Les cellules eucaryotes sont caractérisées par le cloisonnement des organelles par des membranes. La communication entre les différents compartiments cellulaires est assurée par deux voies de transport : le transport vésiculaire et transport non-vésiculaire. Le transport vésiculaire permet à la fois le trafic des protéines et des lipides d'un compartiment à un autre, alors que le transport non-vésiculaire permet uniquement le trafic des lipides. En effet, les lipides jouent un rôle essentiel dans l'organisation cellulaire. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé au rôle des lipides dans le trafic intracellulaire, en utilisant la levure comme organisme modèle. Dans une première partie de ma thèse, j'ai étudié les hélices amphipathiques qui permettent le ciblage des protéines vers des compartiments cellulaires spécifiques. Dans une étude précédente, réalisé au laboratoire a montré que ces hélices amphipathiques interagissaient directement avec les lipides membranaires, ce qui permet un adressage spécifique des protéines en fonction des environnements lipidiques dans la cellule. Deux hélices amphipatiques ont fait l’objet de cette étude : le motif ALPS qui cible les vésicules de la voie sécrétoire précoce, et alpha-synucléine qui reconnaît et fixe les vésicules du compartiment trans-Golgi-membrane plasmique. Dans cette première partie de la thèse j’ai cherché à identifier des motifs similaires à celui d’alpha-synucléine dans les protéines de levure, et de déterminer leurs rôles dans la cellule. Dans une seconde partie de ma thèse, en collaboration avec le laboratoire du Dr Thierry Galli, j'ai étudié de nouveaux composants impliqués dans le métabolisme lipidique aux sites de contact entre le réticulum endoplasmique et la membrane plasmique. Les sites de contact membranaires sont des régions de proches appositions (de l'ordre de 10 à 30 nm) entre deux membranes, généralement entre la membrane du réticulum endoplasmique (RE) et une autre organelle. Ce sont principalement des sites de transfert des lipides et d'ions. Maja Petkovic dans le laboratoire de Thierry Galli a fait la découverte que la protéine SNARE du RE, Sec22, interagit avec une syntaxine (Stx1) de la membrane plasmique dans les neurones, ce qui permet un nouveau mécanisme de contact entre ces deux membranes. J’ai donc essayé de voir si ce mécanisme est conservé chez la levure. Les résultats que j'ai obtenus ont confirmé que la levure Sec22 est capable d'interagir avec une protéine SNARE SSO1 localisée à la membrane plasmatique et homologue de Stx1. J'ai trouvé par co-immunoprecipitation que Sec22 et SSO1 deux interagissent avec les protéines de transfert des lipides localisées aux sites de contact. L'utilisation d'une sonde spécifique au Phosphatidylinositol-4 phosphate (PI4P), nous a permis de montrer que Sec22 est impliquée dans la régulation du niveau de PI4P à la membrane plasmique. Pour disséquer les deux fonctions de Sec22, dans la voie sécrétoire et aux sites de contact, nous avons utilisé l'approche des suppresseurs multicopies dans la levure. Parmi les suppresseurs identifiés, nous avons trouvé le Sfh1, une protéine qui a un rôle potentiel dans le transfert des lipides. Ces résultats confirment bien ceux obtenus par l’équipe de Thierry Galli, montrant que Sec22 a un nouveau rôle aux sites de contact entre le RE et la membrane plasmique et suggèrent que ce complexe SNARE pourrait être impliqué dans transfert de lipides chez la levure. / Eukaryotic cells are characterized by their internal membrane compartmentalization, with the various specialized organelles of the cell bounded by lipid membranes. Communication between different cellular compartments occurs via two transport pathways: vesicular transport and non-vesicular transport. Vesicular transport carries both proteins and lipids from one compartment to another in cells, whereas non-vesicular transport carries only lipids. An emerging idea is the important role that lipids play in cellular organization. Lipid binding amphipathic helices such as the ALPS (amphipathic lipid packing sensor) motif are targeted to membranes of a specific lipid composition, and hence act to transfer information encoded in membrane lipids to the vesicle trafficking machinery. The lipid composition of the membranes of different organelles is therefore of great importance. One mechanism that cells use to maintain the distinct lipid compositions of organelles is lipid transport, which occurs preferentially at membrane contact sites (MCS). MCS are regions of close appositions, on the order of 10 to 30 nm, between two membranes, generally between the membrane of the endoplasmic reticulum (ER) and another organelle. In my thesis, I addressed two aspects of how lipids and their transport function in intracellular trafficking, using yeast as a model system. First, I studied amphipathic motifs that mediate targeting of proteins to specific compartments in cells. Lipid binding amphipathic helices were shown in a previous study in the laboratory to mediate specific targeting to distinct lipid environments via direct protein-lipid interactions, both in vitro and in cells. One of these, the ALPS motif, targets vesicles of the early secretory pathway. The other, alpha-synuclein, targets vesicles travelling between the late Golgi, the plasma membrane and endosomes. I studied new potential alpha-synuclein-like motifs in yeast proteins, and their roles in cells. In a second project, in collaboration with the laboratory of Dr. Thierry Galli, I studied new compenents involved in lipid metabolism at contact sites between the endoplasmic reticulum and the plasma membrane. Maja Petkovic in the laboratory of Thierry Galli made the important discovery that the ER-localized SNARE protein Sec22 interacts with a plasma membrane syntaxin in neurons, thus providing a novel mechanism for mediating close contact between these two membranes. I addressed the question of whether this mechanism is conserved in yeast. The results I obtained confirmed that yeast Sec22 is able to interact with a SNARE protein localized to the plasma membrane, Sso1. I found by co-immunoprecitation that Sec22 and Sso1 both interact with lipid transfer proteins localized to ER-plasma membrane contact sites. Using a specific probe for phosphatidylinositol-4 phosphate (PI4P), we showed that Sec22 was involved in regulating the level of PI4P at the plasma membrane. These results extend to yeast those obtained by Maja Petkovic, Thierry Galli and colleauges showing that Sec22 has a novel role at ER-plasma membrane contact sites, and suggest that this SNARE complex might be implicated in lipid transfer at these sites in yeast.

La LTP1 extraite de feuille de Nicotiana tabacum, nommée LTP1_1, a été produite dans Pichia pastoris. Nous avons ainsi déterminé sa structure tridimensionnelle par RMN 2D, 3D et modélisation moléculaire. Différentes études d'interaction et de dynamique ont ensuite mis en évidence des propriétés de fixation particulières comparativement aux autres LTPs. Ces travaux ont servi de base à la détermination de structures d'autres LTP1 de tabac par modélisation comparative et à des simulations de dynamique moléculaire à température ambiante et à haute température. De plus, nous avons cartographié la cavité hydrophobe de la LTP1_1 en utilisant la RMN du xénon hyperpolarisé.<br />L'ensemble de ces travaux a permis d'identifier les acides aminés impliqués spécifiquement dans la fixation des lipides. Nous avons découvert que les propriétés remarquables de fixation des LTP1 sont liées non seulement à leur structure originale mais également à leur dynamique particulière.

La cuticule est une couche hydrophobe déposée à la surface des organes aériens des plantes terrestres. Elle joue de nombreux rôles allant de la résistance face à divers stress biotiques et abiotiques à son implication dans divers processus de développement. Bien que la compréhension de la biosynthèse des composés cuticulaires a considérablement augmenté ces dernières années, les mécanismes de transport de ces lipides cuticulaires à travers la paroi et d'assemblage au sein de la cuticule, sont encore peu caractérisés. Les nsLTPs (non-specific Lipid Transfer Protein), sont codées par une famille multigénique impliquée dans de nombreuses fonctions biologiques. Parmi les rôles proposés pour les nsLTPs, il est supposé depuis longtemps qu'elles pourraient transporter les précurseurs cuticulaires à travers la paroi et ainsi contribuer à la formation de la cuticule. Dans ce travail de thèse, nous nous sommes servis du modèle des hypocotyles étiolés d'A. thaliana afin de caractériser le fonction biologique d'AtLTP2. En effet, AtLTP2 est une protéine de transfert de lipides présente de façon abondante et est la seule représentante des nsLTPs dans le protéome pariétal des hypocotyles étiolés. Nous avons tout d'abord confirmé que l'expression d'AtLTP2 est forte dans les très jeunes stades de développement de la plantule étiolée et est restreinte aux cellules de l'épiderme des organes aériens, sur lesquelles se dépose la cuticule. Conformément aux résultats de protéomique obtenus au préalable, AtLTP2 fusionnée à un marqueur fluorescent est localisée au niveau de la paroi mais également et de façon surprenante au niveau des plastes. Cette remarquable double localisation d'une