Understanding translation efficiency is crucial to pharmaceutical companies that have invested substantial time and effort in engineering bacteria to produce recombinant proteins. While translation initiation and elongation have been studied intensively, much remains obscure in the subprocess of translation termination. We aim to understand how stop codons and the first 3’ flanking (+4) base affect translation termination efficiency. In chapter two, we hypothesized that stop codon usage of UAG and UGA is dependent on the abundance of their respective decoders, RF1 and RF2. We predicted and observed that bacterial species with high relative proportions of RF1 uses UAG more, and vice versa for UGA. In addition, the usage of UGA, not UAG, is always avoided in highly expressed genes. Thus, we argued against the claim made by a recent study that UAG is a minor stop codon in bacteria. The claim is incorrect because UAG does not meet the two criteria of a minor codon: i) it is most avoided in highly expressed genes, and ii) it corresponds to the least abundant decoder. Interestingly, we found that the proportion of RF2 decreases rapidly towards zero in species with high AT contents; this explains why UGA is reassigned to a sense codon in bacterial lineages with high AT content. In chapter three, we examined the role of the first downstream (+4) base Uracil in bacterial translation termination. The +4U is associated with a decrease in stop codon read-through in bacteria and yeast. We hypothesized that i) +4U enhances the termination efficiency of stop signals, and ii) +4U may serve to prevent stop codon misreading by near cognate tRNAs (nc_tRNAs). We predicted that i) +4U is preferred in highly expressed genes (HEGs) than lowly expressed genes (LEGs), and ii) +4U usage increases with the frequency of stop codon nc_tRNAs. We found +4U consistently over-represented in HEGs in contrast to LEGs; however, +4U usage in HEGs decreases in GC-rich species where most stop codons are UGA and UAG. In addition, +4U usage increases significantly with UAA usage in the known highly expressed ribosomal protein genes. These results suggest that +4U is a strong stop signal enhancer for UAA, not UAG or UGA. Furthermore, in HEGs, +4U usage also increases significantly with the abundance of UAA nc_tRNAs, suggesting that +4U increases UAA termination efficiency presumably by reducing misreading of UAA by nc_tRNAs.

Le système de contrôle appelé dégradation des ARNm non-sens (NMD) permet de détecter puis de dégrader des ARNm contenant un codon de terminaison prématuré (PTC). Les facteurs principaux de la NMD : UPF1, UPF2 et UPF3 reconnaissent les PTCs en interagissant avec les facteurs de terminaison eRF1, eRF3 et la protéine Poly(A) binding (PABP). La reconstitution d’un système de traduction in vitro a permis d’étudier la terminaison de la traduction en présence des facteurs PABP et UPF1, à l’aide de méthodes de biochimie et de cryo-microscopie électronique. L’étude du rôle du facteur de NMD UPF3B dans la terminaison de la traduction a mis en évidence une double action de cette protéine ; tout d’abord, un retardement de la reconnaissance du codon stop et également la promotion de la dissociation du ribosome. Ce travail a également permis de mettre en évidence une nouvelle interaction entre UPF3B et la kinase SMG1-8-9 et de montrer comment cette interaction affecte l’état de phosphorylation de UPF1. Les résultats de cette étude montrent une interaction complexe entre les différents facteurs de NMD et la kinase SMG1. / Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) is an important eukaryotic quality control mechanism that recognizes and degrades mRNA containing a premature termination codon (PTC). Up-frameshift proteins constitute the conserved core NMD factors (UPF1, UPF2 and UPF3). They mediate the recognition of a NMD substrate, i.e. a ribosome stalled at a PTC. UPF proteins were shown to associate with eukaryotic release factors (eRF1 and eRF3) and were suggested to impede translation termination. We showed that, at a normal termination codon, Poly(A)-binding protein (PABP) stimulates translation termination by directly interacting with eRF3a. Using a reconstituted in vitro translation system, we studied translation termination in the presence of the factors PABP and UPF1 using biochemistry and single particle electron cryo-microscopy (Cryo-EM). Additionally, we analysed the role of the other NMD factors UPF2 and UPF3B in translation termination in vitro. We discovered a novel role for UPF3B in translation termination. Moreover, we observed a novel interaction between UPF3B and the SMG1-8-9 kinase complex. The presence of UPF3B affects the kinase activity of SMG1 and thus the phosphorylation state of UPF1. Our results highlight a much more complex interplay of the NMD factors with the translation termination machinery and SMG1 kinase than anticipated.

