Hohenheim, Univ., Diss., 2004.

Zugl.: Tübingen, Univ., Diss., 2008

Techn. Univ., Diss., 2009--München.

Univ., Diss., 2010--Kassel.

University, Diss., 2007--Würzburg.

Techn. Hochsch., Diss., 2004--Aachen.

Techn. Hochsch., Diss., 2004--Aachen.

Universiẗat, Diss., 2004--Köln.

A pesar de los enormes beneficios potenciales que ofrecen los cítricos genéticamente modificados (GM), su liberación en campo suscita preocupaciones acerca de su potencial impacto ambiental y posibilidad de que muestren efectos deletéreos inesperados desde un punto de vista agronómico. Las principales preocupaciones que plantea el uso de la transformación genética para la mejora de este cultivo de vida larga, propagación vegetativa y compleja biología reproductiva son: (1) la transferencia de los transgenes vía polen a variedades compatibles de especies de Citrus y afines; (2) la estabilidad de los transgenes a largo plazo; (3) la aparición de efectos pleiotrópicos adversos derivados de la integración y la expresión de los transgenes sobre las principales características agronómicas y fenotípicas del cultivo. Todas estas cuestiones han sido ampliamente estudiadas en otros cultivos anuales GM que ya son o no comerciales. Sin embargo, puesto que el empleo de la transformación genética en la mejora de árboles frutales todavía se encuentra en sus inicios, actualmente se dispone de muy poca información al respecto para estos cultivos. Por todo ello, el futuro de los arboles transgénicos en el ámbito comercial permanece aún incierto, aunque actualmente se dispone de la tecnología para producirlos. Por otro lado, en el caso concreto de los cítricos, no existen variedades transgénicas comerciales ni evidencias inequívocas de que esta herramienta sea realmente útil para afrontar con éxito objetivos de mejora concretos. Lograr cumplir objetivos de mejora tan importantes como la mejora de la calidad nutri-funcional de los frutos cítricos mediante ingeniería genética podría contribuir a una mayor aceptación de esta tecnología por parte del público, puesto que se trata de una mejora dirigida primeramente al consumidor. En este trabajo nos hemos planteado afrontar parte de los aspectos que en gran medida limitan la aceptación y comercialización de cítricos GM, mediante (1) la realización de un experimento de campo con cítricos GM para evaluar su seguridad ambiental y la ausencia de efectos agronómicos adversos (2) el abordaje de un objetivo de mejora de la calidad nutri-funcional de la naranja concreto mediante ingeniería metabólica con la finalidad de reforzar sus propiedades saludables. El experimento de campo consistió en una plantación de cítricos transgénicos que portaban únicamente los genes marcadores uidA y nptII cuya finalidad fue estudiar la viabilidad de la transformación genética en la mejora de genotipos cítricos comercialmente importantes. Este huerto experimental nos sirvió para estimar la frecuencia máxima de dispersión de los transgenes por polen bajo condiciones de polinización abierta y estudiar los factores ambientales, genéticos y fenológicos que la determinan, para así poder proponer medidas de contención apropiadas en futuras plantaciones de cítricos GM. También sirvió como primera aproximación para abordar cuestiones básicas como el estudio de la estabilidad de la expresión de los transgenes a largo plazo (tras 7 años de establecimiento en campo) bajo condiciones reales de cultivo y su potencial impacto sobre la morfología, fenología y calidad de la fruta de los cítricos transgénicos. Los estudios realizados, aunque no resuelven todas las preocupaciones concernientes a los cítricos GM, aportan información crucial relativa a su seguridad y comportamiento en campo, inexistente hasta el momento, que puede servir como base para futuros ensayos de campo con cítricos GM y como guía para las políticas de regulación de su plantación (caso-a-caso). Por otro lado, en este trabajo se ha logrado desarrollar una estrategia para inducir producción temprana de fruta e incrementar el contenido de b-caroteno (pro-vitamina A, con elevada capacidad antioxidante) en la pulpa de una variedad de naranjo dulce mediante ingeniería metabólica. Dicha estrategia consistió en el silenciamiento mediado por RNAi del gen de una β-caroteno hidroxilasa de naranjo (CsβCHX), implicada en la conversión de b-caroteno en xantofilas, combinado con la sobreexpresión del gen FLOWERING LOCUS T de naranjo (CsFT) en plantas transgénicas juveniles de naranjo dulce cv Pineapple. Posteriores ensayos con el animal modelo Caenorhabditis elegans demostraron que la naranjas enriquecidas ejercían un efecto antioxidante in vivo un 20% mayor que las naranjas control isogénicas. Este es el primer ejemplo exitoso de ingeniería metabólica para incrementar el contenido de β-caroteno (o cualquier fitonutriente) en naranjas y demuestra el potencial que tiene la ingeniería genética para el enriquecimiento nutricional de cultivos frutales leñosos. / Pons Bayarri, EA. (2014). Towards application of genetic engineering in citriculture: 1) assessing dispersal, long-term stability and phenotypic impact of transgenes in citrus trees and 2) improving nutri-functional quality of orange fruit through metabolic engineering [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/43588 / TESIS

