Le NMD (nonsense-mediated mRNA decay) est un mécanisme qui reconnaît et dégrade les ARNm portant un codon stop prématuré afin d’empêcher la synthèse de protéines tronquées qui pourraient avoir des effets néfastes pour la cellule ou tout simplement être non fonctionnelles. Cependant, dans un certain nombre de cas, selon la position du codon stop prématuré, la protéine tronquée qui serait synthétisée si le NMD n’existait pas, pourrait remplir complètement ou partiellement la fonction de la protéine sauvage. Il faut noter qu’un codon stop prématuré est retrouvé dans le gène responsable d’une pathologie dans un tiers des maladies génétiques et de nombreuses formes de cancer. Dans la plus grande majorité des cas, la maladie se développe non pas parce qu’une protéine tronquée non fonctionnelle ou instable est synthétisée, mais plutôt parce que le gène muté n’est pas exprimé du fait de l’intervention du NMD sur l’ARNm qui en dérive. Une nouvelle approche thérapeutique de ces maladies serait d’inhiber le NMD afin de permettre la synthèse de protéines tronquées fonctionnelles et sauver le phénotype clinique. Nous avons donc décidé de rechercher des inhibiteurs du mécanisme du NMD parmi des petites molécules chimiques. Pour cela, nous avons mis au point un système de criblage en culture cellulaire reliant l’efficacité du NMD dans une cellule avec une activité luciférase mesurable directement sur les cultures cellulaires, au moyen d’un luminomètre. A partir d’un premier criblage d’environ 1500 composés chimiques, nous avons identifié une nouvelle molécule capable d’inhiber efficacement le NMD. De façon intéressante, cette nouvelle molécule est capable également d’induire la synthèse de protéines entières à partir d’un ARNm portant un codon stop prématuré. Nous avons utilisé cet inhibiteur dans des expériences pour déterminer son potentiel thérapeutique sur des modèles cellulaires de maladies génétiques tels que la dystrophie musculaire de Duchenne, la mucoviscidose et le cancer. Nos résultats démontrent que l’inhibition du NMD peut être en effet envisagée comme une nouvelle approche thérapeutique pour des maladies causées par l’apparition d’une mutation non sens. Nous avons aussi identifié une autre molécule chimique capable d’inhiber le NMD et permettant de faire un lien entre efficacité du NMD et intégrité du cytosquelette. / MRNAs harboring a premature termination codon are rapidly degraded by a mechanism called nonsense-mediated mRNA decay (NMD). NMD is a surveillance pathway that prevents the synthesis of truncated proteins that could be harmful for the cell or simply be non-functional. However in some cases, depending on the position of the premature stop codon, the truncated protein that would be synthesized if there were no NMD would be partially or fully as functional as the wild-type protein. It is noteworthy that premature termination codons are found in approximately one-third of inherited genetic disorders and several forms of cancer. In most of cases the disease arises not because a non-functional or unstable truncated protein is synthesized, but instead because the degradation of the transcript by NMD leads to complete loss of protein production. Therefore, NMD inhibition could be an interesting therapeutic approach in some cases of nonsense-related genetic diseases in which functional truncated proteins can restore the clinical phenotype. We decided to search for NMD inhibitors among thousands of small molecules. We developed a cell-based screening method which couples NMD efficiency into the cell to a luciferase activity that can be measured directly into cells by a luminometer. From a screening of approximately 1500 compounds, we have identified one molecule capable of efficiently inhibit NMD. Interestingly, this compound is also able to induce the synthesis of full-length proteins from an mRNA bearing a premature termination codon. We evaluated the therapeutic potential of this compound in different cellular models of genetic disorders such as Duchenne’s muscular dystrophy, cystic fibrosis and cancer. Our results demonstrate that NMD inhibition in general can be considered as an useful therapeutic approach to rescue PTC consequences in genetic diseases provoked by the apparition of a nonsense mutation. We have also identified another compound that inhibits NMD and uncovers a relationship between the NMD efficiency and the integrity of the cytoskeleton.

