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Studien zum Metabolismus von Pestiziden und Xenobiotika durch humane Cytochrom-P450-Monooxygenasen in transgenen Tabakzellkulturen

Bode, Maren. Unknown Date (has links) (PDF)
Techn. Hochsch., Diss., 2004--Aachen.
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Molecular and physiological characterization of transgenic Arabidopsis plants expressing different aldehyde dehydrogenase (ALDH) genes

Kotchoni, Oloni Simeon. Unknown Date (has links) (PDF)
University, Diss., 2004--Bonn.
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Wirkung von Ernterückständen transgener Pflanzen auf die mikrobielle C- und N-Transformation in landwirtschaftlich genutzten Böden am Beispiel von Bt-Mais

Roose, Katja. Unknown Date (has links)
Universiẗat, Diss., 2006--Kassel.
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Untersuchungen zu biochemischen und morphologischen Veränderungen im Hirn der transgenen Maus Tg2576 mit beta-Amyloidplaque-Pathologie

Klingner, Margrit 13 December 2004 (has links)
Die Alzheimersche Erkrankung (AD) ist die häufigste Demenzerkrankung bei älteren Menschen in den westlichen Industriestaaten mit ständig wachsender Zahl der Erkrankten. Trotz angestrengter wissenschaftlicher und medizinischer Forschung ist u. a. noch keine Möglichkeit der klinischen Frühdiagnose dieser Erkrankung etabliert. In der vorliegenden Arbeit wurden am transgenen Mausmodell Tg2576 mit beta-Amyloidplaque-Pathologie cholinerge und adrenerge Parameter sowie Einfluss-größen des Energiestoffwechsels untersucht, um transgen-induzierte neuro-chemische bzw. neuromorphologische Veränderungen im Hirngewebe zu erkennen. Außerdem sollte die Möglichkeit einer ex vivo Markierung solcher Moleküle getestet werden, von denen eine besondere Bindungsaffinität an beta-Amyloidablagerungen bereits bekannt ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, diese Mauslinie weiterhin hinsichtlich ihres Modellcharakters für die Alzheimersche Erkrankung zu beschreiben und potenzielle Plaque-assoziierte Markermoleküle aufzufinden, die einen in vivo Nachweis der b-Amyloidablagerungen erlauben. Die so gewonnenen Erkenntnisse könnten zur Entwicklung neuer Strategien zur Frühdiagnostik der Alzheimerschen Erkrankung beitragen. Genutzt wurden dazu v. a. die biochemischen Methoden der Rezeptorautoradiografie und der Immunhistochemie sowie der in situ Hybridisierung als molekularbiologische Methode. Weiterhin wurde eine radiochemische Methode zur ex vivo Darstellung der Azetylcholinesterase getestet. Bei der Untersuchung des cholinergen Systems konnte eine signifikante Verringerung in der [3H]Hemicholinium-3-Bindung (als Marker des hoch affinen Cholintransporters) bei den fünf Monate alten transgenen Mäusen im Vergleich zu deren nicht transgenen Wurfgeschwistern festgestellt werden. Es wird hier von einem modulatorischen Effekt des löslichen beta-Amyloids ausgegangen, da die jüngeren Tiere noch keine Plaqueablagerungen aufweisen, die Ursache solcher Veränderungen sein könnten. Beim vesikulären Azetylcholintransposter (VAChT) konnte eine signifikante Erhöhung in der [3H]Vesamicol-Bindung bei 17 Monate alten transgenen Mäusen im Vergleich zu nicht transgenen Geschwistertieren beobachtet werden, obwohl der gegenteilige Fall erwartet wurde. Das Ergebnis wird als Ausdruck einer erhöhten Vesikeldichte interpretiert. Die immunhistochemische Untersuchung der a4- und a7-Untereinheiten der nikoti-nischen Azetylcholinrezeptoren ergab, dass die beta-Amyloidplaqueablagerung keinen Einfluss auf morphologische Veränderungen der Neuronen hatte, die diese Rezep-toren tragen. Es gab keine Hinweise, dass solche Neuronen degenerieren. Hinsichtlich der untersuchten Parameter des Glukosestoffwechsels konnten keine Veränderungen zwischen transgenen Tieren und nicht transgenen Wurfgeschwistern festgestellt werden. Bei der Verteilung der Hirnkapillaren konnte eine verringerte Dichte in unmittelbarer Umgebung der b-Amyloidplaques, verglichen mit weiter entfernt liegenden Gebieten, ermittelt werden. Dieser