Tesis para optar al grado de magister en farmacología / El cáncer de cuello uterino (CCU) es un tipo de cáncer que tiene una etiología viral. Este agente es el virus papiloma humano de alto riesgo (VPH-AR), el cual en un proceso tumoral sobreexpresa las oncoproteínas E6 y E7. Éstas últimas regulan la expresión de Pirin, que es una proteína que participa en la transición epitelial-mesenquimal (TEM) y en la migración celular. Se ha reportado que la TEM y la migración celular disminuyen en presencia del compuesto natural curcumina. Por esta razón, se propuso que dicha disminución causada por curcumina ocurre a través de un mecanismo dependiente de Pirin. Para demostrar esto, se utilizó la línea celular SiHa de CCU, con 1-2 copias integradas de VPH16. Con los ensayos de viabilidad y citotoxicidad celular (MTS) a distintos tiempos y concentraciones de curcumina se determinó que la concentración a utilizar era de 20 μM por 72 horas. Este tiempo y concentración están en concordancia con datos previamente publicados. Se analizó la expresión génica y los niveles proteicos de algunos marcadores de la TEM, con las técnicas RT-qPCR y Western Blotting, respectivamente. Para ello, en células tratadas con curcumina se extrajo ARN total y proteínas, los cuales se cuantificaron para ser utilizados en dichas técnicas. Los resultados obtenidos sugieren una disminución de la transición epitelial-mesenquimal en la línea celular SiHa expuesta a curcumina. Esto se respalda en la disminución de los niveles proteicos de N-cadherina, Vimentina y Slug en presencia de este compuesto natural. Además, se observó que la expresión de PIR y los niveles de Pirin disminuyeron en las células SiHa, al ser expuestas a curcumina. Luego, para analizar como la TEM depende de Pirin, las células SiHa utilizadas fueron transfectadas transientemente con un ARN interferente pequeño (ARNip) para el knockdown de PIR. Se observó un aumento significativo de transcritos de E-cadherina y una disminución significativa de N-cadherina en presencia del interferente. Además, se evidenció una disminución similar en la combinación del interferente con curcumina. Finalmente, se realizó un ensayo fenotípico de migración celular observándose una disminución significativa en presencia de este compuesto natural. La conclusión de esta tesis es que la disminución de la TEM inducida por curcumina, en este modelo experimental, ocurre por un mecanismo dependiente de Pirin. Se requieren experimentos adicionales para confirmar dicho mecanismo. La proteína Pirin podría ser un importante blanco farmacológico en el tratamiento del cáncer de cuello uterino. / Cervical cancer (CCU) has a viral etiology and it is induced by high-risk human papilloma virus (HR-HPV) that in turn, overexpresses E6 and E7 oncoproteins. These viral proteins regulate the expression of Pirin, which is a protein that participates in the epithelial-mesenchymal transition (EMT) and cell migration. It has been reported that EMT and cell migration decrease in the presence of the natural compound curcumin. For this reason, it was proposed in this thesis that such decrease is caused by curcumin through a Pirin-dependent mechanism. To demonstrate this statement, SiHa cell line derived from cervical cancer was used since it contains 1-2 integrated copies of HPV16. Viability and cytotoxicity cell tests (MTS) were used to determine curcumin dose and exposures times. Results indicated a significant decrease in EMT after exposure to 20 μM curcumin for 72 hours in SiHa cell line. This is supported by a decrease in the protein levels of N-cadherin, Vimentin and Slug in the presence of curcumin. Furthermore, it was observed that PIR expression and Pirin protein levels significantly decreased in SiHa cells when exposed to curcumin. Then, to analyze if EMT depends on Pirin, SiHa cells were transfected with a small interfering RNA (siRNA) for the silencing of PIR. It was observed a significant increase of E-cadherin transcripts and a significant decrease of N-cadherin proteins levels in the presence of the siRNA. In addition, a similar decrease in the combination of the interferer with curcumin was evidenced. Finally, a phenotypic assay of cell migration was performed observing a significant decrease in the presence of this natural compound. It can be concluded in this thesis that the reduction of curcumin-induced EMT in this experimental model, occurs in a Pirin-dependent manner. To confirm this mechanism, additional experiments are warranted. Pirin protein could be an important pharmacological target in the treatment of cervical cancer.