Les mutations non sens introduisent un codon stop prématuré dans une phase ouverte de lecture. Ce type de mutation est retrouvé chez environ 11% des patients atteints de maladies génétiques et dans de nombreux cancers. En effet, entre 5 et 40% des mutations affectant des gènes suppresseurs de tumeurs sont des mutations non sens. La conséquence de la présence d’une mutation non sens dans un gène est la dégradation rapide de l’ARN messager correspondant, par l’activation d’un mécanisme de surveillance des ARN appelé NMD (pour nonsense-mediated mRNA decay) conduisant à une absence d’expression du gène mutant. Dans le cas des cancers, l’absence d’expression d’un gène suppresseur de tumeurs tel que TP53, perturbe un ensemble de processus biologiques dont l’apoptose, facilitant ainsi la progression tumorale.En utilisant un système de criblage moyen débit permettant d’identifier des molécules capables de ré-exprimer des gènes porteurs d’une mutation non sens en inhibant le NMD et/ou en activant la translecture, plusieurs molécules ont été identifiées. La translecture est un mécanisme naturel conduisant à l’incorporation d’un acide aminé à la position du codon stop prématuré au cours de la traduction. Parmi les molécules identifiées, je me suis intéressée à un extrait végétal nommé H7 et au composé CNSM1 (pour corrector of nonsense mutation 1) qui permettent une ré-expression très efficace du gène TP53 lorsqu’il est porteur d’une mutation non sens. J’ai caractérisé ces composés en montrant notamment la ré-expression du gène TP53 porteur d’une mutation non sens dans différentes lignées cellulaires issues de différents cancers. J’ai montré également la très faible toxicité de ces molécules, validant leur potentielle utilisation en clinique. Mon étude a aussi permis de montrer que la protéine p53 synthétisée est fonctionnelle puisqu'elle est capable d’induire l’activation transcriptionnelle d’un de ses gènes cibles, le gène TP21.En permettant la ré-expression du gène suppresseur de tumeur mutant, des molécules comme CNSM1 ou H7 restaurent la capacité des cellules à entrer en apoptose et pourraient aussi réduire certaines résistances à la chimiothérapie.De plus, par une approche d’édition du génome, j’ai confirmé le lien existant entre le blocage du cytosquelette et l’inhibition du NMD. J’ai aussi identifié deux protéines impliquées dans le réarrangement du cytosquelette qui pourraient être ciblées pour inhiber le NMD en thérapie et ré-exprimer une protéine tronquée fonctionnelle. L’utilisation de H7 ou de CNMS1 pourrait ainsi être couplée à une inhibition du NMD pour optimiser la correction des mutations non sens. Ces molécules correctrices de mutations non sens représentent de nouvelles approches thérapeutiques ciblées du cancer et des maladies rares liées aux mutations non sens. / Nonsense mutations generate premature termination codons (PTC) within an open reading frame. This type of mutation is found in about 11% of patients with genetic disorders. Concerning cancer, 5 to 40% of mutations affecting tumor-suppressing genes are nonsense mutations. The presence of a PTC in a gene leads to rapid degradation of its mRNA mediated by the RNA surveillance mechanism named NMD (Nonsense-mediated mRNA decay) preventing the synthesis of truncated proteins. In cancer, the absence of expression of tumor suppressing genes such as TP53 interferes with many biological pathways including apoptosis enabling tumor progression.A screening system that allows identifying molecules capable of re-expressing genes harboring nonsense mutations by inhibiting the NMD system and/or by activating readthrough has been developed in the lab. Readthrough is a natural mechanism, which occurs during translation, leading to the incorporation of an amino acid at the PTC position. Among the molecules that have been identified thanks to the screen, a natural extract named H7 and a compound named CNSM1 efficiently rescues the expression of the nonsense-mutated TP53 gene