Submitted by Chaylane Marques (chaylane.marques@ufpe.br) on 2015-03-12T19:27:55Z No. of bitstreams: 2 Dissertação de Mestrado - Janaína - Versão final biblioteca.pdf: 2425301 bytes, checksum: f7164df63d1331f1d568db3ea2c93c22 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T19:27:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação de Mestrado - Janaína - Versão final biblioteca.pdf: 2425301 bytes, checksum: f7164df63d1331f1d568db3ea2c93c22 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-05-14 / FACEPE; CNPQ / Os tripanossomatídeos são protozoários unicelulares que apresentam uma biologia molecular bastante divergente dos demais eucariotos e são responsáveis por doenças negligenciadas que afetam milhares de pessoas. A carência de drogas mais eficazes contra estes patógenos justifica a busca da compreensão dos seus processos celulares. Um desses processos é a síntese proteica que, nos eucariotos, é dividida em quatro etapas, sendo a primeira, a iniciação, a mais complexa. A iniciação da tradução é dependente dos fatores de iniciação eucarióticos (eIFs), dentre os quais destaca-se o complexo eIF4F, cuja subunidade eIF4E é responsável pelo reconhecimento do cap presente na extremidade 5’ do mRNAs. Em Leishmania major e Trypanosoma brucei foram identificados seis homólogos conservados de eIF4E, sendo os EIF4E5 e 6 identificados mais tardiamente. O presente trabalho buscou contribuir com a caracterização funcional destas proteínas, iniciando-se com uma análise comparativa das suas sequências onde foram identificados motivos conservados presentes em outros homólogos de eIF4E. Em T. brucei, experimentos de localização subcelular mostraram que ambas as proteínas são citoplasmáticas, porém com alguma localização nuclear. Utilizando RNAi na fase procíclica do parasita, somente TbEIF4E5 mostrou-se essencial a viabilidade celular enquanto que as células depletadas do TbEIF4E6 apresentaram alterações morfológicas. Através da purificação de fosfoproteínas constatou-se que ambos os fatores são fosforilados e a predição in silico dos possíveis sítios revelou a presença de múltiplos resíduos passíveis de fosforilação. Já em L. major seus respectivos homólogos foram expressos em bactéria e utilizados para a produção de soros policlonais. Esses soros foram capazes de detectar a expressão do LmEIF4E5 em extratos de formas promastigotas de Leishmania enquanto para LmEIF4E6 não foi observada expressão compatível com o peso molecular esperado. Os resultados e as ferramentas moleculares produzidas contribuem tanto para a compreensão da função desempenhada por estas proteínas, como para o conhecimento do processo de tradução nos tripanossomatídeos.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-06T19:22:04Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Dissertação-JanaínaNascimento.pdf: 2428494 bytes, checksum: 1f074c8519d239e65f167723cc34b5cf (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-06T19:22:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Dissertação-JanaínaNascimento.pdf: 2428494 bytes, checksum: 1f074c8519d239e65f167723cc34b5cf (MD5) Previous issue date: 2012-05-14 / Os tripanossomatídeos são protozoários unicelulares que apresentam uma biologia molecular bastante divergente dos demais eucariotos e são responsáveis por doenças negligenciadas que afetam milhares de pessoas. A carência de drogas mais eficazes contra estes patógenos justifica a busca da compreensão dos seus processos celulares. Um desses processos é a síntese proteica que, nos eucariotos, é dividida em quatro etapas, sendo a primeira, a iniciação, a mais complexa. A iniciação da tradução é dependente dos fatores de iniciação eucarióticos (eIFs), dentre os quais destaca-se o complexo eIF4F, cuja subunidade eIF4E é responsável pelo reconhecimento do cap presente na extremidade 5’ do mRNAs. Em Leishmania major e Trypanosoma brucei foram identificados seis homólogos conservados de eIF4E, sendo os EIF4E5 e 6 identificados mais tardiamente. O presente trabalho buscou contribuir com a caracterização funcional destas proteínas, iniciando-se com uma análise comparativa das suas sequências onde foram identificados motivos conservados presentes em outros homólogos de eIF4E. Em T. brucei, experimentos de localização subcelular mostraram que ambas as proteínas são citoplasmáticas, porém com alguma localização nuclear. Utilizando RNAi na fase procíclica do parasita, somente TbEIF4E5 mostrou-se essencial a viabilidade celular enquanto que as células depletadas do