Befund bedarf weiterer Unter-suchungen, da er Relevanz für die in vivo Diagnostik und Therapie besitzen könnte. Im Vergleich mit den zwar oft nicht einheitlichen Befunden bei Alzheimerpatienten wird deutlich, dass das Mausmodell Tg2576 als Modell der Alzheimerschen Erkrankung nicht alle Aspekte der Pathogenese simuliert. Übereinstimmungen ergeben sich bei dieser transgenen Maus hinsichtlich der beta-Amyloidproduktion und -ablagerung im Hirn und den auch beim Menschen vorkommenden entzündlichen Reaktion um die Plaques. Damit kann sie als geeignetes Modell zum Studium der Amyloidogenese und damit verbundener inflammatorischer Prozesse angesehen werden. / Alzheimer´s Disease (AD) is the most common form of dementia among the elderly in the Western world, with growing prevalence. In spite of intensive scientific and medical research, no possibility of early clinical diagnosis for this disease has yet been established. In this thesis cholinergic and adrenergic parameters, as well as energy metabolism, were studied in the transgenic mouse model Tg2576, to reveal transgene-induced neurochemical and neuromorphological changes in the brain tissue of these animals. Also, the ex vivo labelling of marker molecules with a known high affinity for beta-amyloid was to be tested. The objective was to further characterize the Tg2576 mouse strain as a model of AD, and to find plaque-associated marker molecules which could be used for the in vivo detection of b-amyloid plaques. Such findings could contribute to the development of new stategies for the early diagnosis of AD. Quantitative receptor autoradiography, immunohistochemistry and in situ hybridization were the main biochemical and molecular biological methods employed. Furthermore, a radiochemical method was used for ex vivo labelling of acetylcholinesterase. The 5 month-old transgenic mice, with no significant plaque load, demonstrated reduced [3H]hemicholinium-3 binding to choline uptake sites in anterior brain regions, as compared to non-transgenic littermates. This provides evidence of the modulatory effect of soluble beta-amyloid on high affinity choline uptake sites. However, a significant increase of [3H]vesamicol receptor binding to the vesicular acetylcholine transporter was detected in 17 month-old transgenic animals, as compared to non-transgenic mice. Even though the opposite was expected, the result could be interpreted as an elevated vesicle density. The immunhistochemical studies of a4 and a7 subunits of the nicotinic acetylcholine receptor revealed that neurons expressing these receptors do not undergo morphological changes in close proximity to beta-amyloid plaques. There was no sign of degeneration in these neurons. Concerning the examined parameters of glucose metabolism, no changes between transgenic animals and non-transgenic littermates were detected. This observation is in accordance with the data available in the literature, but in contrast to findings in AD patients. The density of brain capillaries in close vicinity of beta-amyloid plaques, compared to a more distant surrounding, is reduced. This finding needs further examination because it could be relevant for in vivo diagnosis and therapy. Comparing the transgenic Tg2576 mouse model to AD patients, it becomes apparent that the mouse model does not simulate all aspects of the pathogenesis of this disease. Consistent with the human disease this model is characterized by b-amyloid plaque production and deposition in the brain, as well as inflammatory processes around the plaques, which are also known in humans. Therefore, it represents a suitable model to study amyloidogenesis and inflammation.
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The Silencing of Endogenous and Exogenous Transposable Elements in Arabidopsis

Fultz, Dalen R. 03 August 2017 (has links)
No description available.
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Untersuchungen zur Kurzzeit-Regulation und Adaptation von Photosynthese und Elektronenverteilung in Chloroplasten und transgenen Kartoffelpflanzen