carrying a PTC.CNSM1 and H7 induces the expression of full-length proteins from PTC-containing genes indicating that these compounds are capable of activating readthrough. I validated the screen results on several cancer cell lines harboring an endogenous nonsense mutation in TP53 gene and showed that the function of p53 was restored in the presence of CNSM1 or H7. I also investigated the cellular toxicity related with the use of CMNS1 on cultured cells and the in vivo effect of H7 in a mouse model harboring a nonsense mutation in dystrophin gene. My results demonstrate that these compounds have a mild cellular toxicity. In addition, using a genome editing approach I confirmed the relationship between the cytoskeletal blockage and the NMD inhibition. I identified two proteins that are implicated in the cytoskeletal rearrangement, which might be targeted to induce NMD inhibition and then the expression of truncated but functional protein from the mutated mRNA. H7 or CNMS1 might be coupled to an NMD inhibition strategy to improve the nonsense mutation correction. Knowing CNSM1 and H7 are so far the most efficient molecule capable of rescuing the expression of PTC-containing genes, these compounds represents a realistic hope for a new-targeted therapy for pathologies associated with nonsense mutations.

La terminaison de la traduction se produit lorsqu’un codon stop entre au site A du ribosome où il est reconnu par le facteur de terminaison eRF1 accompagné du facteur eRF3. Cette étape de la traduction est encore mal comprise chez les eucaryotes. Au cours de ma thèse je me suis intéressée à l’étude de la fidélité de la terminaison de la traduction afin de mieux comprendre et caractériser les mécanismes moléculaires mis en jeu lors du décodage du codon stop.L’un de mes projets consistait à mieux caractériser une région du domaine N-terminal d’eRF1, la cavité P1, identifiée comme étant impliquée dans l’efficacité de terminaison. Grâce à une quantification de l’efficacité de translecture de mutants de la cavité P1, j’ai pu mettre en évidence le rôle de résidus clés comme les serines 33 et 70, impliquées dans le décodage spécifique du codon UGA probablement via une interaction directe entre les deux résidus, ou encore l’arginine 65 et la lysine 109, essentielles pour une terminaison efficace sur les trois codons stop. L’analyse par RMN de ces mutants a également permis de montrer que ces résidus étaient importants pour la conformation correcte de la cavité et potentiellement impliqués dans une interaction directe avec l’ARNm. La combinaison des données génétiques et structurales nous a permis de proposer un modèle d’interaction entre l’ARNm et le facteur de terminaison eRF1 dans lequel le codon stop serait reconnu en partie par l’intermédiaire de la cavité P1. Dans la cellule, la terminaison est toujours en compétition avec la translecture, qui correspond à l’incorporation d’un ARNt proche-cognat au niveau du codon stop. Afin d’identifier les acides aminés incorporés par translecture au niveau du codon stop, j’ai mis au point un système basé sur l’expression et la purification de protéines issues de la translecture qui sont ensuite analysées par spectrométrie de masse. J’ai pu mettre en évidence que la glutamine, la tyrosine et la lysine s’incorporent au niveau des codons UAA et UAG, alors que le tryptophane, la cystéine et l’arginine sont retrouvés au niveau du codon UGA. J’ai également pu montrer que le contexte en 5’ n’influençait pas l’incorporation des acides aminés au codon stop mais qu’en revanche, la présence de la paromomycine avait un impact sur la sélection des ARNt suppresseurs naturels. Ce projet permet d’apporter de nouvelles informations sur les règles de décodage grâce à l’analyse des appariements entre codons stop et anticodons des ARNt naturels suppresseurs. Il permet également d’envisager des perspectives thérapeutiques dans le cadre des maladies liées à la présence d’un codon stop prématuré et pour lesquelles le traitement