e de íleo distal foram isoladas in vivo e injetadas com 5 ml de toxina de cóle-ra (1 mg/ml) em solução fisiológica (grupo experimental) ou igual volume de solução fisiológica (grupo controle). Após 1 hora de incubação com a toxina, as alças foram retiradas, dissecadas da membrana serosa e abertas. Os fragmentos planos foram mon-tados em câmaras de perfusão com temperatura e oxigenação controladas. O lado mu-coso foi perfundido por solução sem glicose (substituída por manitol), enquanto que o lado seroso por solução glicosada. Após estabilização, foram adicionados cumulativa-mente substratos em concentrações que variam de 1x10-5 a 1,7x10-3 M. Os parâmetros elétricos corrente de curto-circuito (icc), diferença de potencial transepitelial (VTE) e resistência transepitelial (RTE) foram medidos em câmaras de Ussing, antes e durante o período de adição de substratos. Foi observado que: 1) a toxina de cólera aumentou significativamente estes parâmetros, com exceção da RTE, nos fragmentos de íleo; 2) a adição de substratos de absorção Na+-dependentes nos fragmentos pré-incubados com toxina de cólera sempre provocou um aumento da RTE significativamente maior do que aquele observado nos fragmentos controle, o mesmo ocorrendo com relação à VTE, mas com redução da icc; e 3) o di-peptídeo alanil-glutamina não causou alteração na RTE, mas aumentou significativamente a icc tanto nas preparações normais como nas pré-incubadas. Esses resultados indicam uma possível ligação entre os mecanismos de transporte de substratos Na+-dependentes e os mecanismos reguladores da resistência paracelular, fenômeno não observado na absorção do substrato H+-dependente.

RIBEIRO, Carla Vivianne Pereira Estevães. Estrutura e atividade antidiarreica de polissacarídeos da alga marinha vermelha Bryothamnion triquetrum S. G. Gmelin. 2016. 78 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-06-29T20:17:34Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_cvperibeiro.pdf: 1722711 bytes, checksum: 91744278333fd0e6474111e23b15b7cc (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-06-29T20:17:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_cvperibeiro.pdf: 1722711 bytes, checksum: 91744278333fd0e6474111e23b15b7cc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-29T20:17:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_cvperibeiro.pdf: 1722711 bytes, checksum: 91744278333fd0e6474111e23b15b7cc (MD5) Previous issue date: 2016 / Marine algae (seaweeds) are source of several molecules with biological activities, such as sulfated polysaccharides which have aroused a great interest in biomedical sciences. The aim of this study was to characterize chemically and structurally the total sulfated polysaccharides (TSP) from the red seaweed Bryothamnion triquetrum and to evaluate its antidiarrheal potential. The TSP were obtained through enzymatic extraction with papain, its molecular mass and sulfate and carbon content were determined by gel permeation chromatography and elemental microanalysis, respectively. Acute diarrhea in mice was induced by Castor oil and the antidiarrheal effects of the TSP were evaluated through the total amount of stool and diarrheal stools, intestinal fluid secretion (enteropooling) and intestinal motility using charcoal meal. The effects of the TSP on secretory diarrhea induced by cholera toxin were analyzed by fluid secretion and absorption in intestinal closed loops and through interactions with the ganglioside GM1, utilizing ELISA method. The TSP yield from dry seaweed was 7.2% and its molecular mass estimated at 61.41 kDa. Structural analyses have shown that this compound consisted of an agar-type galactan, containing mainly 3,6-anhydro-L- galactose and β-D-galactose-6-O-methyl. Sulfate groups are present in small amounts, in the form of α-L-galactose-6-sulfate, with sulfation degree of 0.28%, corresponding to 2.1% of the atoms present in TSP. Doses of 1, 3, 10 and 30 mg/Kg of TSP (v.o.) were tested against acute diarrhea and the dose of 10 mg/Kg has shown the best results, reducing the total amount of stool and diarrheal stools in 90.24% and 93.98%, respectively. Hence, it was used as the standard dose for subsequent experiments. Enteropooling and intestinal motility were decreased by TSP in 54.26% and 