Magister en biomedicina celular y molecular / En Chile la incidencia y mortalidad del cáncer de próstata (CaP) está aumentado, siendo actualmente la segunda causa de muerte por cáncer en hombres. Durante la progresión tumoral las células epiteliales disminuyen sus moléculas de adhesión, polaridad, posicionamiento, reordenan su citoesqueleto y aumentan sus capacidades migratorias e invasivas. Todos estos cambios se conocen bajo el concepto de Transición Epitelio-Mesénquima (TEM). La TEM se caracteriza por el aumento de ciertos factores transcripcionales, tales como SNAIL1, que reprime genes característicos de un fenotipo epitelial, como E-cadherina, y aumenta indirectamente la expresión de genes que promueven el fenotipo mesenquimático. Se propone que el factor transcripcional SNAIL1 disminuye la proliferación y aumenta las capacidades migratorias e invasivas en líneas celulares de CaP. Para ello se trabajó con las líneas celulares LNCaP y PC3 con expresión ectópica y silenciamiento de SNAIL1 obtenidas mediante el uso de vectores lentivirales. Se caracterizó la expresión de marcadores de TEM mediante PCR en tiempo real, western blot e inmunofluorescencia. Además, se analizó la sobrevida mediante MTS; proliferación utilizando anticuerpos contra PCNA y Ki-67; migración a través de placas con poros de 8 μm (que permiten el paso de células) e invasividad mediante cámaras de membranas cubiertas con una capa de membrana basal. Complementariamente se determinó la apoptosis mediante un kit que contiene un sustrato que es modificado por las caspasas 3 y 7. Se determinó que ambas líneas celulares de CaP con sobreexpresión y silenciamiento de SNAIL1 la proliferación y sobrevida disminuyen. Sin embargo, la sobreexpresión de SNAIL1 disminuye la apoptosis respecto a las células con silenciamiento de la expresión de éste gen, en las cuales aumenta la muerte celular. Respecto a las capacidades migratorias e invasivas, aumentaron sólo en las células con sobreexpresión de SNAIL1 y disminuyeron en las células con silenciamiento. En conclusión, células de CaP con sobreexpresión de SNAIL1 exhibieron características fenotípicas tipo TEM, mientras que el silenciamiento de éste represor transcripcional condujo a las células a un fenotipo tipo epitelial con la disminución de características mesenquimales como la migración e invasión. / FONDECYT No 1110269

Grado de doctor en ciencias biomédicas / Introducción: El cáncer de próstata (CaP) en Chile representa la tercera patología oncológica más común en hombres y la segunda en causas de muerte por cáncer. Recientemente se ha visto que uno de los mecanismos involucrados en la malignización celular sería la activación anómala del programa de transición epitelio mesénquima (TEM). Este proceso se caracteriza por la represión de la expresión de marcadores epiteliales y un aumento en la expresión de marcadores mesenquimales, motilidad e invasividad celular y está controlado por factores transcripcionales como Snail, Twist y ZEB1. Estos factores transcripcionales ejercen su función generalmente mediante el reclutamiento de corepresores (como CtBP) o coactivadores (como la histona acetil transferasa p300). Se ha reportado que el factor transcripcional ZEB1, a través de la activación del proceso de TEM, no solo controlaría varios de estos cambios fenotípicos sino que además podría promover la resistencia a quimioterapéuticos. Pese a esto, el rol de ZEB1 en el progreso tumoral del CaP aún no está claro. Por lo tanto, el propósito de nuestra investigación es proponer al factor transcripcional ZEB1 como un componente clave en el progreso tumoral hacia etapas avanzadas del CaP y en el desarrollo de un fenotipo quimioresistente. Hipótesis y objetivos: “El Factor Transcripcional ZEB1 regula la expresión de marcadores de transición epitelio-mesénquima e induce un fenotipo maligno y de resistencia a quimioterapéuticos en células epiteliales de cáncer prostático”. Para responder la hipótesis se plantearon los siguientes objetivos: 1) Generar y caracterizar líneas celulares de cáncer prostático con sobreexpresión y silenciamiento estable de ZEB1 en cuanto a marcadores de TEM y propiedades relacionadas con la malignidad tumoral. 2) Estudiar la sensibilidad y resistencia de células 22Rv1 con sobreexpresión y DU145 con silenciamiento de ZEB1 en respuesta a Docetaxel y posibles mecanismos de resistencia a dicho fármaco. 3) Evaluar el rol de ABCC1 y el mecanismo de apoptosis en la sensibilidad a Docetaxel de células con sobreexpresión y silenciamiento de ZEB1. 