repose sur l’utilisation de la translecture afin de ré-exprimer des protéines entières. / Translation termination occurs when a stop codon enters the A site of the ribosome where it is recognized by eRF1 (eukaryotic release factor 1), associated with eRF3. This step of translation is not yet understood in eukaryotes. During my PhD, I was interested in studying translation termination accuracy to better understand and characterize the molecular mechanisms involved in stop codon decoding.One of my project consisted in characterizing a region in eRF1 N-terminal domain, pocket P1, identified to be involved in termination efficiency. Through a quantification of readthrough efficiency of pocket P1 mutants, I have highlighted the role of key residues, like serine 33 and serine 70, implicated in specific recognition of UGA stop codon, probably through a direct interaction between the two amino acids, and also arginine 65 and lysine 109, essential for efficient termination on the three stop codons. The analysis of the mutants by NMR revealed that these residues are also important for proper conformation of the cavity and potentially involved in a direct interaction with mRNA. The combination of our genetic data and structural analysis allowed us to propose a model of interaction between termination factor eRF1 and the mRNA, in which the stop codon would be recognized partially through pocket P1.In cells, termination always competes with readthrough which corresponds to the incorporation of near-cognate tRNAs at the stop codon. To identify the amino acids inserted by readthrough at the stop codon, I have developed a reporter system based on the expression and purification of readthrough proteins that are analyzed by mass spectrometry. I found that glutamine, tyrosine and lysine are inserted at UAA and UAG stop codons, whereas tryptophan, cysteine and arginine are inserted at UGA stop codon. I also showed that the 5’ nucleotide context does not influence the incorporation of amino acids at the stop codons by readthrough, but that, in contrast, the presence of paromomycin impacted the selection of natural suppressors tRNAs incorporated by readthrough. This project gives us new insights into the decoding rules by analyzing the base pairings between stop codon and near-cognates anticodons. It also allows us to consider therapeutic prospects for the treatment of premature stop codon diseases which uses readthrough as a tool to re-express full-length proteins from mRNAs that are interrupted by the presence of a premature stop codon.

Au cours de mon travail de thèse j’ai étudié la relation entre les facteurs participant à la terminaison de la traduction et ceux participant à la dégradation des ARNm chez S. cerevisiae.D’une part, je me suis intéressée au facteur Tpa1, caractérisé pour son rôle dans la terminaison de la traduction et la stabilité des ARNm chez S. cerevisiae et dont l’homologue chez S. pombe, Ofd1, participe au contrôle de la réponse hypoxique. Je me suis basée sur la structure de ce facteur, établie par nos collaborateurs pour comprendre plus précisément la fonction moléculaire de Tpa1 et rechercher des similitudes avec sa fonction chez S. pombe.Tpa1 est composée de deux domaines de type DSBH dont le premier, contenant le site catalytique, présente des homologies structurales avec la famille des prolyl-hydroxylases.Nous avons reproduit l’effet de la protéine Tpa1 sur la translecture in vivo et montré que son site catalytique prédit, ainsi que la présence des deux domaines étaient nécessaires pour cette activité. Nous avons aussi observé que Tpa1 inhibait par un mécanisme inconnu le facteur de transcription Hap1, qui régule des gènes en fonction de la quantité d’oxygène. Basé sur l’existence d’un inhibiteur d’Ofd1 chez S. pombe, nous avons ensuite montré qu’Ett1 (l’homologue de cet inhibiteur chez S. cerevisiae) avait un rôle similaire à Tpa1 dans la translecture. Une étude structurale collaborative d’Ett1 a mis en évidence