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The role of the peptidyl prolyl isomerase Rrd1 in the transcriptional stress responsePoschmann, Jeremie 08 1900 (has links)
La régulation de la transcription est un processus complexe qui a évolué pendant des millions
d’années permettant ainsi aux cellules de s’adapter aux changements environnementaux. Notre
laboratoire étudie le rôle de la rapamycine, un agent immunosuppresseur et anticancéreux, qui
mime la carence nutritionelle. Afin de comprendre les mécanismes impliqués dans la réponse a
la rapamycine, nous recherchons des mutants de la levure Saccaromyces cerevisiae qui ont un
phenotype altérée envers cette drogue. Nous avons identifié le gène RRD1, qui encode une
peptidyl prolyl isomérase et dont la mutation rend les levures très résistantes à la rapamycine et il
semble que se soit associé à une réponse transcriptionelle alterée. Mon projet de recherche de
doctorat est d’identifier le rôle de Rrd1 dans la réponse à la rapamycine. Tout d’abord nous
avons trouvé que Rrd1 interagit avec l’ARN polymérase II (RNAPII), plus spécifiquement avec
son domaine C-terminal. En réponse à la rapamycine, Rrd1 induit un changement dans la
conformation du domaine C-terminal in vivo permettant la régulation de l’association de RNAPII
avec certains gènes. Des analyses in vitro ont également montré que cette action est directe et
probablement liée à l’activité isomérase de Rrd1 suggérant un rôle pour Rrd1 dans la régulation
de la transcription. Nous avons utilisé la technologie de ChIP sur micropuce pour localiser Rrd1
sur la majorité des gènes transcrits par RNAPII et montre que Rrd1 agit en tant que facteur
d’élongation de RNAPII. Pour finir, des résultats suggèrent que Rrd1 n’est pas seulement
impliqué dans la réponse à la rapamycine mais aussi à differents stress environnementaux, nous
permettant ainsi d’établir que Rrd1 est un facteur d’élongation de la transcription requis pour la
régulation de la transcription via RNAPII en réponse au stress. / Transcriptional regulation is a complex process that has evolved over millions of years of
evolution. Cells have to sense environmental conditions and adapt to them by altering their
transcription. Herein, we study the role of rapamycin, an immunosuppressant and anticancer
molecule that mimics cellular starvation. To understand how the action of rapamycin is
mediated, we analyzed gene deletion mutants in the yeast Saccharomyces cerevisiae that have an
altered response to this drug. Deletion of RRD1, a gene encoding a peptidyl prolyl isomerase,
causes strong resistance to rapamycin and this was associated with a role of Rrd1 in the
transcriptional response towards rapamycin. The main focus of my PhD was therefore to unravel
the role of Rrd1 in response to rapamycin. First, we discovered that Rrd1 interacts with RNA
polymerase II (RNAPII), more specifically with its C-terminal domain and we showed that in
response to rapamycin, Rrd1 alters the structure of this C-terminal domain. This phenomenon
was confirmed to be directly mediated by Rrd1 in vitro, presumably through its peptidyl prolyl
isomerase activity. Further, we demonstrated that Rrd1 is capable of altering the occupancy of
RNAPII on genes in vivo and in vitro. With the use of ChIP on chip technology, we show that
Rrd1 is actually a transcription elongation factor that is associated with RNAPII on actively
transcribed genes. In addition, we demonstrate that Rrd1 is indeed required to regulate the
expression of a large subset of genes in response to rapamycin. This data let us propose a novel
mechanism by which Rrd1 regulates RNAPII during transcription elongation. Finally, we
provide evidence that Rrd1 is not only required for an efficient response towards rapamycin but
to a larger variety of environmental stress conditions, thus establishing Rrd1 as a transcriptional
elongation factor required to fine tune the transcriptional stress response of RNAPII.