3) Evaluar el rol de ABCC1 y el mecanismo de apoptosis en la sensibilidad a Docetaxel de células con sobreexpresión y silenciamiento de ZEB1. Resultados: Los resultados mostraron que la sobreexpresión de ZEB1 causó un aumento en el marcador mesenquimal Vimentina y una disminución del marcador epitelial E-Cadherina, con un aumento en la motilidad, invasividad y capacidades clonogénicas, mientras que su silenciamiento causó una baja en Vimentina, un aumento en E-Cadherina y una baja en las propiedades malignas. Adicionalmente la expresión de ZEB1 promovió un aumento en la resistencia a Docetaxel, cambió que estaría siendo mediado por una menor activación del programa de apoptosis y un aumento en la expresión de la proteína de multiresistencia a drogas ABCC1. Proyección: Nuestros resultados sugieren que ZEB1 podría ser un marcador no solo de progreso y agresividad tumoral en CaP sino también de resistencia al tratamiento con Docetaxel y como blanco terapéutico. / Introduction: Prostate cancer is a cronic health problem representing one of the most diagnosed cancers in men worldwide. The disease has a good prognostic when it is detected in its early stages but at late stages it becomes resistant to all therapies used to treat it. One of the factors that have lately been signaled as a key promoter of tumoral progress is the abnormal activation of the epithelial-mesenchymal transition program (EMT), which allows tumoral cells to acquire malignant properties and resistance to common treatments such as radio and chemotherapy. The transcription factor ZEB1 is one of its main activators and even though it has been reported that it shows higher expression in prostate cancer samples with high Gleason score, its effect over prostate cancer progression still remains unclear. Material and Methods: The prostate cancer cell lines 22Rv1 and DU145 cell were selected for this research due to their low and high expression of ZEB1 respectively. ZEB1 overexpression and silencing was achieved using lentiviral vectors. EMT and chemoresistance was evaluated by measuring levels of key markers using qRT-PCR and Western Blot. Malignancy was evaluated using a Boyden chamber assay. Sensitivity to Docetaxel was analyzed using the MTT method. To study apoptosis we used a commercial kit and the Annexin-V assay. Results: ZEB1 expression caused an upregulation of the mesenchymal marker Vimentin and a downregulation of the epithelial marker E-Cadherin and conferred enhanced motility and invasiveness to 22Rv1 cells while its silencing in DU145 cells showed the opposite switch in markers and decreased motility and invasiveness. Finally, cells overexpressing ZEB1 exhibited lower sensitivity to Docetaxel while silenced cells proved to be more sensitive, change that was mediated by the multi-resistance protein ABCC1 and changes in the apoptosis program. Discussion: Our data poises ZEB1 as a key driver of tumoral malignancy and resistance to Docetaxel treatment, which could be attributed to changes in ABCC1 expression and the apoptosis program. This suggests ZEB1 as a potential therapeutic target to overcome chemoresistance.

[ES] El cáncer de pulmón es el tumor más frecuente y también el que presenta mayor mortalidad en términos absolutos, suponiendo hasta más del 18% de los fallecimientos por cáncer en el mundo al año. El cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) representa casi el 85% de todos los tumores de pulmón. Tanto las alteraciones genéticas como la heterogeneidad y el microambiente tumoral influyen en la agresividad de los tumores de CPNM. Un factor que contribuye a la heterogeneidad tumoral es la presencia de células madre tumorales (CSC, Cancer Stem Cells). La metástasis y recurrencia tumoral después del tratamiento han sido atribuidas al crecimiento y supervivencia de esta subpoblación celular. La falta de marcadores específicos de CSC de pulmón representa una dificultad para identificarlas, y los marcadores de superficie conocidos hasta el momento no son válidos para separar poblaciones de CSC, por lo que se hace necesaria la generación de nuevos ensayos experimentales para aislar CSC de manera más robusta. La identificación de CSC podría ser la base para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas personalizadas, basadas en la selección de una combinación más racional de fármacos, que tendría como objetivo eliminar la población de CSC en los tumores de CPNM. Los objetivos de esta tesis doctoral han sido el aislamiento y caracterización de CSC derivadas de tumores de pacientes con CPNM, y de líneas de cultivo establecidas; la caracterización de proteínas involucradas en la transición epitelial mesenquimal (EMT) en CPNM que pueden ser relevantes para la adquisición y el mantenimiento de características de las células madre y para la progresión de la enfermedad; y el desarrollo de modelos experimentales de ratón a partir de xenoinjertos derivados de tumores de pacientes con CPNM (PDX) para la identificación de nuevos biomarcadores y para estudiar el fenotipo y evolución de los tumores de pacientes. En este trabajo se han optimizado los protocolos para la obtención de tumoresferas (ESF) con propiedades