TbEIF4E6 apresentaram alterações morfológicas. Através da purificação de fosfoproteínas constatou-se que ambos os fatores são fosforilados e a predição in silico dos possíveis sítios revelou a presença de múltiplos resíduos passíveis de fosforilação. Já em L. major seus respectivos homólogos foram expressos em bactéria e utilizados para a produção de soros policlonais. Esses soros foram capazes de detectar a expressão do LmEIF4E5 em extratos de formas promastigotas de Leishmania enquanto para LmEIF4E6 não foi observada expressão compatível com o peso molecular esperado. Os resultados e as ferramentas moleculares produzidas contribuem tanto para a compreensão da função desempenhada por estas proteínas, como para o conhecimento do processo de tradução nos tripanossomatídeos. / Trypanosomatids are unicellular protozoans characterized by a divergent molecular biology, when compared to other eukaryotes. They are responsible for neglected diseases which affect thousands of people and the lack of more effective drugs against these diseases justifies a better understanding of their basic processes. One of these is protein synthesis (translation), formally divided into four stages, the first of which, initiation, is the most complex. Translation initiation is entirely dependent on the “eukaryotic Initiation Factors” (eIFs), such as the complex eIF4F. eIF4E is an eIF4F subunit which is responsible for the recognition of the cap on the 5’ end of mRNAs. Six conserved eIF4E homologues were found in Leishmania major and Trypanosoma brucei, with EIF4E5 and 6 being the latest ones identified. This work aimed to contribute with the functional characterization of these proteins, starting with a comparative analysis of their sequences where conserved motifs also found in other eIF4E homologues were identified. In T. brucei, subcellular localization experiments indicated that both proteins are predominantly cytoplasmic, but with minor nuclear localization. Using RNAi in the procyclic stage, only TbIF4E5 proved to be essential for cell viability, while cells depleted of TbEIF4E6 showed morphological abnormalities. Through phosphoprotein affinity purification, both proteins were observed to be phosphorylated, and the in silico prediction of possible phosphorylation sites revealed the presence of multiple putative sites. Regarding the L. major homologues, the corresponding proteins were expressed in bacteria and used to produce polyclonal antisera which were able to detect the expression of LmEIF4E5 in Leishmania promastigotes. However the expression observed for LmEIF4E6 is not consistent with its expected molecular weight. The results and molecular tools produced in this work contribute not only to the understanding of the functional role of these proteins, but also to the knowledge of the translation process in trypanosomatids.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:02:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo777_1.pdf: 7000051 bytes, checksum: a8e29b3f2773bafb86a39a499e858a7d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A regulação da expressão gênica nos tripanosomatídeos é realizada principalmente por mecanismos pos-transcricionais tais como o controle da estabilidade dos mRNAs e da sua tradução. Em eucariotos a tradução é controlada principalmente no recrutamento dos ribossomos para os mRNAs, mediada pelos fatores eucarióticos de iniciação da tradução (eIFs). Neste contexto, o reconhecimento dos mRNAs é realizado principalmente pelo complexo eIF4F, composto pelas subunidades eIF4E, eIF4A, e eIF4G. Um dos principais fatores envolvidos no controle da tradução é o eIF4E, que além de participar na síntese de proteínas, tem sido implicado em um número de processos envolvidos no metabolismo de mRNAs, como o transporte e controle de sua estabilidade. Este trabalho visou a caracterização dos homólogos ao eIF4E de tripanossomatídeos usando como organismo modelo o Trypanosoma brucei. A avaliação da expressão dos quatro homólogos de T. brucei (aqui chamados TbEIF4E1 a 4) em extratos protéicos mostrou que todas as proteínas são expressas constitutivamente durante o seu ciclo de vida, e que as proteínas TbEIF4E3 e TbEIF4E4 são as mais abundantes. Quando fusionadas a proteínas fluorescentes in vivo os TbEIF4E1 e 2 apresentaram localização nuclear e citoplasmática, enquanto os TbEIF4E3 e 4 mostraram-se estritamente citoplasmáticos. A depleção por RNAi mostrou que o TbEIF4E3 é o único essencial para a viabilidade na forma procíclica. Já