O desenvolvimento de vacinas multivalente constitui urna das prioridades na pesquisa de vacinas modernas. A utilização de vetores vivos para apresentação de antígenos heterólogos mostra-se bastante atraente, e eliminaria a necessidade de várias doses para se alcançar uma proteção máxima. Este tipo de vacina poderia ser administrado em dose única, o que poderia aumentar a cobertura vacinal. Neste trabalho foi explorado o potencial do Mycobacterium bovis BCG recombinante (rBCG) vivo expressando antígenos de Bordetella pertussis, como futuro componente de urna vacina tetravalente rBCG-DTP contra a tuberculose, tétano, difteria e pertussis. Os antígenos de pertussis utilizados foram a subunidade S1 mutada e atóxica da Toxina Pertussis (SI-P1) e o fragmento CRD, um domínio imunogênico da proteína FHA (Adesina Hemaglutinina Filamentosa). PT é o principal fator de virulência de B. pertussis e tanto sozinho como combinado com outros antígenos é o principal componente de todas as vacinas acelulares desenvolvidas até o momento. FHA é um importante fator de aderência da bactéria às células ciliada alvo do hospedeiro, sendo o CRD (domínio de reconhecimento a carboidrato) o responsável pelo reconhecimento de carboidratos em receptores de células do hospedeiro. Os genes detses antígenos foram clonados em vetores de expressão micobacterianos e expressos em BCG sob o controle do promotor mutado da β-lactamase de Mycobacterium fortuitum, pBlaF*, em fusão com o peptídeo sinal da β-lactamase. Estes vetores possuem como marcador de seleção um gene de resistência a kanamicina. Camundongos foram imunizados com rBCG expressando S1-PT e os respectivos esplenócitos mostraram elevada produção de IFN-γ e baixa produção de IL-4, caracterizando uma forte resposta celular Th1 antígeno-específica dominante. rBCG-S1PT induziu uma baixa resposta humoral contra PT. Camundongos imunizados com rBCG-S1PT mostraram elevado nível de proteção contra um desafio intracerebral com uma cepa virulenta de B. pertussis. Animais imunizados com rBCG expressando CRD revelaram a presença de anticorpos anti-FHA no soro. Ensaios com camundongos imunizados com a combinação destas duas vacinas estão sendo realizados. Uma nova abordagem para obtenção de rBCG sem o uso de genes de resistência a antibióticos como marcador de seleção, foi investigada, utilizando a complementação em BCG auxotrófico. Uma cepa de rBCG auxotrófico para lisina foi transformada com vetores de expressão contendo o gene de complementação para lisina e os antígenos de pertussis sob controle do mesmo promotor: a seleção dos recombinantes é realizada em meio sem lisina. Estas construções permitiram a expressão estável dos antígenos e serão avaliadas quanto a indução de uma resposta imunológica efetiva contra pertussis. / The development of combined vaccines constitutes one of the priorities in modem vaccine research. The use of live vectors for heterologous antigen presentation is desirable, as it could eliminate the necessity of several doses to reach a maximum protection and increase vaccine coverage. In this work, the potential of recombinant Mycobacterium bovis BCG (Bacillus Calmette and Guerin) (rBCG), expressing Bordetella pertussis antigens was investigated. The antigens used were the genetically detoxified S1 subunít of pertussis toxin (S1-PT) and the CRD fragment of FHA (Filamentous hemagglutinin. The antigen genes were cloned into mycobacterial expression vectors under control of the upregulated M. fortuitum β-lactamase promoter, pBlaF*, in fusion with the β-lactamase signal sequence. Mice were immunized with rBCG expressing S1-PT and the respective splenocytes induced specific production of INF-γ and low IL-4, characterizing a strong antigen-specific Th1-dominant cellular response. The rSCG-S1 PT induced a low humoral response against PT. Mice immunized with rSCG-S1 PT strains displayed high-level of protection against an intracerebral challenge with live B. pertussis. Animals immunized with rBCG expressing CRD induced anti-FHA antibodies production. Protection induced by the combination of these two strains is being evaluated. A new approach for production of rBCG without the use of antibiotic resistance markers was also investigated, using complementation in auxotrophic BCG. A lysine auxotrophic rSCG strain was transformed with expression vectors containing the complementation gene for lysine and the pertussis antigens: selection of recombinant clones was carried in media without lysine. These constructs allowed steady expression of the antigens and will be evaluated for the induction of an immunological response against pertussis. These strains would be appropriate for clinical evaluation in humans.

