Les inhibiteurs de BRAFV600-, dont le vemurafenib, sont efficaces contre les tumeurs présentant cette mutation activatrice de la voie des MAPK, ce qui est le cas d’un mélanome sur deux. Mais la plupart des malades traités rechutent dans l’année, et développent des tumeurs paradoxales secondaires.Divers mécanismes de résistance aux inhibiteurs de BRAF ont été décrits, cette résistance passant soit par réactivation de la voie des MAPK, soit par activation de la voie parallèle Akt/mTor, soit par anomalie de régulation de l’apoptose. Dans le cadre de cette thèse, nous avons mis en évidence une nouvelle cible thérapeutique: l’initiation de la traduction cap-dépendante. L’augmentation de la traduction de certains ARNm en protéines est une étape capitale de l’expression des gènes dans les processus oncogènes. Une étape limitante de cette traduction est son initiation. La protéine eIF4E (eukaryotic Initiation Factor 4E) se lie à la coiffe m7GTP des ARNm et régule la synthèse protéique en fonction de ses partenaires 4EBP1 et eIF4G. Quand eIF4E est assemblé à eIF4G et eIF4A, on parle du complexe « eIF4F », situé au point de convergence de la voie des MAPK et de la voie Akt/mTor via 4EBP1. Ce complexe est nécessaire à la traduction des protéines de survie et de prolifération cellulaire ayant une structure secondaire complexe en 5’UTR. Pour déterminer le statut d’activation du complexe eIF4F dans des lignées cellulaires, nous avons réalisé une immunoprécipitation des protéines liées au cap (« cap-binding assay »). Nous avons observé que le vemurafenib entraînait une diminution d’eIF4G fixé à eIF4E dans les cellules sensibles mais aucune modification dans les lignées résistantes. Parallèlement, la fixation de 4EBP1 à eIF4E augmente sous vemurafenib pour les lignées sensibles. Pour confirmer ces résultats, nous avons utilisé la technique de « Proximity Ligation Assay » (PLA), qui nous a permis de visualiser les complexes eIF4E-eIF4G et eIF4E-4EBP1 sous forme de points fluorescents observables en microscopie. Le nombre de complexes eIF4E-eF4G était bien diminué dans les cellules sensibles sous vemurafenib ce qui n’était pas le cas dans les cellules résistantes. Parallèlement, le nombre d’interactions eIF4E-4EBP1 augmentait dans les cellules sensibles et restait stable dans les cellules résistantes. De même, dans les tumeurs de patients, le rapport des complexes eIF4E-eIF4G sur eIF4E-4EBP1 diminuait dans les métastases en réponse au vemurafenib puis réaugmentait lors des récidives tumorales. De plus, nous avons testé des composés ciblant la traduction cap-dépendante et plus particulièrement eIF4A : les flavaglines. Nous avons montré que leur capacité à cibler l’initiation de la traduction était corrélée à l’inhibition de la prolifération des lignées cellulaires résistantes. Enfin, nous avons testé l’une d’elles in vivo. Les résultats montrent un effet synergique de cette drogue combinée au vemurafenib et une inhibition de la croissance tumorale.Concernant l’autre inconvénient majeur des anti-BRAF, l’induction fréquente de tumeurs secondaires, nous avons visualisé, aussi par PLA, les dimères BRAF-CRAF pour la première fois dans une série de tumeurs paradoxales de patients, cutanées et extra-cutanées. Ces dimères sont significativement plus nombreux dans les tumeurs cutanées apparaissant sous anti-BRAF que dans une série tumeurs contrôles de même type.En conclusion, nous avons identifié un nouveau biomarqueur de résistance aux anti-BRAF, visualisable par PLA. Pour optimiser la réponse tumorale à ces thérapies ciblées, qui constituent le traitement de choix des mélanomes métastatiques mutés, nous proposons d’y associer un inhibiteur de l’initiation de la traduction. Nous avons en parallèle mis au point le PLA BRAF-CRAF dans les tumeurs paradoxales induites par les anti-BRAF, et nous avons identifié des sous-populations plus à risque de développer ce type de tumeurs. / BRAFV600- inhibitors, including vemurafenib, are efficient against tumors harboring this MAPK pathway activating mutation, which is the case of ~50% of melanomas. But most of the patients under treatment progress within a year, and develop paradoxical secondary tumors. Most resistance mechanisms to drugs that target the BRAF and/or MEK kinases in cancer rely on reactivation of the RAS-RAF-MEK-ERK signal transduction pathway (ERK-dependent), on activation of the alternative PI3K-AKT-mTOR pathway (ERK-independent) or on modulation of the caspase-dependent apoptotic cascade. All three pathways converge to regulate the formation of the eIF4F translation initiation complex that binds to the 7-methyl-guanine cap at the 5’ end of mRNAs, thereby modulating mRNA translation of specific mRNAs. We show here that persistent formation of the eIF4F complex, comprising the eIF4E cap binding protein, the eIF4G scaffolding protein and the eIF4A RNA helicase, is associated with resistance to anti-BRAF, anti-MEK and to anti-BRAF + anti-MEK combinations in BRAFV600- mutant melanoma, colon and thyroid cell lines. Unresponsiveness to treatment and maintenance of eIF4F complex formation is associated with either reactivation of MAPK signaling or absence of ERK-independent decreased phosphorylation of the inhibitory eiF4E binding protein 4EBP1 or increased pro-apoptotic Bcl-2 modifying factor (BMF)-dependent degradation of eIF4G. Development of an in situ method shows by proximity ligation assay (PLA) that the formation of the eIF4F complex is decreased in tumors responding to anti-BRAF therapy and increased in resistant metastases. Strikingly, inhibiting the eIF4F complex, either by blocking the eIF4E-eIF4G interaction or by targeting eIF4A with small compounds is synergistic with BRAFV600- inhibition. The other main problem arising during anti-BRAF treatment is the frequent induction of secondary cutaneous and extra-cutaneous tumors, through the formation of BRAF-CRAF dimers that we visualized in vivo for the first time. In conclusion, we have identified by PLA a novel biomarker of resistance against BRAF inhibitors, which is also a promising therapeutic target. Combinations of drugs targeting BRAF (and/or MEK) and eIF4F may overcome most of the resistance mechanisms arising in BRAFV600- cancers. In parallel, we established a BRAF-CRAF PLA method in paradoxical secondary tumors induced by BRAF inhibitors, leading to the identification of several subpopulations more at risk of developing this type of tumors.