une région conservée, se liant à une molécule de sulfate et à un ligand inconnu. Cette région est importante pour la translecture. Cependant, le substrat de Tpa1 reste pour l’instant inconnu comme les rôles précis de Tpa1 et Ett1 dans la terminaison de la traduction et dans la réponse à l’hypoxie.D’autre part, j’ai étudié le processus de NMD, particulièrement en me focalisant sur le mécanisme de discrimination entre un codon stop précoce (PTC) et un codon stop normal, et en analysant également la modification post-traductionnelle d’un facteur central du NMD, Upf1. Nous avons mis en évidence, qu’en plus de la région aval, la région en amont du PTCparticipait à sa reconnaissance. Nous avons testé plusieurs hypothèses sur le rôle de cette région, qui ont confirmé son rôle sans permettre de démontrer un mécanisme définitif. En parallèle, l’étude de la protéine Upf1 s’est concentrée sur ses modifications posttraductionnelles, particulièrement par phosphorylation. En effet, une telle modification est importante chez son homologue humain. Nous avons pu confirmer l’existence d’une forme modifiée et démontrer que celle-ci était localisée entre les acides aminés 153 et 971. Cette modification s’est avérée être très labile ce qui n’a pas permis de confirmer qu’il s’agissait d’une phosphorylation, ni de la cartographier plus précisément. / During my PhD thesis, I analyzed the relation between factors that participate intranslation termination and those participating in mRNA decay in yeast S. cerevisiae.First, I focused on Tpa1, that had been proposed to participate in translationtermination and mRNA decay in S. cerevisiae, and whose homologue in S. pombe, Ofd1,participates to the control of hypoxic response. Based on the structure of Tpa1, established byour collaborators, I performed functional analysis to understand more precisely the molecularfunction of Tpa1 and similarities with its role in S. pombe. Tpa1 is composed of two DSBHdomains; the first, which contains the catalytic site, has structural homologies with the familyof prolyl-hydroxylase. We could reproduce the effect of Tpa1 on stop codon readthrough invivo and we showed that the predicted catalytic site and the presence of the two domains ofTpa1 were necessary for its activity. We also showed that Tpa1 inhibited one factor, Hap1,implicated in regulation of gene expression by oxygen. The existence of an inhibitor of Ofd1in S. pombe, allowed the identification of Ett1 (its homologue in S. cerevisiae). We showedthat Ett1 has a role similar to the one of Tpa1 in translational readthrough. A collaborativestructural and functional study of Ett1 revealed a conserved region, which binds a sulfate ion,and an unknown ligand. This region is important for the readthrough. However, thesubstrate(s) of Tpa1 remain(s) for the moment unknown, and the precise roles of Tpa1 andEtt1 in translation termination and in response to hypoxia remain to be deciphered.I also analyzed the NMD process by focusing more particularly on the mechanism thatallows the discrimination between a normal stop and a PTC (premature termination codon)and on the analysis of the post-translational modification of an important factor for the NMD,Upf1. This study revealed that, not only the region downstream of the PTC but also theupstream region participates to its recognition. We have tested several hypotheses on the roleof this upstream region, which confirmed its implication but did not reveal a definitivemechanism. In parallel, we started the study of the post-translational modifications of Upf1,and more particularly by phosphorylation. Indeed, the phosphorylation of Upf1 in human isvery important for the NMD process. We could confirm the presence of a modified form ofyeast Upf1 and we have demonstrated that it was localized between amino acids 153 and 971.This modification appeared to be highly labile. This prevented us to confirm definitively thatit was really a phosphorylation and to cartography precisely its location.