nsLTP dans la paroi et dans les plastes n'a à ce jour, jamais été décrite. De plus, le mode de transport d'AtLTP2 vers les plastes est particulièrement original puisque la protéine emprunte d'abord la voie de sécrétion avant d'être finalement adressée aux plastes. En analysant l'adressage de différentes versions d'AtLTP2 tronquée, nous avons pu montrer que c'est certainement sa conformation tertiaire qui est cruciale pour sa localisation plastidiale. Par des approches de génétique inverse, nous avons pu montrer que les mutants atltp2 présentaient une augmentation importante de la perméabilité de sa cuticule fortement corrélée à une ultrastructure de l'interface cuticule-paroi très perturbée alors qu'aucun changement dans la composition biochimique de la cuticule n'a été détecté. Ces résultats nous ont permis de proposer un nouveau rôle structural pour AtLTP2, elle interviendrait pour maintenir l'adhésion des deux couches que sont la cuticule hydrophobe et la paroi hydrophile. Ainsi, en maintenant l'intégrité de l'interface entre la cuticule et la paroi, AtLTP2 participerait au maintien de la fonction de barrière cuticulaire limitant les pertes d'eau. De façon intéressante, la double localisation d'AtLTP2 dans la paroi et les plastes nous laisse supposer que d'autres fonctions pourraient être assignées à AtLTP2. L'identification des mécanismes moléculaires mis en jeu dans le maintien de l'homéostasie cuticule-paroi et dans la double localisation d'AtLTP2 constituera un challenge pour de futures recherches visant à toujours mieux identifier les acteurs de la formation de cette barrière protectrice, la cuticule. / The cuticle is a hydrophobic layer that covers the surface of the aerial organs of land plants. The cuticle plays numerous roles in plants from resistance against biotic and abiotic stresses to several developmental processes. Although the understanding of the biosynthesis of cuticle has considerably increased last years, the mechanisms underlying the transport of cuticular lipids through the cell wall and their assembly within the cuticle have been poorly characterized. nsLTPs (non-specific Lipid Transfer Proteins) are encoded by a multigenic family in A. thaliana and are involved in several biological processes. Among the different roles proposed for nsLTPs, it has long been suggested that they could transport cuticular precursor across the cell wall and then could contribute to the cuticle formation, despite the absence of formal evidence for individual members. Here we took advantage of the A. thaliana etiolated hypocotyls model to characterize the biological function of AtLTP2. Indeed, AtLTP2 was found to be abundant and the unique nsLTP member in the cell wall proteome of etiolated hypocotyls. We have first confirmed the high level of AtLTP2 expression during the young developmental stages of etiolated seedlings that was restricted to the epidermal cells of aerial organs, that are covered by the cuticle. In agreement with the cell wall localization determined by previous proteomic studies, we localized AtLTP2 fused to a fluorescent marker to the cell wall, but also and surprisingly to the plastids. This remarkable dual localization in the cell wall and plastids was never described before for a nsLTP. Furthermore, the mechanism of AtLTP2 transport to the plastids was particularly original because AtLTP2 can first undergo import into the ER/ secretory pathway and then sorting to the cell wall and the plastids. By studying the sub-cellular localization of truncated version of AtLTP2, we have shown that its tertiary conformation was crucial for the plastidial localization. By using reverse genetic approaches, we have shown that atltp2 mutants displayed a high increase in cuticle permeability strongly correlated with a deep modification of the ultra-structure at the cuticle-cell wall interface, while no changes in biochemical composition of the cuticle were detected. These results prompt us to suggest a novel structural role for AtLTP2. AtLTP2 could be involved in maintaining the accurate sealing between the hydrophobic cuticle and the hydrophilic underlying cell wall. Then, by preserving the integrity of the cuticle-cell wall interface, AtLTP2 could act on the barrier function of the cuticle limiting water loss. Interestingly, the dual localization to the cell wall and plastids suggested that other functions could be assigned to AtLTP2. The elucidation of the molecular mechanisms by which AtLTP2 establish cell wall-cuticle homeostasis and the exact function of the dual targeting will be challenging tasks in the future to better identify the main actors of the formation of the cuticle.