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Environ un tiers des maladies humaines, héréditaires ou acquises, sont dues à la génération d’un codon stop prématuré (PTC). Le système de contrôle appelé dégradation des ARNm non-sens (NMD) permet de détecter puis de dégrader des ARNm contenant un PTC. Les facteurs principaux de la NMD : UPF1, UPF2 et UPF3 reconnaissent les PTCs en interagissant avec le complexe de terminaison de traduction contenant les ribosomes, les facteurs de terminaison eRF1, eRF3 et la protéine poly(A) binding (Pab1p en levure). Nous avons pu résoudre la structure d'un tel complexe en levure comprenant un ribosome en cours de traduction en présence d’un ARNt dans le site P et de facteurs de terminaisons dans le site A. Aucune densité n’a pu être observée pour Pab1p indiquant la flexibilité de l’interaction avec ce complexe. Nous avons aussi évalué l’impact des facteurs de la NMD sur la terminaison dans un système de traduction in vitro humain. UPF3B retarde la reconnaissance du codon stop et favorise la dissociation des sous-unités ribosomales. UPF2 abolit l’effet de UPF3B tandis que l’addition de UPF1 n’a pas d’influence dans la terminaison. Par in vivo et in vitro pulldowns, nous avons montré que UPF3B interagit avec eRF3a et UPF1 et pourrait constituer le lien manquant entre la terminaison et la NMD. Nos résultats illustrent la complexité des mécanismes de la terminaison et de la NMD. / Premature termination codons (PTCs) account for approximately one third of inherited and acquired diseases. A surveillance pathway called nonsense-mediated mRNA decay (NMD) detects and degrades PTC-containing transcripts. NMD core factors UPF1, UPF2 and UPF3 mediate the recognition of PTCs by associating with the terminating translation machinery composed of the ribosome, the release factors eRF1 and eRF3 and the poly(A) binding protein (Pab1p in yeast). Using electron cryo-microscopy, we solved such a complex in yeast and observed the translating ribosome, containing a P-site tRNA and an A-site density for the release factors but not for Pab1p indicating that Pab1p is flexibly bound. We also probed the function of NMD factors in mammalian termination using a reconstituted human in vitro translation system. Surprisingly, we found that UPF3B delayed stop codon recognition and promoted ribosomal dissociation. The addition of UPF2 could abolish UPF3B’s effect on translation termination. UPF1 had no influence in the termination process alone or in combination with UPF2. Using in vitro and in vivo pulldowns we found that UPF3B interacts with eRF3a and UPF1, indicating that UPF3B could be the missing link between termination and NMD. Our results point to a complex interplay between the NMD factors and the termination apparatus.

L’architecture et la régulation de la traduction eucaryote fut pendant longtemps un mystère pour les biologistes. Je présente ici un protocole détaillé pour purifier de manière homogène des ribosomes à partir de cellules HeLa, pour des études biochimiques mais également structurales. En utilisant ces ribosomes, j’ai obtenu des cristaux diffractant à faible résolution, pouvant être utilisés pour de futurs travaux. Une analyse par cryo-microscopie électronique (CME) a abouti à une structure à 5 A de résolution, permettant la construction d’un modèle. De plus, les facteurs eRF1 et eRF3 ont permis des premières études de la terminaison de la traduction par CME. Ces protéines en complexe ont également été étudiées par cristallographie aux rayons-X, montrant des interactions jusqu’alors jamais observées. L’ensemble de ce travail fournit des résultats importants pour la préparation et la description de la structure du ribosome humain, pavant la voie vers l’analyse de complexes fonctionnels. / Ribosomes comprise the translational machinery engaged in synthesizing proteins. The architecture and translation regulation of eukaryotic especially, human ribosomes, has been an enigma for a long time. I established a protocol for purifying homogenous ribosomes from HeLa cells which can be used for structural as well as biochemical analysis. Using these ribosomes, I obtained plate-like crystals of 80S diffracting to low resolution. A cryo electron microscopy analysis of these ribosomes yielded 5 Å resolution structure with secondary structures of rRNA and protein clearly visible. Furthermore, these ribosomes, along with the eukaryotic release factors (eRF1 and eRF3) purified by over-expression in bacteria, formed the basis for translation termination studies using cryo electron microscopy. Simultaneously, eRF1-eRF3 protein complex was explored by X-ray crystallography revealing new interactions. Together, this work paves the way for the analysis of functional ribosome complexes.