de células madre a partir de tejido tumoral de pacientes con CPNM y de líneas células de CPNM establecidas. Se ha confirmado el fenotipo característico de célula madre en las ESF mediante el análisis de la expresión de marcadores de superficie de CSC como CD326, CD166, CD44 y CD133, su capacidad de autorrenovación y diferenciación, así como la capacidad de iniciar tumores en ratones inmunodeprimidos. Se ha observado además que la señalización mediada por TGF-ß1 podría estar contribuyendo a un aumento de la población CSC, y que habría una relación entre el proceso de promoción de la EMT inducida por TGF-ß1 y las propiedades de CSC. El análisis de genes involucrados en la EMT y CSC en las ESF mostró que la expresión de CDKN1A, NOTCH3, CD44, NANOG, SNAI1 e ITGA6 es característica de las ESF, y por tanto la expresión combinada de estos genes podría identificar la subpoblación de CSC. Al correlacionar la expresión de estos genes con la supervivencia de los pacientes, se obtuvo una firma con valor pronóstico en ADC basada en la expresión de los genes CDKN1A, SNAI1 e ITGA6. Se ha estudiado además el papel de proteínas involucradas en la EMT cuya expresión podría promover la migración e invasión celular en CPNM. De esta manera se ha identificado que el factor de transcripción JunB y el factor de traducción eIF5A2 están involucrados en la iniciación de la EMT mediada por TGF-ß1. Finalmente, se han establecido 9 modelos de xenoinjertos derivados de tumores de pacientes con CPNM (PDX). La correlación del éxito de implantación del tumor en ratón con variables clínico-patológicas de los pacientes mostró que los tumores primarios que generaron PDX derivaban de pacientes con peor pronóstico. También se observó que la elevada expresión de Vimentina, Ezrina y Ki67 en tumores sugiere una mayor agresividad y, por tanto, estudiar su expresión podría utilizarse en / [CA] El càncer de pulmó és el tumor més frequent i també el que presenta major mortalitat en termes absoluts, suposant fins més del 18% de les defuncions per càncer en el món a l'any. El càncer de pulmó no microcític (CPNM) representa quasi el 85% de tots els tumors de pulmó. Tant les alteracions genètiques com l'heterogeneïtat i el microambient tumoral influeixen en l'agressivitat dels tumors de CPNM. Un factor que contribueix a l'heterogeneïtat tumoral és la presència de cèl·lules mare tumorals (CSC, Cancer Stem Cells). La metàstasi i recurrència tumoral després del tractament han sigut atribuïdes al creixement i supervivència d'aquesta subpoblació cel·lular. La falta de marcadors específics de CSC de pulmó representa una dificultat per a identificar-les, i els marcadors de superfície coneguts fins al moment no són vàlids per a separar poblacions de CSC, per la qual cosa es fa necessària la generació de nous assajos experimentals per a aïllar CSC de manera més robusta. La identificació de CSC podria ser la base per al disseny de noves estratègies terapèutiques personalitzades, basades en la selecció d'una combinació més racional de fàrmacs, que tindria com a objectiu eliminar la població de CSC en els tumors de CPNM. Els objectius d'aquesta tesi doctoral han sigut l'aïllament i caracterització de CSC derivades de tumors de pacients amb CPNM, i de línies de cultiu establides de CPNM; la caracterització de proteïnes involucrades en la transició epitelial mesenquimal (EMT) en CPNM que poden ser rellevants per a l'adquisició i el manteniment de característiques de les cèl·lules mare i per a la progressió de la malaltia; i el desenvolupament de models experimentals de ratolí a partir de xenotrasplantaments derivats de tumors de pacients amb CPNM (PDX) per a la identificació de nous biomarcadors i per a estudiar el fenotip i evolució dels tumors de pacients. En aquest treball s'han optimitzat els protocols per a l'obtenció de tumoresferes (ESF) amb propietats de cèl·lules mare a partir de teixit tumoral de pacients amb CPNM i de línies cel·lulars de CPNM establides. S'ha confirmat el fenotip característic de cèl·lula mare en les ESF mitjançant l'anàlisi de l'expressió de marcadors de superfície de CSC com CD326, CD166, CD44 i CD133, la seua capacitat d'autorenovació i diferenciació, així com la capacitat d'iniciar tumors en ratolins immunodeprimits. S'ha observat a més que la senyalització mediada per TGF-ß1 podria estar contribuint a un augment de la població CSC, i que hi hauria una relació entre el procés de promoció de l'EMT induïda per TGF-ß1 i les propietats de CSC. L'anàlisi de gens involucrats en l'EMT i CSC en les ESF va mostrar que l'expressió de CDKN1A, NOTCH3, CD44, NANOG, SNAI1 i ITGA6 és característica de les ESF, i per tant l'expressió combinada d'aquests gens podria identificar la subpoblació de CSC. En correlacionar l'expressió d'aquests gens amb la supervivència dels pacients, es va obtindre una signatura amb valor pronòstic