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The role of the peptidyl prolyl isomerase Rrd1 in the transcriptional stress responsePoschmann, Jeremie 08 1900 (has links)
La régulation de la transcription est un processus complexe qui a évolué pendant des millions
d’années permettant ainsi aux cellules de s’adapter aux changements environnementaux. Notre
laboratoire étudie le rôle de la rapamycine, un agent immunosuppresseur et anticancéreux, qui
mime la carence nutritionelle. Afin de comprendre les mécanismes impliqués dans la réponse a
la rapamycine, nous recherchons des mutants de la levure Saccaromyces cerevisiae qui ont un
phenotype altérée envers cette drogue. Nous avons identifié le gène RRD1, qui encode une
peptidyl prolyl isomérase et dont la mutation rend les levures très résistantes à la rapamycine et il
semble que se soit associé à une réponse transcriptionelle alterée. Mon projet de recherche de
doctorat est d’identifier le rôle de Rrd1 dans la réponse à la rapamycine. Tout d’abord nous
avons trouvé que Rrd1 interagit avec l’ARN polymérase II (RNAPII), plus spécifiquement avec
son domaine C-terminal. En réponse à la rapamycine, Rrd1 induit un changement dans la
conformation du domaine C-terminal in vivo permettant la régulation de l’association de RNAPII
avec certains gènes. Des analyses in vitro ont également montré que cette action est directe et
probablement liée à l’activité isomérase de Rrd1 suggérant un rôle pour Rrd1 dans la régulation
de la transcription. Nous avons utilisé la technologie de ChIP sur micropuce pour localiser Rrd1
sur la majorité des gènes transcrits par RNAPII et montre que Rrd1 agit en tant que facteur
d’élongation de RNAPII. Pour finir, des résultats suggèrent que Rrd1 n’est pas seulement
impliqué dans la réponse à la rapamycine mais aussi à differents stress environnementaux, nous
permettant ainsi d’établir que Rrd1 est un facteur d’élongation de la transcription requis pour la
régulation de la transcription via RNAPII en réponse au stress. / Transcriptional regulation is a complex process that has evolved over millions of years of
evolution. Cells have to sense environmental conditions and adapt to them by altering their
transcription. Herein, we study the role of rapamycin, an immunosuppressant and anticancer
molecule that mimics cellular starvation. To understand how the action of rapamycin is
mediated, we analyzed gene deletion mutants in the yeast Saccharomyces cerevisiae that have an
altered response to this drug. Deletion of RRD1, a gene encoding a peptidyl prolyl isomerase,
causes strong resistance to rapamycin and this was associated with a role of Rrd1 in the
transcriptional response towards rapamycin. The main focus of my PhD was therefore to unravel
the role of Rrd1 in response to rapamycin. First, we discovered that Rrd1 interacts with RNA
polymerase II (RNAPII), more specifically with its C-terminal domain and we showed that in
response to rapamycin, Rrd1 alters the structure of this C-terminal domain. This phenomenon
was confirmed to be directly mediated by Rrd1 in vitro, presumably through its peptidyl prolyl
isomerase activity. Further, we demonstrated that Rrd1 is capable of altering the occupancy of
RNAPII on genes in vivo and in vitro. With the use of ChIP on chip technology, we show that
Rrd1 is actually a transcription elongation factor that is associated with RNAPII on actively
transcribed genes. In addition, we demonstrate that Rrd1 is indeed required to regulate the
expression of a large subset of genes in response to rapamycin. This data let us propose a novel
mechanism by which Rrd1 regulates RNAPII during transcription elongation. Finally, we
provide evidence that Rrd1 is not only required for an efficient response towards rapamycin but
to a larger variety of environmental stress conditions, thus establishing Rrd1 as a transcriptional
elongation factor required to fine tune the transcriptional stress response of RNAPII.
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Analyse de la localisation génomique et identification de nouvelles fonctions des sous-unités Rpb4/Rpb7 de l’ARN polymérase II et des facteurs TFIIF, TFIIS et UBR5Cojocaru, Marilena 07 1900 (has links)
Grâce à un grand nombre d’études biochimiques, génétiques et structurales effectuées dans les dernières années, des avancements considérables ont été réalisés et une nouvelle vision du processus par lequel la machinerie transcriptionnelle de l’ARN polymérase II (Pol II) décode l’information génétique a émergé. De nouveaux indices ont été apportés sur la diversité des mécanismes de régulation de la transcription, ainsi que sur le rôle des facteurs généraux de transcription (GTFs) dans cette diversification. Les travaux présentés dans cette thèse amènent de nouvelles connaissances sur le rôle des GTFs humains dans la régulation des différentes étapes de la transcription.