45.35%, respectively. In secretory diarrhea, TSP have inhibited intestinal fluid secretion in 20.00% reversing the secretory state induced by the cholera toxin, however, it had no effect on the intestinal absorption. The results also showed that TSP were interacting with GM1 receptors and/or cholera toxin, blocking toxin binding to its receptor and preventing the onset of the disease. These results confirm the potential use of the TSP obtained from the red seaweed B. triquetrum as an antidiarrheal compound. / As algas marinhas são fontes de diversas moléculas com atividades biológicas, tais como os polissacarídeos sulfatados, os quais têm despertado grande interesse nas ciências biomédicas. O objetivo deste estudo foi caracterizar química e estruturalmente os polissacarídeo sulfatados totais (PST) da macroalga marinha vermelha Bryothamnion triquetrum e avaliar seu potencial antidiarreico. Os PST foram obtidos através de extração enzimática com papaína, tendo sua massa molecular e teor de sulfato e carbono determinados por cromatografia de permeação em gel e microanálise elementar, respectivamente. A diarreia aguda em camundongos foi induzida por óleo de rícino e os efeitos antidiarreicos dos PST foram avaliadas através da quantidade total de fezes e fezes diarréicas, da secreção de fluido intestinal (enteropooling) e da motilidade intestinal utilizando carvão ativado. Os efeitos dos PST na diarreia secretora induzida pela toxina da cólera foram analisados por secreção e absorção do fluido intestinal em alças intestinais isoladas e por meio de interações com o gangliosídeo GM1 utilizando o método de ELISA. O rendimento dos PST a partir da biomassa de alga seca foi de 7,2% com massa molecular estimada em 61,41 kDa. As análises estruturais mostraram que este composto é uma galactana tipo ágar, contendo principalmente unidades de 3,6-anidro-α-L-galactose e β-D-galactose-6-O-metil. Grupamentos sulfato estão presentes em baixas quantidades, na forma de α-L-galactose-6-sulfato, com grau de sulfatação de 0,28%, correspondendo a 2,1% dos átomos presentes nos PST. Doses de 1, 3, 10 e 30 mg/Kg de PST (v.o.) foram testadas contra a diarreia aguda e a dose de 10 mg/Kg exibiu os melhores resultados, reduzindo as fezes totais e as fezes diarreicas em 90,24% e 93,98%, respectivamente. Portanto, esta dose foi utilizada como dose padrão em experimentos subsequentes. O enteropooling e a motilidade intestinal foram reduzidos pelos PST em 54,26% e 45,35%, respectivamente. Na diarreia secretora, os PST inibiram a secreção de fluido intestinal em 20,00%, revertendo o estado secretor induzido pela toxina da cólera, mas não teve qualquer efeito na absorção intestinal. Os resultados mostraram ainda que os PST estavam interagindo com os receptores GM1 e/ou com a toxina da cólera, bloqueando a ligação da toxina com o seu receptor e prevenindo o desencadeamento da doença. Estes resultados confirmam o potencial uso dos PST da alga B. triquetrum como um composto antidiarreico.

Este projeto teve como objetivo geral continuar a avaliar a adequação de anfifílicos que se agregam em solução aquosa formando bicamadas, para recobrir superfícies de sílica. Em paralelo, foi objetivada a reconstituição do reconhecimento receptor-ligante, tendo como modelo o monosialogangliosídio GM1 e a enterotoxina do vibrião da cólera. Os resultados obtidos poderão se mostrar de grande valor em aplicações práticas que envolvem a construção de sistemas de detecção e quantificação de substâncias ou moléculas específicas. A adsorção e estabilidade de bicamadas contendo fosfatidilcolina (PC) ou misturas de brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) e dipalmitoilfosfatidilcolna (DPPC) sobre a superfície de nanopartículas de sílica foi estudada através de isotermas de adsorção por dosagem do fosfato inorgânico, análises de sedimentação por imagens fotográficas e medidas dos diâmetros médios (Dz) e potenciais-zeta (ζ) de partículas por espectroscopia de correlação de fótons. Foram avaliadas as afinidades entre as bicamadas e a superfície das nanopartículas e a estabilidade do sistema em função da força iônica, do pH e da concentração adicionada de lipídio. A afinidade das bicamadas pela superfície da sílica apresentou uma correlação com as forças de van der Waals e as pontes