Mass production of translationally optimized bacteriophages (hereafter referred to as phages) is the need of the hour in the application of phages to therapy. Understanding translational efficiency of phages is the major preliminary step for mass producing efficient phages. The objective of this thesis is to understand factors affecting translational efficiency of phages. In chapter two, we hypothesized that weak translation initiation efficiency is responsible for weak codon concordance of Escherichia coli lambdoid phages with that of their hosts. We measured the strength of translation initiation using two indices namely minimum folding energy (MFE) and proportion of Shine-Dalgarno sequence (PSD). Empirical results substantiate our hypothesis suggesting lack of strong selection for improving codon adaptation in these phages is due to their weak translation initiation. In chapter three, we measured codon usage concordance between GC-rich and GC-poor Aeromonas phages with their GC-rich host Aeromonas salmonicida. We found low codon usage concordance in the GC-poor Aeromonas phages. We were interested in testing for the role of tRNAs in the GC-poor phages. We observed that the GC-poor phages carry tRNAs for codons that are overused by the phages and underused by the host. These findings suggest that the GC-poor Aeromonas phages carry their own tRNAs for compensating for the compositional difference between their genomes and that of their host. Previously several studies have reported observed avoidance of stable secondary structures in start site of mRNA in a wide range of species. We probed the genomes of 422 phage species and measured their secondary structure stability using MFE. We observed strong patterns of secondary structure avoidance (less negative MFE values) in the translation initiation region (TIR) and translation termination region (TTR) of all analyzed phages. These findings imply selection is operating at these translationally important sites to control stable secondary structures in order to maintain efficient translation.

La terminaison de la traduction se produit lorsqu’un codon stop entre au site A du ribosome où il est reconnu par le facteur de terminaison eRF1 accompagné du facteur eRF3. Cette étape de la traduction est encore mal comprise chez les eucaryotes. Au cours de ma thèse je me suis intéressée à l’étude de la fidélité de la terminaison de la traduction afin de mieux comprendre et caractériser les mécanismes moléculaires mis en jeu lors du décodage du codon stop.L’un de mes projets consistait à mieux caractériser une région du domaine N-terminal d’eRF1, la cavité P1, identifiée comme étant impliquée dans l’efficacité de terminaison. Grâce à une quantification de l’efficacité de translecture de mutants de la cavité P1, j’ai pu mettre en évidence le rôle de résidus clés comme les serines 33 et 70, impliquées dans le décodage spécifique du codon UGA probablement via une interaction directe entre les deux résidus, ou encore l’arginine 65 et la lysine 109, essentielles pour une terminaison efficace sur les trois codons stop. L’analyse par RMN de ces mutants a également permis de montrer que ces résidus étaient importants pour la conformation correcte de la cavité et potentiellement impliqués dans une interaction directe avec l’ARNm. La combinaison des données génétiques et structurales nous a permis de proposer un modèle d’interaction entre l’ARNm et le facteur de terminaison eRF1 dans lequel le codon stop serait reconnu en partie par l’intermédiaire de la cavité P1. Dans la cellule, la terminaison est toujours en compétition avec la translecture, qui correspond à