The aim of the present study was to design different dosage forms as carrier systems to deliver sorafenib to the lung of BXB-23 transgenic mice using different routes of administration. Three dosage forms were used one of them was an oil-in-water emulsion and the oral route was chosen for this experiment. The other delivery system was a liposome preparation for intratracheal instillation. In this case the oral route was considered as a control experiment. The last dosage form was PLGA microspheres. Before sorafenib administration it was important to develop a HPLC method to assess sorafenib absorption after its administration and to determine its concentrations in mouse serum. The HPLC method allowed sorafenib quantification in small volumes (30 µl) of mouse serum and tissues. The developed HPLC method was validated resulting in satisfactory selectivity, good linearity, good accuracy and precision over the concentration range examined. Sorafenib was successfully incorporated in a fat emulsion (o/w) using a traditional method resulting in a white homogenous emulsion and no particle aggregation was observed. Sorafenib exhibited antitumor activity on the lung adenoma in BXB-23 transgenic mice when administered orally (2 mg sorafenib per mouse) in the emulsion preparation. The determined effect was an approximately 29 % reduction in the tumor area of the adenoma foci and a proliferation reduction. In order to improve the pharmacological effects of sorafenib on the lung adenoma in BXB-23 mice, the targeting of sorafenib directly to the site of action (the lung) was an attractive concept. For this purpose the intratracheal route was used. Since sorafenib administration by instillation required incorporation of sorafenib in a dosage form suitable for its lipophilic nature, a liposome suspension was the second dosage form used. A lyophilization method was employed for sorafenib liposome preparation utilizing dilauroylphosphatidylcholine (DLPC) which is safe and tolerable for the lung. Incorporation of sorafenib in the liposomes did not influence the particle size and its distribution. The sorafenib liposomes showed high encapsulation efficiency, good stability at 4 °C for one month and satisfactory in vitro release properties and inhibited Raf-1 mediated activation of ERK in cell culture assay. In a pharmacokinetic experiment sorafenib loaded liposomes were instilled directly into the lung. The results revealed that a significant level of sorafenib was achieved in the lung tissues after 2 hours and then reduced after 48 h and remained nearly constant for one week. On the other hand, only traces of sorafenib were found in the mice serum up to 48 h. Subsequently, the pharmacological activity of sorafenib (1 mg per mouse) was studied when delivered in a liposomal suspension intratracheally to treat the lung adenoma of BXB-23 mice. The data of this experiment demonstrated that sorafenib intratracheal instillation resulted in a reduction of tumor area of adenoma foci (67 %) and an elevation of the percent of apoptotic cells. In contrast, prolongation of the treatment period did not further enhance sorafenib activity on the lung adenoma. This previous finding suggested a development of multidrug resistance (MDR) by the adenoma foci cells against sorafenib instillation, which was examined by immunohistochemistry staining. The percent of MDR positive cells was higher after two and three weeks sorafenib liposome instillation treatment than that after one week treatment. The last dosage form used for sorafenib was microspheres, which were prepared by emulsion-diffusion-evaporation method using biodegradable PLGA 50:50 resulting in a white lyophilized powder. The system was characterized physicochemically and revealed a good microspheres yield, high encapsulation efficiency, a homogenous particle size distribution and slow in vitro release of sorafenib. The other strategy studied in the present research project was gene delivery to target the lung bearing tumor of BXB-23 mice using a non-viral vector (polyethylenimine). Polyethylenimine (PEI) was used to investigate its efficiency in transfecting lung bearing tumor of BXB-23 mice model and its ability to transfect the adenoma foci cells. LacZ, which encodes Beta-galactosidase was used in the present study as a reporter gene and was complexed with PEI before delivered intravenously. A high LacZ expression in the alveolar region with some expression in the adenoma foci was observed. On contrary, a low LacZ expression in the