de hidrogênio que se formam entre os grupos químicos do anfifílico e aqueles de superfície da sílica. A formação de uma única bicamada lipídica de PC sobre a sílica foi detectada, o que levou à estabilidade coloidal do sistema particulado. As bicamadas mistas de DPPC/DODAB por sua vez apresentaram uma afinidade decrescente pela sílica com a elevação da porcentagem de DODAB na bicamada. Os dados de isoterma e de ζ das partículas sugerem uma separação física entre o DPPC e o DODAB. O conjunto otimizado partícula de sílica/bicamada de PC (partícula biomimética) foi assim utilizado para promover a incorporação do GM1 micelar nas bicamadas, medida por fluorescência com a utilização da sonda GM1 pireno, seguida do reconhecimento e ligação da toxina da cólera (CT) ao complexo formado. A transferência do GM1 das micelas para as partículas se mostrou dependente da disponibilidade de bicamadas adsorvidas nestas e da ausência de bicamadas não-adsorvidas, livres em dispersão. Para avaliar a ligação da toxina da cólera às partículas biomiméticas foram calculadas isotermas de adsorção a partir da dosagem de proteína não ligada que resta no sobrenadante. A ligação específica da CT na presença de bicamadas de PC e GM1 foi de 67% em massa do total da proteína adicionada, revelando uma ligação positiva entre receptor e ligante. A estequiometria revela que a proporção molar PC: GM1: CT é de 300: 5: 1 respectivamente. A proporção de 1 CT: 5 GM1 está de acordo com a literatura onde experimentos de difração de raios-X mostram a estrutura tridimensional do pentâmero CTB5 ligado a cinco unidades de pentasacarídeo do GM1. / The general objective of this project was to continue evaluating the suitability of amphiphiles that aggregate in aqueous solution forming bilayers, to cover surfaces of silica. A secondary objective pursued was to promote the reconstitution of the receptor-ligand function, having as a model the monosialoganglioside GM1 and the enterotoxin of the choleric vibrio. The results may prove to be valuable in pure research or practical applications for sensing and detection of biomolecules. The adsorption and stability of phosphatidylcholine (PC) bilayers or mixtures of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) over surfaces of silica nanoparticles were evaluated through adsorption isotherms by inorganic phosphate dosage, sedimentation analysis by means of photographic images and measurements of hydrodynamic diameter (Dz) and zeta-potentials (ζ) of particles by photon correlation spectroscopy. The affinity between the bilayers and the nanoparticles surfaces and the general system stability were evaluated as a function of ionic strength, pH and added lipid concentration. The affinity showed a correlation with the van der Waals and the hydrogen bridges forces that form between the chemical groups of the amphiphile and the silica surface. The formation of a single lipid PC bilayer over the silica was detected, leading to the colloidal stability of the particulate system. Mixed bilayers of DPPC/DODAB on the other hand showed a decreasing affinity for silica with an increasing DODAB percentage in the bilayer. Data from isotherms and ζ of particles suggests a physical separation of the DPPC and DODAB. The optimized array of silica particle/PC bilayer (biomimetic particles) was thus used to promote the incorporation of micellar GM1 into the bilayers, measured by fluorescence with a GM1 pirene probe, followed by the cholera toxin (CT) binding to the resulting array. GM1 transfer from micelles to particles showed dependence on the adsorbed bilayers availability and on the absence of non-adsorbed bilayers, free in the bulk solution. To evaluate CT binding to biomimetic particles adsorption isotherms were calculated from the dosage of unbound protein remaining in the supernatant. Specific binding of CT in the presence of PC and GM1 bilayer was 67% mass of total protein added, indicating a positive binding between receptor and ligand. Stoichiometry revealed that the molar proportion PC: GM1: CT is 300: 5: 1 respectively. The proportion of 1 CT: 5 GM1 is in good agreement with data in the literature where X-ray diffraction tests show the 3-dimensional structure of the CTB5 pentamer bound to five units of the pentasaccharide GM1.