na forma saguínea, TbEIF4E1, 3 e 4 foram essenciais. A depleção simultânea de TbEIF4E1/E2 causou a morte em células procíclicas, sem impacto na tradução, por outro lado o TbEIF4E3 ou duplo nocaute TbEIF4E1/E4 levaram à inibição substancial da tradução anterior a interrupção do crescimento e morte celular. Análises de imunoprecipitados mostraram que somente os TbEIF4E3 e 4 interagem com homólogos de eIF4G, as proteínas TbEIF4G3 e 4. Estes resultados são consistentes com a formação de complexos eIF4F distintos pelas proteínas TbEIF4E3 e 4, e estes complexos podem participar na tradução de maneira independente, o que revela propriedades da família eIF4E novas e intrigantes nestes organismos

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:03:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3688_1.pdf: 1907498 bytes, checksum: 101a9bcd7d206849add625965525a3c3 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Os tripanossomatídeos são protozoários que causam manifestações clínicas de impacto mundial e possuem características bioquímicas peculiares que os diferem dos demais eucariotos. Sua expressão gênica é regulada em nível pós-transcricional, provavelmente no estágio de iniciação da síntese protéica. A tradução cap-dependente é iniciada através da ligação do fator de iniciação eIF4E, pertencente ao complexo eIF4F, ao cap presente na extremidade 5 dos mRNAs. Foram identificados múltiplos homólogos do fator EIF4E nestes parasitas, que provavelmente estão associados ao seu complexo ciclo de vida. Neste trabalho, nós buscamos entender como ocorre a expressão de quatro homólogos deste fator (EIF4E1-4) durante o ciclo de vida de Leishmania amazonensis. Para tal, foram realizadas curvas a fim de se obter as três principais formas evolutivas do parasita. Todos os homólogos estão presentes ao longo da curva e os EIF4E2-4 apresentam múltiplas isoformas, sugerindo modificações pós-traducionais por fosforilação. Destes, as isoformas dos EIF4E3 e 4 apresentaram expressão constrastante que não interferem com sua localização subcelular, citoplasmática. A ausência de soro fetal bovino no meio induziu uma desfosforilação prematura do EIF4E4 e uma hiperfosforilação do EIF4E3, associados à falta de crescimento celular. EIF4E3 desfosforilado e EIF4E4 fosforilado estão associados a uma maior atividade de tradução. A presença de um inibidor de transcrição influenciou no padrão de expressão dos dois homólogos, porém um inibidor de tradução afetou apenas o EIF4E3. Estes resultados indicam que os homólogos de eIF4E atuam de forma distinta na célula e que a fosforilação deve ter um papel significante na regulação destes fatores em Leishmania e na regulação da síntese de proteínas como um todo

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:06:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6312_1.pdf: 8199833 bytes, checksum: 3cadcc7bdd3835d13a768cd12db8fb20 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / Em eucariotos, a síntese protéica se inicia com a ligação do complexo multimérico de iniciação da tradução eIF4F (Fator de iniciação da tradução 4F) ao cap monometilado e o recrutamento da subunidade menor ribossomal à porção 5 dos mRNAs. Este complexo é composto por três subunidades: eIF4E, proteína de ligação ao nucleotídeo cap; eIF4A, uma RNA helicase; e eIF4G, que atua como montador para o complexo. Pouco é conhecido sobre os detalhes da síntese protéica em tripanosomatídeos; todavia, a presença da conservada estrutura cap modificada, cap4, e da seqüência spliced leader na porção 5 de todos os mRNAs sugerem possíveis diferenças no recrutamento do mRNA aos ribossomos. Nosso grupo de pesquisa identificou vários homólogos a fatores de iniciação do complexo eIF4F de tripanosomatídeos em trabalhos anteriores, e objetivo deste trabalho foi caracterizar os homólogos ao eIF4E em Leishmania major e Trypanosoma brucei. A quantificação dos homólogos ao eIF4E de L. major (LmEIF4E1-3) revelou que o LmEIF4E1 e LmEIF4E2 são raros e o LmEIF4E3 é muito abundante na forma promastigota deste parasita. Dentre os homólogos de T. brucei (TbEIF4E1-3), o TbEIF4E1 pôde ser detectado em baixos níveis nas formas procíclica e sanguínea, o TbEFI4E2 é raro, ou não detectado, nas duas formas e o TbEIF4E3 é muito abundante na forma procíclica e raro, ou não detectado, na forma sanguínea. Em ensaios de ligação ao cap, somente o LmEIF4E1 e os homólogos TbEIF4E1, TbEIF4E2 e TbEIF4E4 foram capazes de se ligar às resinas de 7-metil-GTP sefarose. Conseqüentemente, os ensaios realizados revelaram que apenas um dos homólogos testados (EIF4E1) em ambos os parasitas parece ser capaz de cumprir as características esperadas de um fator de iniciação da tradução da família eIF4E. No entanto, novos ensaios são necessários para uma melhor caracterização e compreensão dos papeis das proteínas de ligação ao cap nos Tripanosomatídeos