Holtgrefe, Simone 10 June 2003 (has links)
Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen dienten zur Identifizierung von Faktoren, die das Zusammenspiel zwischen dem photosynthetischen Elektronentransport und den Reaktionen im Stroma koordinieren. Hierzu erfolgten Manipulationen von Elektronen- und/oder Metabolit­verfügbar­keit im Chloroplasten. Als Untersuchungsmaterial dienten zunächst isolierte Spinat-Chloroplasten unter sättigendem CO2 und Pi. Durch die Herstellung transgener Kartoffelpflanzen, welche die zentralen Elektronenverteiler Fd I und FTR über- bzw. unterexprimieren, wurde die Elektronenverfügbarkeit im Chloroplasten dann dauerhaft verändert. Auswirkungen von zusätzlichen Elektronenakzeptoren auf den Chloroplastenmetabolismus Die Zugabe von verschieden „starken“ Elektronenakzeptoren zu Chloroplasten während der „steady state“-Photosynthese bei ausreichendem Lichtangebot hatte zwei Effekte zur Folge. Ein moderater Elektronenentzug (0,2 und 2 mM OAA, 0,2 mM Nitrit) beeinträchtigte ausschließlich den Aktivierungszustand der NADP-MDH, während die Aktivierungszustände von NAD(P)-GAPDH, FBPase und PRK nahezu unverändert waren. Auch qN, der stromale Metabolitgehalt und die [14CO2]-Fixierung waren nur geringfügig beeinflußt. qP hingegen war stark erhöht. Im Gegensatz dazu inhibierten Nitrit bzw. Methylviologen in höheren Konzentrationen die [14CO2]-Fixierung. Das ATP/ADP-Verhältnis stieg an und das NADPH/NADP-Verhältnis war nahezu unverändert. Eine extreme Erhöhung war im DHAP/PGA-Verhältnis und der stromalen FBP-Menge meßbar. Die Aktivierungszustände von FBPase und NADP-MDH nahmen nach Zugabe stark ab, während die Aktivierungszustände von NAD(P)-GAPDH und PRK unbeeinflußt blieben. Zusammenspiel von Elektronenangebot und Effektoren auf die Redoxmodulation von Chloroplastenenzymen Eine Veränderung im Elektronenangebot durch variierende Lichtintensitäten verdeutlichte, daß bei höheren Lichtintensitäten ein Großteil der Elektronen nicht für die CO2-Fixierung genutzt werden kann. Parallel zur Sättigung der CO2-Fixierung stiegen FBPase- und NADP-MDH-Aktivierungszustände an, während PRK und NAD(P)-GAPDH schon bei Intensitäten von 50 µE den maximalen Aktivierungszustand erreichten. Die Zugabe von Intermediaten, die positiv bzw. negativ auf den Aktivierungszustand der einzelnen Enzyme wirken, hatten wieder bei NADP-MDH und FBPase die deutlichsten Auswirkungen. Sowohl NAD(P)-GAPDH- als auch PRK-Aktivierungszustände waren nur unter Bedingungen erniedrigt, unter denen der Elektronenfluß stark herabgesetzt ist und im Stroma wenig ATP, Triosephosphate und 3PGA vorhanden sind. Demgegenüber reagiert NADP-MDH sehr sensitiv auf Umlenkung oder Erhöhung des Elektronenflusses. Im Fall der FBPase bestehen lineare Zusammenhänge zwischen FBP-Gehalt oder aktuellem Elektronendruck und dem Aktivierungszustand des Enzyms. Die an Chloroplasten erhaltenen Ergebnisse zeigen: Die Redoxmodulation im Licht spielt weder bei PRK noch bei NAD(P)-GAPDH eine herausragende Rolle. Die Bedeutung dieses grundlegenden Regulationsmechanismus liegt für beide Enzyme im Licht/Dunkel- und Dunkel/Licht-Übergang. Durch die „feed back“-Regulation der NADP-MDH durch NADP erfolgt bei diesem Enzym immer eine direkte Rückkopplung auf die Elektronenverfügbarkeit im Stroma. Aufgrund der sensitiven Reaktion auf Änderungen im NADPH/NADP-Verhältnis stellt das Enzym einen sehr guten Marker für den im Stroma vorherrschenden Elektrondruck dar. Die sensitiven Schritte im Calvin-Zyklus stellen die FBPase und die sehr ähnlich regulierte SBPase dar. Der aktivierende Effekt von FBP auf die FBPase wird durch den Elektronendruck in der Weise beeinflußt, daß eine Erhöhung der Lichtintensität in höheren Enzymaktivitäten unter vergleichbaren FBP-Konzentrationen resultieren. Bei einer Limitierung im Elektronenangebot scheint die Aktivierung