Dans la première partie de la thèse, nous avons analysé la fonction de la Pol II et des GTFs humains, en examinant de façon systématique leur localisation génomique. Les patrons obtenus par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des versions de GTFs portant une étiquette TAP (Tandem-Affinity Purification) indiquent de nouvelles fonctions in vivo pour certains composants de cette machinerie et pour des éléments structuraux de la Pol II. Nos résultats suggèrent que TFIIF et l’hétérodimère Rpb4–Rpb7 ont une fonction spécifique pendant l’étape d’élongation transcriptionnelle in vivo. De plus, notre étude amène une première image globale de la fonction des GTFs pendant la réaction transcriptionnelle dans des cellules mammifères vivantes.
Deuxièmement, nous avons identifié une nouvelle fonction de TFIIS dans la régulation de CDK9, la sous-unité kinase du facteur P-TEFb (Positive Transcription Elongation Factor b). Nous avons identifié deux nouveaux partenaires d’interaction pour TFIIS, soit CDK9 et la E3 ubiquitine ligase UBR5. Nous montrons que UBR5 catalyse l’ubiquitination de CDK9 in vitro. De plus, la polyubiquitination de CDK9 dans des cellules humaines est dépendante de UBR5 et TFIIS. Nous montrons aussi que UBR5, CDK9 and TFIIS co-localisent le long du gène fibrinogen (FBG) et que la surexpression de TFIIS augmente les niveaux d’occupation par CDK9 de régions spécifiques de ce gène, de façon dépendante de UBR5. Nous proposons que TFIIS a une nouvelle fonction dans la transition entre les étapes d’initiation et d’élongation transcriptionnelle, en régulant la stabilité des complexes CDK9-Pol II pendant les étapes précoces de la transcription. / Biochemical, genetic and structural studies made over the last years bring a new view on the RNA polymerase II (Pol II) machinery and the process by which it decodes the genetic information. They provided new insights into the diversity of the transcriptional regulation mechanisms, and on the role played by the general transcription factors (GTFs). The studies presented in this thesis provide new evidence on the role of human GTFs in the regulation of different stages of transcription.
In the first part of the thesis, we investigated the function of the human Pol II and GTFs in living cells, by systematically analyzing their genomic location. The location profiles obtained by chromatin immunoprecipitation (ChIP) of TAP (tandem-affinity purification) tagged versions of these factors indicate new in vivo functions for several components of this machinery, and for structural elements of the Pol II. These results suggest that TFIIF and the heterodimer Rpb4–Rpb7 have a specific function during the elongation stage in vivo. Additionally, our study offers for the first time a general picture of GTFs function during the Pol II transcription reaction in live mammalian cells, and provides a framework to uncover new regulatory hubs.
Secondly, we report on the identification of a new function of the factor TFIIS in the regulation of CDK9, the kinase subunit of the Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb). We identify two interaction partners for TFIIS, namely CDK9 and the E3 ubiquitin ligase UBR5. We show that UBR5 catalyzes the ubiquitination of CDK9 in vitro. Moreover, the polyubiquitination of CDK9 in human cells is dependent upon both UBR5 and TFIIS, and does not signal its degradation. We also show that UBR5, CDK9 and TFIIS co-localize along specific regions of the fibrinogen (FBG) gene, and that the overexpression of TFIIS increases the occupancy of CDK9 along this gene in a UBR5 dependant manner. We propose a new function of TFIIS in the transition between initiation and elongation stages, by regulating the stability of the early CDK9-Pol II transcribing complexes.
Key words: chromatin immunoprecipitation, general transcription factors, tandem-affinity purification, RNA polymerase II, Rpb4–Rpb7 heterodimer, transcription factor IIF (TFIIF), transcription factor IIS (TFIIS), UBR5 ubiquitin ligase, Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb), CDK9 ubiquitination.
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Analyse de la localisation génomique et identification de nouvelles fonctions des sous-unités Rpb4/Rpb7 de l’ARN polymérase II et des facteurs TFIIF, TFIIS et UBR5Cojocaru, Marilena 07 1900 (has links)
Grâce à un grand nombre d’études biochimiques, génétiques et structurales effectuées dans les dernières années, des avancements considérables ont été réalisés et une nouvelle vision du processus par lequel la machinerie transcriptionnelle de l’ARN polymérase II (Pol II) décode l’information génétique a émergé. De nouveaux indices ont été apportés sur la diversité des mécanismes de régulation de la transcription, ainsi que sur le rôle des facteurs généraux de transcription (GTFs) dans cette diversification. Les travaux présentés dans cette thèse amènent de nouvelles connaissances sur le rôle des GTFs humains dans la régulation des différentes étapes de la transcription.