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:07:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo775_1.pdf: 2674039 bytes, checksum: 2d48ce1a10b6a494268836174af90e47 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / O Trypanosoma brucei é um protozoário unicelular causador da doença do sono em humanos, e cujo ciclo de vida se alterna entre dois hospedeiros, sendo a forma procílica encontrada em insetos vetores e a forma sanguínea em mamíferos suscetíveis. Nesse parasita a regulação da expressão gênica ocorre basicamente em nível pós-transcricional e a biossíntese de proteínas, principalmente na etapa denominada iniciação da tradução, é um ponto potencialmente crítico dessa regulação. Análises genômicas identificaram um número consideravelmente grande de proteínas quinases, o que levou a especulação de que a fosforilação de proteínas, dentre as modificações pós-traducionais, também seja um mecanismo chave para eventos dessa regulação. Em eucariotos, o complexo eIF4F (formado pelas subunidades eIF4A, eIF4E e eIF4G), auxiliado pela proteína de ligação ao poli-A (PABP), atua na iniciação da tradução e tem sua atividade regulada por modificações como fosforilação. Este trabalho buscou analisar a expressão de homólogos selecionados de eIF4E, eIF4G e PABP de T. brucei (TbEIF4E1, TbEIF4E3 e 4, TbEIF4G4 e 5) e investigar a ocorrência de modificações pós-traducionais que possam estar associadas ao controle da sua função. Primeiro, curvas de crescimento foram geradas e extratos protéicos produzidos a partir de células derivadas de pontos selecionados destas curvas. Foi possível observar que todas as proteínas selecionadas eram expressas ao longo das curvas em ambas as formas do ciclo de vida do parasita, porém com padrões de expressão distintos. Os TbEIF4E1 e 3 são as proteínas menos e mais expressas, respectivamente, em ambas as formas procíclica e sanguínea. Os TbEIF4E3 e 4 e o TbEIF4G4 foram representados por mais de uma isoforma, ao contrário dos demais fatores estudados, e observou-se que as três proteínas eram encontradas sob formas fosforiladas. Através da eletroforese bidimensional foi possível visualizar que TbPABP1, TbEIF4E3 e TbEIF4E4 possuem 2, 5 e 4 isoformas, respectivamente, enquanto o TbEIF4AI, não fosforilado, possui apenas uma. Adicionalmente, foi demonstrado que a fosforilação do TbEIF4G4 não impede sua a interação com o TbEIF4E3. Esses resultados indicam que a fosforilação é um mecanismo que parece possuir um papel predominante na regulação da função dos fatores estudados

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Plasticity in dorsal root ganglion (DRG) neurons that promotes pain requires activity-dependent mRNA translation. Protein synthesis inhibitors block the ability of many pain-promoting molecules to enhance excitability in DRG neurons and attenuate behavioral signs of pain plasticity. In line with this, we have recently shown that phosphorylation of the 5' cap-binding protein, eIF4E, plays a pivotal role in plasticity of DRG nociceptors in models of hyperalgesic priming. However, mRNA targets of eIF4E phosphorylation have not been elucidated in the DRG. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) signaling from nociceptors in the DRG to spinal dorsal horn neurons is an important mediator of hyperalgesic priming. Regulatory mechanisms that promote pain plasticity via controlling BDNF expression that is involved in promoting pain plasticity have not been identified. We show that phosphorylation of eIF4E is paramount for Bdnf mRNA translation in the DRG. Bdnf mRNA translation is reduced in mice lacking eIF4E phosphorylation (eIF4E(S209A)) and pro-nociceptive factors fail to increase BDNF protein levels in the DRGs of these mice despite robust upregulation of Bdnf-201 mRNA levels. Importantly, bypassing the DRG by giving intrathecal injection of BDNF in eIF4E(S209A) mice creates a strong hyperalgesic priming response that is normally absent or reduced in these mice. We conclude that eIF4E phosphorylation-mediated translational control of BDNF expression is a key mechanism for nociceptor plasticity leading to hyperalgesic priming.