O desenvolvimento de vacinas multivalente constitui urna das prioridades na pesquisa de vacinas modernas. A utilização de vetores vivos para apresentação de antígenos heterólogos mostra-se bastante atraente, e eliminaria a necessidade de várias doses para se alcançar uma proteção máxima. Este tipo de vacina poderia ser administrado em dose única, o que poderia aumentar a cobertura vacinal. Neste trabalho foi explorado o potencial do Mycobacterium bovis BCG recombinante (rBCG) vivo expressando antígenos de Bordetella pertussis, como futuro componente de urna vacina tetravalente rBCG-DTP contra a tuberculose, tétano, difteria e pertussis. Os antígenos de pertussis utilizados foram a subunidade S1 mutada e atóxica da Toxina Pertussis (SI-P1) e o fragmento CRD, um domínio imunogênico da proteína FHA (Adesina Hemaglutinina Filamentosa). PT é o principal fator de virulência de B. pertussis e tanto sozinho como combinado com outros antígenos é o principal componente de todas as vacinas acelulares desenvolvidas até o momento. FHA é um importante fator de aderência da bactéria às células ciliada alvo do hospedeiro, sendo o CRD (domínio de reconhecimento a carboidrato) o responsável pelo reconhecimento de carboidratos em receptores de células do hospedeiro. Os genes detses antígenos foram clonados em vetores de expressão micobacterianos e expressos em BCG sob o controle do promotor mutado da β-lactamase de Mycobacterium fortuitum, pBlaF*, em fusão com o peptídeo sinal da β-lactamase. Estes vetores possuem como marcador de seleção um gene de resistência a kanamicina. Camundongos foram imunizados com rBCG expressando S1-PT e os respectivos esplenócitos mostraram elevada produção de IFN-γ e baixa produção de IL-4, caracterizando uma forte resposta celular Th1 antígeno-específica dominante. rBCG-S1PT induziu uma baixa resposta humoral contra PT. Camundongos imunizados com rBCG-S1PT mostraram elevado nível de proteção contra um desafio intracerebral com uma cepa virulenta de B. pertussis. Animais imunizados com rBCG expressando CRD revelaram a presença de anticorpos anti-FHA no soro. Ensaios com camundongos imunizados com a combinação destas duas vacinas estão sendo realizados. Uma nova abordagem para obtenção de rBCG sem o uso de genes de resistência a antibióticos como marcador de seleção, foi investigada, utilizando a complementação em BCG auxotrófico. Uma cepa de rBCG auxotrófico para lisina foi transformada com vetores de expressão contendo o gene de complementação para lisina e os antígenos de pertussis sob controle do mesmo promotor: a seleção dos recombinantes é realizada em meio sem lisina. Estas construções permitiram a expressão estável dos antígenos e serão avaliadas quanto a indução de uma resposta imunológica efetiva contra pertussis. / The development of combined vaccines constitutes one of the priorities in modem vaccine research. The use of live vectors for heterologous antigen presentation is desirable, as it could eliminate the necessity of several doses to reach a maximum protection and increase vaccine coverage. In this work, the potential of recombinant Mycobacterium bovis BCG (Bacillus Calmette and Guerin) (rBCG), expressing Bordetella pertussis antigens was investigated. The antigens used were the genetically detoxified S1 subunít of pertussis toxin (S1-PT) and the CRD fragment of FHA (Filamentous hemagglutinin. The antigen genes were cloned into mycobacterial expression vectors under control of the upregulated M. fortuitum β-lactamase promoter, pBlaF*, in fusion with the β-lactamase signal sequence. Mice were immunized with rBCG expressing S1-PT and the respective splenocytes induced specific production of INF-γ and low IL-4, characterizing a strong antigen-specific Th1-dominant cellular response. The rSCG-S1 PT induced a low humoral response against PT. Mice immunized with rSCG-S1 PT strains displayed high-level of protection against an intracerebral challenge with live B. pertussis. Animals immunized with rBCG expressing CRD induced anti-FHA antibodies production. Protection induced by the combination of these two strains is being evaluated. A new approach for production of rBCG without the use of antibiotic resistance markers was also investigated, using complementation in auxotrophic BCG. A lysine auxotrophic rSCG strain was transformed with expression vectors containing the complementation gene for lysine and the pertussis antigens: selection of recombinant clones was carried in media without lysine. These constructs allowed steady expression of the antigens and will be evaluated for the induction of an immunological response against pertussis. These strains would be appropriate for clinical evaluation in humans.