dann unabhängig vom FBP-Gehalt zu sein. Restriktionen im Calvin-Zyklus, die zu einer verminderten FBP-Bereitstellung bei hohem Elektronenangebot führen, reichen für eine Aktivierung ebenfalls nicht aus. Somit stellt der aktuelle Aktivierungszustand des Enzyms einen kombinierten Effekt aus Elektronenverfügbarkeit und FBP-Gehalt dar. Manipulation der Elektronenflüsse in vivo durch Veränderugen im Fd-Gehalt Die Transformation von Kartoffelpflanzen mit dem homologen fed 1-cDNA-Klon (diese Arbeit) in „antisense“-Orientierung bewirkte eine maximal 50%ige Reduktion im Fd I-Proteingehalt. Eine weitere Reduktion im Fd I-Gehalt scheint für die Pflanze letal zu sein. Sowohl moderat supprimierte (80-100% des Wildtyp-Gehaltes) als auch stärker supprimierte Linien (50-80%) wiesen verstärkten zyklischen Elektronentransport und eine verringerte CO2-Assimilationsrate auf, zeigten aber kein Anzeichen von O2-Reduktion. Als Schutz gegen oxidativen Stress war in den „antisense“-Linien ein verminderter Elektronenfluß nachweisbar, indem die Effizienz der Lichtnutzung von PSI und PSII vermindert war. Dabei wurden zwei Strategien deutlich, die aber beide zu weniger funktionellem PS II und verringerten Quantenausbeuten führten: In den moderaten Linien war ein extremer DpH für diesen Effekt verantwortlich, während die stärker supprimierten Linien Photoinhibition zeigten. Weiterhin trat in den „antisense“-Linien eine bis zu 25%ige Reduktion im Chlorophyllgehalt bei erhöhten Chlorophyll a/b-Verhältnissen auf. Eine solche Akklimatisierung tritt bei Pflanzen auf, die an schwache Lichtintensitäten adaptiert sind und Starklicht ausgesetzt werden. Eine Überexpression des heterologen fed 1-cDNA-Klon aus Spinat in Kartoffelpflanzen hatte gegenteilige Effekte zur Folge. Die Elektronentransportketten zwischen den Photosystemen waren weniger reduziert, die Transformanten wiesen in Kurzzeitversuchen eine bis zu 10% höhere CO2-Assimilation auf und auch die Effizienz der Lichtnutzung war erhöht. Die im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen stark erhöhten Chlorophyllfluoreszenz-Endsignale deuten darauf hin, daß ein größerer Anteil stromaler Akzeptoren reduziert vorliegt. Gleichzeitig war das Chlorophyll a/b-Verhältnis erniedrigt. In Abhängigkeit von der Fd I-Menge, und im Endeffekt vermutlich durch die im Stroma verfügbare Akzeptor-Menge bedingt, erfolgt eine Erhöhung bzw. Erniedrigung von qP. Der permanent erhöhte Redoxstatus zwischen den Photosystemen scheint in den Fd I-Transformanten eine Adaptation des Chlorophyll a/b-Verhältnisses in die Richtung zu bewirken, daß im Fall der Unterexprimierer eine Anpassung in Richtung Starklicht erfolgt, während die Überexprimierer eine Schwachlichtanpassung zeigen. Ein Hinweis in diese Richtung ist die gute Korrelation zwischen qP und dem Chlorophyll a/b-Verhältnis. Isolierung von ftr a- und ftr b-cDNA-Klonen aus Kartoffel und Herstellung transgener Kartoffelpflanzen Für eine Manipulation der Elektronenflüsse in Richtung Td erfolgte eine „antisense“-Transformation mit dem ftr b-cDNA-Klon aus Kartoffelblatt (diese Arbeit). Die primären Transformanten wiesen keinen Phänotyp auf. Eine Transformation im heterologen System mit dem „antisense“-ftr b-cDNA-Klon aus Spinat erwies sich als ineffektiv. Eine Überexpression des ftr b-cDNA-Klons aus Spinat in Kartoffel war erfolgreich; Pflanzen mit Cosuppression wurden nicht gefunden. Auch erfolgte in diesen Pflanzen keine Coregulation in der Expression der FTR A-Untereineinheit. Für eine Überexpression von funktioneller FTR könnte der ftr a-cDNA-Klon aus Kartoffelblatt (diese Arbeit) zusammen mit dem ftr b-cDNA-Klon transformiert werden.
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Development of liver suction-mediated naked plasmid DNA delivery system for in vivo gene therapy / インビボ遺伝子治療を目的とした肝臓吸引に基づくプラスミド導入システムの開発

