Šio darbo tikslas – taikant in vivo transkripcijos interferencijos sistemą, ištirti laukinio tipo restrikcijos endonukleazės (REazės) Eco31I (atpažįsta DNR seką 5’-GGTCTC-3’) ir mutantinės REazės Eco31IQ69R/K127I (atpažįsta DNR seką 5’-(G/W)GTCTC-3’) sąveikos su DNR sekomis 5’-GGTCTC-3’, 5’-AGTCTC-3’, 5’-TGTCTC-3’, 5’-CGTCTC-3‘ savybes. In vivo transkripcijos interferencijos sistemą sudaro aadA genas (sąlygoja atsparumą spektinomicinui) ir priešprasmis stiprus konstitutyvinis E. coli promotorius conII, nuo kurio vykstanti transkripcija blokuoja aadA geno ekspresiją. Tokios ląstelės fenotipas yra SpS. Transkripcija nuo promotoriaus conII gali būti reguliuojama, įvedant specifiškai su DNR sąveikaujančių baltymų atpažįstamas DNR sekas – sintetinius operatorius. Sąveikaudamas su atpažįstama DNR seka, baltymas veikia kaip conII promotoriaus represorius. Tai sąlygoja ląstelės fenotipo pasikeitimą į SpR. Darbo metu buvo sukonstruotos keturios transkripcijos inerferencijos sistemos plazmidės, kuriose promotorius conII turi operatorines sekas: 5’-GGTCTC-3’, 5’-AGTCTC-3’, 5’-TGTCTC-3’, 5’-CGTCTC-3‘. REazė, nesant apsaugančios metilazės, turi letalų poveiki ląstelei-šeimininkui, todėl darbe buvo naudoti katalitiškai neaktyvūs fermento mutantai Eco31IH312A ir Eco31IQ69R/K127I+H312A. A priori tikėtasi, kad abu fermentai specifiškai sąveikaus su 5’-GGTCTC-3’ seka, o Eco31IQ69R/K127I+H312A taip pat įtakos transkripciją nuo promotoriaus conII, sąveikaudama su 5’-AGTCTC-3’, 5’-TGTCTC-3’... [toliau žr. visą tekstą] / The aim of this study was the investigation of interaction of wild type restriction endonuclease (REase) Eco31I and mutant REase Eco31IQ69R/K127I with DNA sequences 5’-GGTCTC-3’, 5’-AGTCTC-3’, 5’-TGTCTC-3’ and 5’-CGTCTC-3 by an in vivo transcriptional interfererence assay. The transcriptional interference assay is composed of an aadA gene that determines the resistance to spectinomycin and antisense constitutive E. coli promoter conII. The expression of aadA gene is blocked by the transcription from promoter conII and, therefore, the phenotype is SpS. The promoter conII could be regulated by installing operator sequence. DNA-binding protein binds to this recognition sequence and acts as a repressor of promoter conII. This interaction determines transformation of the phenotype to SpR. Four transcriptional interference system plasmids with operon sequences 5’-GGTCTC-3’, 5’-AGTCTC-3’, 5’-TGTCTC-3’and 5’-CGTCTC-3’ were engineered during this study. Cleavage deficient variants Eco31IH312A and Eco31IQ69R/K127I+H312A were tested, because the presence of REase in the absence of cognate DNA methyltransferase is lethal to the host. We predicted that the both enzymes (Eco31IH312A and Eco31IQ69R/K127I+H312A) would interact with 5’-GGTCTC-3’ sequence. Therefore, the interaction of Eco31IQ69R/K127I+H312A with sequences 5’-AGTCTC-3’ and 5’-TGTCTC-3’ at the lower level was expected. The optimal conditions of transcriptional interference were selected and the both enzymes interacted only with... [to full text]