alveoli and in the adenoma foci was achieved after instillation of the same polyplex intratracheally. / Das Ziel der vorliegenden Dissertation war es, verschiedene galenische Darreichungsformen als Trägersystem für Sorafenib zu entwickeln, um den direkten Transport des Arzneistoffes zum Zielorgan Lunge von BXB-23 transgenen Mäusen zu ermöglichen. Für die verschiedenen Applikationswege wurden drei Darreichungsformen gewählt. Eine Öl-in-Wasser-Emulsion sollte oral verabreicht werden. Für die intratracheale Instillation wurde ein liposomales Präparat gewählt. Die letzte Darreichungsform stellten PLGA Mikrosphären dar. Um die Absorption von Sorafenib nach Administration bestimmen zu können, wurde die Konzentration des Arzneistoffes im Mäuseserum gemessen. Zur Quantifizierung von Sorafenib in einem geringen Volumen Serum und in Gewebe wurde eine HPLC-Methode entwickelt und validiert. Sorafenib wurde erfolgreich in eine Fettemulsion (o/w) mittels einer traditionellen Methode eingearbeitet. Nach oraler Verabreichung der Emulsion (2 mg/Maus) zeigte Sorafenib auf Lungenadenome eine Antitumor-Aktivität, wobei eine Reduktion der Tumorfläche der Adenomfoci um etwa 29 % und eine Reduktion der Proliferation verzeichnet werden konnte. Zur Verbesserung der pharmakologischen Effekte von Sorafenib auf die Lungenadenome in BXB-23 Mäusen zu verbessern, sollte Sorafenib direkt dem Zielorgan Lunge zugeführt werden. Zu diesem Zweck wurde der intratracheale Administrationsweg gewählt. Da die Instillation von Sorafenibaufgrund seiner lipophilen Natur nur durch Einschluß in eine andere Darreichungsform zu erreichen ist, wurde für die zweite Darreichungsform eine Liposomen-Suspension verwendet. Für die Zubereitung von Sorafenib in Liposomen wurde eine Lyophilisierungsmethode unter Verwendung von DPLC erarbeitet. Die Einschluss-Effektivität der Sorafenib-beladenen Liposomen war hoch und zeigte bei 4°C eine gute Stabilität für einen Monat. Die erzielten Effekte bei der in vitro Freisetzung und die Hemmung der von Raf1-induzierten Aktivierung von ERK in Zellkulturexperimenten lieferten zufrieden stellende Ergebnisse. In einem pharmakokinetischen Experiment wurden mit Sorafenib beladenen Liposomen direkt in die Lunge appliziert. Die Ergebnisse zeigten, dass nach 2 h eine signifikante Konzentration von Sorafenib im Lungengewebe erreicht wurde. Nach 48 h nahm diese Konzentration ab und blieb dann für eine Woche fast konstant. Andererseits wurden bis zu 48 h nach Gabe des Arzneistoffes nur Spuren von Sorafenib im Mäuseserum gefunden. Folglich wurde die pharmakologische Aktivität von Sorafenib (1 mg/Maus) bei intratrachealer Verabreichung in einer liposomalen Suspension untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die intratracheale Gabe von Sorafenib eine Reduktion der Tumorfläche der Adenomfoci um 67 % bewirkte, sowie eine Erhöhung des prozentualen Anteils apoptotischer Zellen. Eine Verlängerung der Behandlungszeit zeigte keine zusätzliche Verbesserung der Effekte. Dies lies vermuten, dass hier eine Entwicklung von Multidrug-Resistenz in den Adenomfocizellen gegenüber der Instillation von Sorafenib erfolgte. Dies wurde in immunochemischen Anfärbe-Experimenten untersucht. Die Prozentzahl von MDR-positiven Zellen war nach zwei und drei Wochen Instillation von Sorafenib-Liposomen höher als nach einer Woche. Die letzte verwendete Darreichungsform für Sorafenib waren Mikrosphären, die durch Emulsions-Diffusions-Evaporations-Methoden in biologisch abbaubarem PLGA 50:50 hergestellt wurden. Dies ergab ein weißes, lyophilisiertes Pulver. Das System wurde physiochemisch charakterisiert und ergab ein gutes Mikrosphären-Ergebnis, hohe Einschluss-Effektivität, eine homogene Verteilung der Partikelgrößen und eine langsame in vitro Freisetzung von Sorafenib. Die andere untersuchte Strategie war Gen-Delivery, um den Lungentumor von BXB-23 Mäusen mittels eines nicht-viralen Vektors (Polyethylenimin, PEI) anzuzielen. PEI wurde verwendet, um die Effektivität der Transfektion des Lungentumors zu untersuchen und seine Fähigkeit, die Adenomfocizellen zu transfizieren. LacZ, das Beta-Galactosidase codiert, diente bei diesem Experiment als Reportergen und wurde vor intravenöser Gabe mit PEI komplexiert. Eine hohe LacZ-Expression in der alveolaren Region, aber nur eine geringe Expression in den Adenomfoci wurde beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde eine geringe Expression von LacZ in den Alveolen und den Adenomfoci nach intratrachealer Instillation des gleichen Polyplex erreicht.