Zhang, Guangyuan 24 September 2014 (has links)
京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(薬学) / 甲第18551号 / 薬博第813号 / 新制||薬||238(附属図書館) / 31451 / 京都大学大学院薬学研究科医療薬科学専攻 / (主査)教授 橋田 充, 教授 髙倉 喜信, 教授 佐治 英郎 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Pharmaceutical Sciences / Kyoto University / DFAM
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Construction of a COL11A1 Transgene Vector

Beck, Cameron McKell 24 August 2006 (has links) (PDF)
Background: Cartilage disorders affect millions of people in the United States alone, with effects ranging from poor skeletal development and joint pain to shortened lifespan and perinatal lethality. Many of these disorders have their root in defects of collagen, type XI collagen being among the most important. A mouse model of such a type XI collagen defect is the chondrodysplasia (cho) mutant. Mice homozygous for this null mutation in the Col11a1 gene do not express the α1 chain of type XI collagen. This results in a functional knockout of type XI collagen, leading to insufficient skeletal development and perinatal lethality. Objective: 1) To construct a transgenic expression vector designed to express a human COL11A1 cDNA in a cartilage-specific manner. This transgene will be used in future studies to correct the type XI collagen defect in homozygous cho mice. 2) To place the cDNA in an in vitro expression vector to be used for in vitro transcription/translation assays. Methods and Results: Through the relatively new approach of "recombineering", the coding sequence of a human COL11A1 cDNA was constructed from two cloned cDNA fragments. A copy of the cDNA was inserted into the pcDNA3.1 expression vector for in vitro transcription/translation assays. Another copy of the cDNA was fused with a genomic mouse α-globin fragment to provide a polyadenylation signal. The resulting cDNA/α-globin segment was inserted into p1757, the expression vector to be used for future transgenic studies. p1757 contains a Col2a1 promoter, a β-globin splice sequence and a Col2a1 enhancer. The cDNA/α-globin segment was inserted between the splice sequence and the enhancer. With the cDNA in this expression cassette COL11A1 can be expressed in a chondrocyte-specific manner in transgenic studies of the cho mouse model.
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Expression Of Hepatitis C Viral Non-structural 3 Antigen In Transgenic Chloroplasts