en ADC basada en l'expressió dels gens CDKN1A, SNAI1 i ITGA6. S'ha estudiat a més el paper de proteïnes involucrades en l'EMT que la seua expressió podria promoure la migració i invasió cel·lular en CPNM. D'aquesta manera s'ha identificat que el factor de transcripció JunB i el factor de traducció eIF5A2 estan involucrats en la iniciació de l'EMT mediada per TGF-ß1. Finalment, s'han establit 9 models de xenotrasplantaments derivats de tumors de pacients amb CPNM (PDX). La correlació de l'èxit d'implantació del tumor en ratolí amb variables clinicopatològiques dels pacients va mostrar que els tumors primaris que van generar PDX derivaven de pacients amb pitjor pronòstic. També es va observar que l'elevada expressió de Vimentina, Ezrina i Ki67 en tumors suggereix una major agressivitat i, per tant, l'avaluació de la seua expressió podria utilitzar-se en combinació com a marcador de pr / [EN] Lung cancer is the most frequent and the most mortal tumor in absolute terms, accounting for up to more than 18% of cancer deaths worldwide per year. Non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for almost 85% of all lung tumors. Apart from genetic alterations, both tumor heterogeneity and tumor microenvironment influence the aggressiveness of NSCLC tumors. A factor that contributes to tumor heterogeneity is the presence of cancer stem cells (CSC). Tumor metastasis and recurrence after treatment have been attributed to the growth and survival of this cell subpopulation. The lack of specific markers for lung CSC represents a drawback for their identification, and the surface markers known to date are not valid for separating CSC subpopulations, so it is necessary to generate new experimental assays to isolate CSC in a more robust way. The identification of CSC could be the basis for the design of new personalized therapeutic strategies, based on the selection of a more rational combination of drugs, which would aim to eliminate the CSC population in NSCLC tumors. The objectives of this doctoral thesis have been the isolation and characterization of CSC derived from tumors of patients with NSCLC, and from established NSCLC cell lines; the characterization of proteins involved in the epithelial-mesenchymal transition (EMT) in NSCLC that may be relevant for the acquisition and maintenance of stem cell characteristics and for disease progression; and the development of experimental mouse models from patient-derived xenografts (PDX) of NSCLC for the identification of new biomarkers and to study the phenotype and evolution of patient tumors. In this work, the protocols for obtaining tumorspheres (SPH) with stem cell properties from tumor tissue of NSCLC patients and from established NSCLC cell lines have been optimized. The characteristic stem cell phenotype in SPH has been confirmed by analyzing the expression of CSC surface markers such as CD326, CD166, CD44 and CD133, their capacity for self-renewal and differentiation, as well as the ability to initiate tumors in immunosuppressed mice. It has also been observed that TGF-ß1-mediated signaling could be contributing to an increase in CSC population, and that there would be a relationship between the process of promoting TGF-ß1-induced EMT and CSC features. The analysis of genes involved in EMT and CSC in the SPH showed that the expression of CDKN1A, NOTCH3, CD44, NANOG, SNAI1 and ITGA6 is characteristic of the SPH, and therefore the combined expression of these genes could identify the CSC subpopulation in NSCLC tumors. By correlating the expression of these genes with the survival of the patients, a signature with prognostic value in ADC was obtained based on the expression of CDKN1A, SNAI1 and ITGA6. The role of proteins involved in EMT whose expression could promote cell migration and invasion in NSCLC has also been studied. Thus, it has been identified that the JunB transcription factor and the eIF5A2 translation factor are involved in the initiation of EMT mediated by TGF-ß1. Finally, 9 PDX models from tumors of NSCLC patients have been established. The correlation of implantation success of the tumor in mice with the clinical-pathological variables of the patients showed that primary tumors that generated PDX were derived from patients with bad prognosis. It was also observed that higher expression of Vimentin, Ezrin and Ki67 in tumors suggests higher aggressiveness and, therefore, the study of their expression could be used in combination as a prognostic marker to evaluate the progression of the disease. / Pardo Sánchez, JM. (2021). Aproximaciones moleculares para la identificación de nuevos biomarcadores y dianas terapéuticas del cáncer de pulmón no microcítico: células madre tumorales, transición epitelial-mesenquimal y modelos de xenoinjertos derivados de pacientes [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/172736