Dans la première partie de la thèse, nous avons analysé la fonction de la Pol II et des GTFs humains, en examinant de façon systématique leur localisation génomique. Les patrons obtenus par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des versions de GTFs portant une étiquette TAP (Tandem-Affinity Purification) indiquent de nouvelles fonctions in vivo pour certains composants de cette machinerie et pour des éléments structuraux de la Pol II. Nos résultats suggèrent que TFIIF et l’hétérodimère Rpb4–Rpb7 ont une fonction spécifique pendant l’étape d’élongation transcriptionnelle in vivo. De plus, notre étude amène une première image globale de la fonction des GTFs pendant la réaction transcriptionnelle dans des cellules mammifères vivantes.
Deuxièmement, nous avons identifié une nouvelle fonction de TFIIS dans la régulation de CDK9, la sous-unité kinase du facteur P-TEFb (Positive Transcription Elongation Factor b). Nous avons identifié deux nouveaux partenaires d’interaction pour TFIIS, soit CDK9 et la E3 ubiquitine ligase UBR5. Nous montrons que UBR5 catalyse l’ubiquitination de CDK9 in vitro. De plus, la polyubiquitination de CDK9 dans des cellules humaines est dépendante de UBR5 et TFIIS. Nous montrons aussi que UBR5, CDK9 and TFIIS co-localisent le long du gène fibrinogen (FBG) et que la surexpression de TFIIS augmente les niveaux d’occupation par CDK9 de régions spécifiques de ce gène, de façon dépendante de UBR5. Nous proposons que TFIIS a une nouvelle fonction dans la transition entre les étapes d’initiation et d’élongation transcriptionnelle, en régulant la stabilité des complexes CDK9-Pol II pendant les étapes précoces de la transcription. / Biochemical, genetic and structural studies made over the last years bring a new view on the RNA polymerase II (Pol II) machinery and the process by which it decodes the genetic information. They provided new insights into the diversity of the transcriptional regulation mechanisms, and on the role played by the general transcription factors (GTFs). The studies presented in this thesis provide new evidence on the role of human GTFs in the regulation of different stages of transcription.
In the first part of the thesis, we investigated the function of the human Pol II and GTFs in living cells, by systematically analyzing their genomic location. The location profiles obtained by chromatin immunoprecipitation (ChIP) of TAP (tandem-affinity purification) tagged versions of these factors indicate new in vivo functions for several components of this machinery, and for structural elements of the Pol II. These results suggest that TFIIF and the heterodimer Rpb4–Rpb7 have a specific function during the elongation stage in vivo. Additionally, our study offers for the first time a general picture of GTFs function during the Pol II transcription reaction in live mammalian cells, and provides a framework to uncover new regulatory hubs.
Secondly, we report on the identification of a new function of the factor TFIIS in the regulation of CDK9, the kinase subunit of the Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb). We identify two interaction partners for TFIIS, namely CDK9 and the E3 ubiquitin ligase UBR5. We show that UBR5 catalyzes the ubiquitination of CDK9 in vitro. Moreover, the polyubiquitination of CDK9 in human cells is dependent upon both UBR5 and TFIIS, and does not signal its degradation. We also show that UBR5, CDK9 and TFIIS co-localize along specific regions of the fibrinogen (FBG) gene, and that the overexpression of TFIIS increases the occupancy of CDK9 along this gene in a UBR5 dependant manner. We propose a new function of TFIIS in the transition between initiation and elongation stages, by regulating the stability of the early CDK9-Pol II transcribing complexes.
Key words: chromatin immunoprecipitation, general transcription factors, tandem-affinity purification, RNA polymerase II, Rpb4–Rpb7 heterodimer, transcription factor IIF (TFIIF), transcription factor IIS (TFIIS), UBR5 ubiquitin ligase, Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb), CDK9 ubiquitination.
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