l’incorporation d’un ARNt proche-cognat au niveau du codon stop. Afin d’identifier les acides aminés incorporés par translecture au niveau du codon stop, j’ai mis au point un système basé sur l’expression et la purification de protéines issues de la translecture qui sont ensuite analysées par spectrométrie de masse. J’ai pu mettre en évidence que la glutamine, la tyrosine et la lysine s’incorporent au niveau des codons UAA et UAG, alors que le tryptophane, la cystéine et l’arginine sont retrouvés au niveau du codon UGA. J’ai également pu montrer que le contexte en 5’ n’influençait pas l’incorporation des acides aminés au codon stop mais qu’en revanche, la présence de la paromomycine avait un impact sur la sélection des ARNt suppresseurs naturels. Ce projet permet d’apporter de nouvelles informations sur les règles de décodage grâce à l’analyse des appariements entre codons stop et anticodons des ARNt naturels suppresseurs. Il permet également d’envisager des perspectives thérapeutiques dans le cadre des maladies liées à la présence d’un codon stop prématuré et pour lesquelles le traitement repose sur l’utilisation de la translecture afin de ré-exprimer des protéines entières. / Translation termination occurs when a stop codon enters the A site of the ribosome where it is recognized by eRF1 (eukaryotic release factor 1), associated with eRF3. This step of translation is not yet understood in eukaryotes. During my PhD, I was interested in studying translation termination accuracy to better understand and characterize the molecular mechanisms involved in stop codon decoding.One of my project consisted in characterizing a region in eRF1 N-terminal domain, pocket P1, identified to be involved in termination efficiency. Through a quantification of readthrough efficiency of pocket P1 mutants, I have highlighted the role of key residues, like serine 33 and serine 70, implicated in specific recognition of UGA stop codon, probably through a direct interaction between the two amino acids, and also arginine 65 and lysine 109, essential for efficient termination on the three stop codons. The analysis of the mutants by NMR revealed that these residues are also important for proper conformation of the cavity and potentially involved in a direct interaction with mRNA. The combination of our genetic data and structural analysis allowed us to propose a model of interaction between termination factor eRF1 and the mRNA, in which the stop codon would be recognized partially through pocket P1.In cells, termination always competes with readthrough which corresponds to the incorporation of near-cognate tRNAs at the stop codon. To identify the amino acids inserted by readthrough at the stop codon, I have developed a reporter system based on the expression and purification of readthrough proteins that are analyzed by mass spectrometry. I found that glutamine, tyrosine and lysine are inserted at UAA and UAG stop codons, whereas tryptophan, cysteine and arginine are inserted at UGA stop codon. I also showed that the 5’ nucleotide context does not influence the incorporation of amino acids at the stop codons by readthrough, but that, in contrast, the presence of paromomycin impacted the selection of natural suppressors tRNAs incorporated by readthrough. This project gives us new insights into the decoding rules by analyzing the base pairings between stop codon and near-cognates anticodons. It also allows us to consider therapeutic prospects for the treatment of premature stop codon diseases which uses readthrough as a tool to re-express full-length proteins from mRNAs that are interrupted by the presence of a premature stop codon.