Bhati, Anubhuti 01 January 2005 (has links)
Hepatitis C viral infection is the major cause of acute hepatitis and chronic liver disease and remains the leading cause of liver transplants (NIH). An estimated 180 million people are infected globally (WHO). There is no vaccine available to prevent hepatitis C. The treatment with antiviral drugs is expensive, accompanied with various side effects and is limited only to those at risk of developing advanced liver disease. The treatment is also effective in only about 30% to 50% of treated patients and still a high percentage of patients are resistant to therapy. Therefore, there is an urgent need for the development of effective vaccine antigens and an efficacious HCV vaccine. The non-structural 3 protein of the hepatitis C virus is a multifunctional protein of the virus required for virus polyprotein processing and replication. Vaccine antigen production via chloroplast transformation system usually results in high expression levels and eliminates the possibility of contamination with vector sequences,human or animal pathogens. The HCV NS3 antigen was expressed in the chloroplast of Nicotiana tabacum var. Petit havana and LAMD-609. The 1.9kb NS3 gene was cloned into a chloroplast expression vector, pLD-Ct containing the 16S rRNA promoter, aadA gene coding for the spectinomycin selectable marker, psbA 5' untranslated region to enhance translation in the light and 3' untranslated region for transcript stability and trnI & trnA homologous flanking sequences for site specific integration into the chloroplast genome. Chloroplast integration of the NS3 gene was first confirmed by PCR. Southern blot analysis further confirmed site-specific gene integration and homoplasmy. The NS3 protein was detected in transgenic chloroplasts by immunoblot analysis. The NS3 protein was further quantified by ELISA. Maximum expression levels of NS3 up to 2% in the total soluble protein were observed even in old leaves, upon 3-day continuous illumination. These results demonstrate successful expression of the HCV non-structural 3 antigen in transgenic tobacco chloroplasts. Animal studies to test the immunogenecity of the chloroplast derived HCV NS3 will be performed using chloroplast derived NS3 antigen.
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Expression Of Lipase From Mycobacterium Tuberculosis In Nicotiana Tobacum And Lactuca Sativa Chloroplasts

Lloyd, Bethany 01 January 2012 (has links)
Tuberculosis (TB), caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), is a global threat and the leading cause of death among individuals infected with HIV. TB treatment requires multi-drug cocktails, due to the increasing rates of drug resistance of the bacterium. With multi-drug cocktails, strains have been documented to be resistant to all major drugs in the fight against TB. Since the strains are drug resistant, it calls for an increasing need for vaccine and treatment development for the purpose of preventing and managing the disease. The most widely distributed vaccine against TB is Bacillus Calmette-Gue´rin (BCG). Apart from being ineffective in certain individuals, BCG offers only a limited timeframe of protection, is unable to serve as a booster for extending this timeframe and due to the intradermal route of administration requires costly refrigeration and syringes. LipY protein, a M. tuberculosis cell wall lipase, may play a potential role as not only a drug target but a potential vaccine antigen. LipY is known to be up-regulated during both active infection and dormancy. In a previous study, sera from TB patients had shown an IgG and IgM response against it. In this study transplastomic Lactuca sativa and Nicotiana tabacum plants were generated by transforming the chloroplasts through the particle delivery system with pLsDv-LipY and pLD-LipY vectors respectively. The vectors were flanked by the native trnI and trnA gene sequence to facilitate homologous recombination into the chloroplast genome. The vector also contained the 16S rRNA promoter, the selectable marker gene, aadA for specitinomycin resistance, the rbcL untranslated region, the LsPpsbA (PpsbA in N. tabacum) promoter, and LsTpsbA (tpsbA in N. tabacum) untranslated region. iv Site specific integration of the LipY gene into the chloroplast genome was confirmed by PCR. Homoplasmy of transplastomic plants was confirmed by Southern blot analysis. These plants showed normal growth and were fertile, producing seeds. Once germinated, these seeds did not show Mendelian segregation of the transgene. Immunoblot analysis was performed to analyze the expression of the LipY protein. A 40kDa protein was produced in E.coli, and a 25kDa protein was produced in chloroplasts; a cleaved product in chloroplasts is still valuable as an antigen for vaccine production. Future studies will include testing this chloroplast derived antigen in animal models for vaccine development.

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