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Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-08-12T13:39:46Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) tese amaranta.pdf: 1596892 bytes, checksum: 5d4ba09b331b3e559fa3f104e519a054 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-12T13:39:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) tese amaranta.pdf: 1596892 bytes, checksum: 5d4ba09b331b3e559fa3f104e519a054 (MD5) Previous issue date: 2015-03-09 / CNPq / A iniciação da tradução é a etapa mais complexa de um processo crítico para a sobrevivência dos seres vivos, onde se destaca a atuação do complexo eIF4F, formado pelas subunidades eIF4E, eIF4A, e eIF4G. Seis homólogos de eIF4E (EIF4E1 a 6) e cinco de eIF4G (EIF4G1 a 5) foram identificados no protozoário Trypanosoma brucei. Este trabalho buscou contribuir no estudo de complexos do tipo eIF4F neste patógeno, inicialmente analisando a expressão de subunidades de complexos já definidos, formado pelos EIF4E4/EIF4G3 e EIF4E3/EIF4G4. Observou-se que, à exceção do EIF4G3, essas subunidades são representadas por isoformas originárias de eventos de fosforilação. No caso do EIF4E4, esses eventos estão associados às fases de crescimento do microorganismo e as fosforilações dos EIF4E3 e EIF4E4 são direcionadas às suas extremidades N-terminais. A etapa seguinte compreendeu o estudo de duas proteínas hipotéticas, encontradas com novos complexos baseados nos EIF4E5/EIF4G1 e EIF4E6/EIF4G5 (Tb117.5 e TbG5-IP). Essas são homólogas de enzimas associadas a formação da extremidade 5’ dos mRNAs, porém apresentaram localização citoplasmática. Sua associação aos referidos complexos foi investigada e enquanto a Tb117.5 se associa com uma subpopulação do complexo EIF4E5/EIF4G1, a TbG5-IP se mostrou parte integrante do complexo EIF4E6/EIF5G5. A depleção por RNA interferência dessas proteínas não alterou a viabilidade celular apesar do insucesso na obtenção de deleção dupla dos seus genes. Os dados obtidos sugerem uma divergência funcional nesses complexos ainda não encontrada em outros eucariotos. / The initiation of translation is the most complex stage of a critical process required for the survival of all living beings and which requires the activity of the eIF4F complex, formed by the eIF4E, eIF4A, and eIF4G subunits. Six homologues of eIF4E (EIF4E1 to 6) and five of eIF4G (EIF4G1 to 5) were identified in the protozoan Trypanosoma brucei. This study aimed to contribute to the study of eIF4F-like complexes within this pathogen, initially analyzing the expression of subunits found in already defined complexes, formed by EIF4E4/EIF4G3 and EIF4E3/EIF4G4. Except for EIF4G3, all these subunits are represented by multiple isoforms originating from phosphorylation events. For EIF4E4, these events are associated with the microorganism’s growth phase and the phosphorylations of both EIF4E3 and EIF4E4 are directed to their N- terminal ends. The next step included the study of two hypothetical proteins found within new complexes based on EIF4E5/EIF4G1 and EIF4E6/EIF4G5 (Tb117.5 and TbG5-IP). These are homologous to enzymes associated with the formation of the mRNAs’ 5’ end but showed cytoplasmic localization. Their association with the new complexes was investigated and while Tb117.5 is associated with a subset of the EIF4E5/EIF4G1 complex, TbG5-IP proved to be an integral part of the EIF4E6/EIF5G5 complex. The depletion by RNA interference of these proteins did not affect cell viability despite the failure to achieve a double deletion of their genes. The data suggest a functional divergence in these complexes that is not found in other eukaryotes.