Este projeto teve como objetivo geral continuar a avaliar a adequação de anfifílicos que se agregam em solução aquosa formando bicamadas, para recobrir superfícies de sílica. Em paralelo, foi objetivada a reconstituição do reconhecimento receptor-ligante, tendo como modelo o monosialogangliosídio GM1 e a enterotoxina do vibrião da cólera. Os resultados obtidos poderão se mostrar de grande valor em aplicações práticas que envolvem a construção de sistemas de detecção e quantificação de substâncias ou moléculas específicas. A adsorção e estabilidade de bicamadas contendo fosfatidilcolina (PC) ou misturas de brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) e dipalmitoilfosfatidilcolna (DPPC) sobre a superfície de nanopartículas de sílica foi estudada através de isotermas de adsorção por dosagem do fosfato inorgânico, análises de sedimentação por imagens fotográficas e medidas dos diâmetros médios (Dz) e potenciais-zeta (ζ) de partículas por espectroscopia de correlação de fótons. Foram avaliadas as afinidades entre as bicamadas e a superfície das nanopartículas e a estabilidade do sistema em função da força iônica, do pH e da concentração adicionada de lipídio. A afinidade das bicamadas pela superfície da sílica apresentou uma correlação com as forças de van der Waals e as pontes de hidrogênio que se formam entre os grupos químicos do anfifílico e aqueles de superfície da sílica. A formação de uma única bicamada lipídica de PC sobre a sílica foi detectada, o que levou à estabilidade coloidal do sistema particulado. As bicamadas mistas de DPPC/DODAB por sua vez apresentaram uma afinidade decrescente pela sílica com a elevação da porcentagem de DODAB na bicamada. Os dados de isoterma e de ζ das partículas sugerem uma separação física entre o DPPC e o DODAB. O conjunto otimizado partícula de sílica/bicamada de PC (partícula biomimética) foi assim utilizado para promover a incorporação do GM1 micelar nas bicamadas, medida por fluorescência com a utilização da sonda GM1 pireno, seguida do reconhecimento e ligação da toxina da cólera (CT) ao complexo formado. A transferência do GM1 das micelas para as partículas se mostrou dependente da disponibilidade de bicamadas adsorvidas nestas e da ausência de bicamadas não-adsorvidas, livres em dispersão. Para avaliar a ligação da toxina da cólera às partículas biomiméticas foram calculadas isotermas de adsorção a partir da dosagem de proteína não ligada que resta no sobrenadante. A ligação específica da CT na presença de bicamadas de PC e GM1 foi de 67% em massa do total da proteína adicionada, revelando uma ligação positiva entre receptor e ligante. A estequiometria revela que a proporção molar PC: GM1: CT é de 300: 5: 1 respectivamente. A proporção de 1 CT: 5 GM1 está de acordo com a literatura onde experimentos de difração de raios-X mostram a estrutura tridimensional do pentâmero CTB5 ligado a cinco unidades de pentasacarídeo do GM1. / The general objective of this project was to continue evaluating the suitability of amphiphiles that aggregate in aqueous solution forming bilayers, to cover surfaces of silica. A secondary objective pursued was to promote the reconstitution of the receptor-ligand function, having as a model the monosialoganglioside GM1 and the enterotoxin of the choleric vibrio. The results may prove to be valuable in pure research or practical applications for sensing and detection of biomolecules. The adsorption and stability of phosphatidylcholine (PC) bilayers or mixtures of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) over surfaces of silica nanoparticles were evaluated through adsorption isotherms by inorganic phosphate dosage, sedimentation analysis by means of photographic images and measurements of hydrodynamic diameter (Dz) and zeta-potentials (ζ) of particles by photon correlation spectroscopy. The affinity between the bilayers and the nanoparticles surfaces and the general system stability were evaluated as a function of ionic strength, pH and added lipid concentration. The affinity showed a correlation with the van der Waals and the hydrogen bridges forces that form between the chemical groups of the amphiphile and the silica surface. The formation of a single lipid PC bilayer over the silica was detected, leading to the colloidal stability of the particulate system. Mixed bilayers of DPPC/DODAB on the other hand showed a decreasing affinity for silica with an increasing DODAB percentage in the bilayer. Data from isotherms and ζ of particles suggests a physical separation of the DPPC and DODAB. The optimized array of silica particle/PC bilayer (biomimetic particles) was thus used to promote the incorporation of micellar GM1 into the bilayers, measured by fluorescence with a GM1 pirene probe, followed by the cholera toxin (CT) binding to the resulting array. GM1 transfer from micelles to particles showed dependence on the adsorbed bilayers availability and on the absence of non-adsorbed bilayers, free in the bulk solution. To evaluate CT binding to biomimetic particles adsorption isotherms were calculated from the dosage of unbound protein remaining in the supernatant. Specific binding of CT in the presence of PC and GM1 bilayer was 67% mass of total protein added, indicating a positive binding between receptor and ligand. Stoichiometry revealed that the molar proportion PC: GM1: CT is 300: 5: 1 respectively. The proportion of 1 CT: 5 GM1 is in good agreement with data in the literature where X-ray diffraction tests show the 3-dimensional structure of the CTB5 pentamer bound to five units of the pentasaccharide GM1.