Au cours de mon travail de thèse j’ai étudié la relation entre les facteurs participant à la terminaison de la traduction et ceux participant à la dégradation des ARNm chez S. cerevisiae.D’une part, je me suis intéressée au facteur Tpa1, caractérisé pour son rôle dans la terminaison de la traduction et la stabilité des ARNm chez S. cerevisiae et dont l’homologue chez S. pombe, Ofd1, participe au contrôle de la réponse hypoxique. Je me suis basée sur la structure de ce facteur, établie par nos collaborateurs pour comprendre plus précisément la fonction moléculaire de Tpa1 et rechercher des similitudes avec sa fonction chez S. pombe.Tpa1 est composée de deux domaines de type DSBH dont le premier, contenant le site catalytique, présente des homologies structurales avec la famille des prolyl-hydroxylases.Nous avons reproduit l’effet de la protéine Tpa1 sur la translecture in vivo et montré que son site catalytique prédit, ainsi que la présence des deux domaines étaient nécessaires pour cette activité. Nous avons aussi observé que Tpa1 inhibait par un mécanisme inconnu le facteur de transcription Hap1, qui régule des gènes en fonction de la quantité d’oxygène. Basé sur l’existence d’un inhibiteur d’Ofd1 chez S. pombe, nous avons ensuite montré qu’Ett1 (l’homologue de cet inhibiteur chez S. cerevisiae) avait un rôle similaire à Tpa1 dans la translecture. Une étude structurale collaborative d’Ett1 a mis en évidence une région conservée, se liant à une molécule de sulfate et à un ligand inconnu. Cette région est importante pour la translecture. Cependant, le substrat de Tpa1 reste pour l’instant inconnu comme les rôles précis de Tpa1 et Ett1 dans la terminaison de la traduction et dans la réponse à l’hypoxie.D’autre part, j’ai étudié le processus de NMD, particulièrement en me focalisant sur le mécanisme de discrimination entre un codon stop précoce (PTC) et un codon stop normal, et en analysant également la modification post-traductionnelle d’un facteur central du NMD, Upf1. Nous avons mis en évidence, qu’en plus de la région aval, la région en amont du PTCparticipait à sa reconnaissance. Nous avons testé plusieurs hypothèses sur le rôle de cette région, qui ont confirmé son rôle sans permettre de démontrer un mécanisme définitif. En parallèle, l’étude de la protéine Upf1 s’est concentrée sur ses modifications posttraductionnelles, particulièrement par phosphorylation. En effet, une telle modification est importante chez son homologue humain. Nous avons pu confirmer l’existence d’une forme modifiée et démontrer que celle-ci était localisée entre les acides aminés 153 et 971. Cette modification s’est avérée être très labile ce qui n’a pas permis de confirmer qu’il s’agissait d’une phosphorylation, ni de la cartographier plus précisément. / During my PhD thesis, I analyzed the relation between factors that participate intranslation termination and those participating in mRNA decay in yeast S. cerevisiae.First, I focused on Tpa1, that had been proposed to participate in translationtermination and mRNA decay in S. cerevisiae, and whose homologue in S. pombe, Ofd1,participates to the control of hypoxic response. Based on the structure of Tpa1, established byour collaborators, I performed functional analysis to understand more precisely the molecularfunction of Tpa1 and similarities with its role in S. pombe. Tpa1 is composed of two DSBHdomains; the first, which contains the catalytic site, has structural homologies with the familyof prolyl-hydroxylase. We could reproduce the effect of Tpa1 on stop codon readthrough invivo and we showed that the predicted catalytic site and the presence of the two domains ofTpa1 were necessary for its activity. We also showed that Tpa1 inhibited one factor, Hap1,implicated in regulation of gene expression by oxygen. The existence of an inhibitor of Ofd1in S. pombe, allowed the identification of Ett1 (its homologue in S. cerevisiae). We showedthat Ett1 has a role similar to the one of Tpa1 in translational readthrough. A collaborativestructural and functional study of Ett1 revealed a conserved region, which binds a sulfate ion,and an unknown ligand. This region is important for the readthrough. However, thesubstrate(s) of Tpa1 remain(s) for the moment unknown, and the precise roles of Tpa1 andEtt1 in translation termination and in response to hypoxia remain to be deciphered.I also analyzed the NMD process by focusing more particularly on the mechanism thatallows the discrimination between a normal stop and a PTC (premature termination codon)and on the analysis of the post-translational modification of an important factor for the NMD,Upf1. This study revealed that, not only the region downstream of the PTC but also theupstream region participates to its recognition. We have tested several hypotheses on the roleof this upstream region, which confirmed its implication but did not reveal a definitivemechanism. In parallel, we started the study of the post-translational modifications of Upf1,and more particularly by phosphorylation. Indeed, the phosphorylation of Upf1 in human isvery important for the NMD process. We could confirm the presence of a modified form ofyeast Upf1 and we have demonstrated that it was localized between amino acids 153 and 971.This modification appeared to be highly labile. This prevented us to confirm definitively thatit was really a phosphorylation and to cartography precisely its location.

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