La protéine OSBP est un transporteur de lipides qui régule la distribution cellulaire du cholestérol. OSBP comprend un domaine PH, deux séquences « coiled coil », un motif FFAT (deux phénylalanines dans un environement acide), et un domaine de liaison de lipides (ORD) à son extrémité C-terminale. Le domaine PH interagit avec le PI(4)P et la petite protéine G Arf1-GTP au niveau du Golgi, alors que le motif FFAT interagit avec la protéine VAP-A, résidente du réticulum endoplasmique (RE). En liant simultanément tous ces déterminants, OSBP stabilise des sites de contact membranaire entre RE et Golgi, permettant ainsi un contre-échange cholestérol / PI(4)P par l'ORD. OSBP contient également une longue séquence N-terminale d’environ 80 aa, intrinsèquement désordonnée, composée principalement de glycine, proline et d'alanine. Nous démontrons que la présence de ce N-terminus désordonné augmente le rayon de Stoke de OSBP tronquée du domaine ORD, et limite sa densité d’association sur la membrane portant le PI(4)P. La protéine dépourvue du N terminus favorise l'agrégation symétrique des liposomes PI(4)P (mimant la membrane du Golgi) par les deux domaines PH du dimère OSBP, alors que la présence de la séquence désordonnée empêche cette association symétrique. De même, nous observons que la distribution d’OSBP sur la membrane de vésicules unilamellaires géantes (GUV) varie selon la présence ou l'absence du N-terminus. En présence de la séquence désordonnée, la protéine est répartie de manière homogène sur toute la surface du GUV, alors que la protéine sans N-terminal a tendance à s'accumuler à l'interface entre deux GUV de type Golgi. Cette accumulation locale ralentit fortement la mobilité de la protéine à l’interface. Un effet similaire du N-terminal sur la dynamique des protéines est observé lorsque l’association de membranes de type ER et Golgi est assuré par des protéines monomériques (dépourvue du coiled coil) en présence de Vap-A. Les résultats de nos expériences in vitro ont été confirmés en cellules vivantes, où la séquence intrinsèquement désordonnée contrôle le recrutement d’OSBP sur les membranes Golgiennes, sa mobilité et sa dynamique d’activité au cours des cycles de transfert de lipides. La plupart des protéines de la famille d’OSBP contiennent des séquences N-terminales de faible complexité, suggérant un mécanisme général de régulation. / Oxysterol binding protein (OSBP) is a lipid transfer protein that regulates cholesterol distribution in cell membranes. OSBP consists of a pleckstrin homology (PH) domain, two coiled-coils, a “two phenylalanines in acidic tract” (FFAT) motif and a C-terminal lipid binding OSBP-Related Domain (ORD). The PH domain recognizes PI(4)P and small G protein Arf1-GTP at the Golgi, whereas the FFAT motif interacts with the ER-resident protein VAP-A. By binding all these determinants simultaneously, OSBP creates membrane contact sites between ER and Golgi, allowing the counter-transport of cholesterol and PI(4)P by the ORD. OSBP also contains an intrinsically disordered ~80 aa long N-terminal sequence, composed mostly of glycine, proline and alanine. We demonstrate that the presence of disordered N-terminus increases the Stoke’s radius of OSBP truncated proteins and limits their density and saturation level on PI(4)P-containing membrane. The N-terminus also prevents the two PH domains of OSBP dimer to symmetrically tether two PI(4)P-containing (Golgi-like) liposomes, whereas protein lacking the disordered sequence promotes symmetrical liposome aggregation. Similarly, we observe a difference in OSBP membrane distribution on tethered giant unilamellar vesicles (GUVs), based on the presence/absence of N-terminus. Protein with disordered sequence is homogeneously distributed all over the GUV surface, whereas protein without N-terminus tends to accumulate at the interface between two PI(4)P-containing GUVs. This protein accumulation leads to local overcrowding, which is reflected by slow in-plane diffusion. The effect of N-terminus is also manifested in monomeric OSBPderived proteins that tether ER-like and Golgi-like membranes in the presence of VAP-A. Findings from our in vitro experiments are confirmed in living cells, where N-terminus controls the recruitment of OSBP on Golgi membranes, its motility and the on-and-off dynamics during lipid transfer cycles. Most OSBP-related proteins contain low complexity N-terminal sequences, suggesting a general effect.