Les leucémies aigues myéloïdes (LAM) sont des hémopathies malignes de mauvais pronostic dont les thérapies actuelles ne permettent d’obtenir des taux de survie à 5 ans chez les adultes que d’environ 40%. Par conséquent, il est nécessaire d’approfondir nos connaissances concernant les mécanismes d’oncogenèse pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Malgré leur hétérogénéité clinique et biologique, les LAM ont certaines caractéristiques communes comme l’activation de la voie de signalisation mTORCl qui est détectée dans la plupart des échantillons de LAM. MTORCl contrôle la survie, la croissance et la prolifération cellulaire, notamment via le contrôle de la traduction des ARNm et donc de la synthèse protéique. Au cours de ce travail, nous montrons qu’il existe, dans les LAM, une dérégulation de mTORCl qui explique les limites des effets anti-leucémiques observés avec la rapamycine (un inhibiteur allostérique de mTORCl) et qui est médiée en partie par l’activité de la sérine thréonine kinase Pim2, qui contrôle la phosphorylation de la cible de mTORCl, la protéine 4E-BP1. Cependant, cibler directement la traduction produit des effets anti-leucémiques importants, ce que nous avons montré en utilisant une molécule inhibant spécifiquement le complexe d’initiation de la traduction, le 4EGI-l. EIF4E est essentiel à l’initiation de la traduction et nous avons montré sa surexpression au niveau protéique dans la plupart des échantillons de LAM au diagnostic par comparaison à des cellules hématopoïétiques normales CD34+. Bien que son niveau d’expression n’ait pas de valeur pronostique intrinsèque, ce résultat suggère un potentiel important au blocage de la traduction dans la plupart des cas de LAM. Dans la perspective d’inhiber mTORCl, nous avons activé la voie LKBl/AMPK par la metformine, ce qui a induit des effets anti-leucémiques in vitro et in vivo via une modification du métabolisme cellulaire avec en particulier une inhibition de la synthèse de protéines oncogéniques. La metformine n’étant pas un candidat en thérapeutique dans les LAM du fait d’un index thérapeutique trop étroit, de nouvelles molécules modulant la voie LKBl/AMPK sont en cours de développement. Enfin, nous avons étudié le rôle de la sérine thréonine kinase Pim2, qui contrôle la traduction protéique et la survie dans les cellules de LAM Flt3-ITD+. Nous avons de plus montré que la sur-expression de Pim2 constitue un nouveau mécanisme de résistance aux inhibiteurs de Flt3 et représente donc une cible thérapeutique prometteuse dans cette catégorie de LAM. L’étude de la voie mTORCl et de la traduction permet donc d’envisager de multiples perspectives thérapeutiques dans les LAM dont certaines sont déjà en cours de développement clinique. / Acute myeloid leukemia (AML) are hematological malignancies with adverse prognosis in which therapies only gives 40% survival within 5 years in adults. Hence, it is important to increase our knowledge regarding oncogenesis to further develop new therapeutic approaches. Despite their clinical and biological heterogeneity, AML have in common the constitutive activation of mTORC1 signaling which is detected in most AML samples. MTORC1 controls cell survival, growth and proliferation, in particular through control of mRNA translation and protein synthesis. During this work, we show, in AML, that mTORC1 is deregulated which explain the poor effects observed with rapamycin (a mTORC1 allosteric inhibitor) and is partially mediated by the serine/threonine kinase Pim-2 which controls the mTORC1 target 4E-BP1. Nevertheless, directly targeting translation, using a specific translation initiation inhibitor named 4EGI-1, have important anti leukemic effects. EIF4E is described as essential in translation initiation and we show its protein overexpression in most AML samples at diagnosis compared with normal hematopoietic CD34+ cells. Whereas eIF4E level expression has no prognostic impact, this result suggests an important potential for treatment targeting translation initiation in AML. In our purpose of inhibiting mTORC1, we were able to activate LKB1/AMPK signaling pathway with metformin, which induces anti leukemic effects in vitro and in vivo through in particular oncogenic protein translation inhibition. Metformin is not a good AML therapeutic candidate because of a narrow therapeutic index, new compound targeting LKB1/AMPK are in development. Finally, we studied the role of the serine/threonine kinase Pim-2 and show that it controls protein translation and FLT3-ITD+ AML cells survival. Furthermore, we show that Pim-2 overexpression is a new mechanism of Flt3 inhibitors resistance and represent a new promising therapeutic target in this AML subtype. Overall, mTORC1 and protein translation study in AML show multiple therapeutics perspective, some of them are already in clinical development.