Le NMD (nonsense-mediated mRNA decay) est un mécanisme qui reconnaît et dégrade les ARNm portant un codon stop prématuré afin d'empêcher la synthèse de protéines tronquées qui pourraient avoir des effets néfastes pour la cellule ou tout simplement être non fonctionnelles. Cependant, dans un certain nombre de cas, selon la position du codon stop prématuré, la protéine tronquée qui serait synthétisée si le NMD n'existait pas, pourrait remplir complètement ou partiellement la fonction de la protéine sauvage. Il faut noter qu'un codon stop prématuré est retrouvé dans le gène responsable d'une pathologie dans un tiers des maladies génétiques et de nombreuses formes de cancer. Dans la plus grande majorité des cas, la maladie se développe non pas parce qu'une protéine tronquée non fonctionnelle ou instable est synthétisée, mais plutôt parce que le gène muté n'est pas exprimé du fait de l'intervention du NMD sur l'ARNm qui en dérive. Une nouvelle approche thérapeutique de ces maladies serait d'inhiber le NMD afin de permettre la synthèse de protéines tronquées fonctionnelles et sauver le phénotype clinique. Nous avons donc décidé de rechercher des inhibiteurs du mécanisme du NMD parmi des petites molécules chimiques. Pour cela, nous avons mis au point un système de criblage en culture cellulaire reliant l'efficacité du NMD dans une cellule avec une activité luciférase mesurable directement sur les cultures cellulaires, au moyen d'un luminomètre. A partir d'un premier criblage d'environ 1500 composés chimiques, nous avons identifié une nouvelle molécule capable d'inhiber efficacement le NMD. De façon intéressante, cette nouvelle molécule est capable également d'induire la synthèse de protéines entières à partir d'un ARNm portant un codon stop prématuré. Nous avons utilisé cet inhibiteur dans des expériences pour déterminer son potentiel thérapeutique sur des modèles cellulaires de maladies génétiques tels que la dystrophie musculaire de Duchenne, la mucoviscidose et le cancer. Nos résultats démontrent que l'inhibition du NMD peut être en effet envisagée comme une nouvelle approche thérapeutique pour des maladies causées par l'apparition d'une mutation non sens. Nous avons aussi identifié une autre molécule chimique capable d'inhiber le NMD et permettant de faire un lien entre efficacité du NMD et intégrité du cytosquelette.

Entre 10% et 30% des maladies humaines sont liées à l'apparition d'une mutation non-sens (PTC). La synthèse protéique est alors arrêté prématurément. Cet arrêt peut être inhibé par des molécules inductrices de translecture qui permettent l’incorporation d’un ARNt suppresseur naturel au niveau du PTC (translecture). Le ribosome peut alors franchir le PTC et restaurer l’expression de la protéine.Au cours de ma thèse, je me suis intéressé à la suppression des codons stop en caractérisant de nouvelles molécules inductrices de translecture et en analysant les mécanismes de la fidélité de la traduction.J’ai tout d’abord mis au point un système de criblage innovant avec lequel j’ai testé plus de 17 000 molécules et identifié la molécule TLN468. J’ai pu mettre en évidence que cette molécule est capable d’induire la réexpression d’une protéine p53 active.J'ai aussi caractérisé de nouveaux composés dérivés d’aminoglycosides. J’ai pu montré que le NB124 est capable d’induire l’apoptose de cellules tumorales via la réexpression de la protéine p53 tout ayant une toxicité bien plus faible que la gentamicine.En parallèle, j’ai développé une approche en molécule unique permettant d’étudier les erreurs programmées du ribosome (recodage). J’ai ainsi pu analyser la cinétique d’élongation des ribosomes eucaryotes et montré que l’initiation de la traduction sur un site d’entrée interne (IRES) ralentit le ribosome lors des premiers cycles d’élongation. / Nonsense mutations, also known as premature termination codons (PTCs) are responsible for 10% to 30% of all human genetic diseases. Nonsense translation suppression can be induced by readthrough inducers. The presence of such PTC leads to premature translation termination. These stop therapeutic strategies have emerged which attempt to use molecules that facilitate tRNA incorporation at the PTC (readthrough). The, translation continue in the same reading frame until the next stop codon. I first developed an innovative screening system I used to test more than 17,000 molecules and have identified one hit, TLN468 molecule. I have shown that this molecule is able to induce re-expression of an active p53 protein.I also characterized new compounds derived from aminoglycosides. I have shown that the NB124 induces apoptosis of tumor cells by re-expressing p53 protein while having a much lower toxicity than gentamicin.I developed a single molecule approach for studying the ribosome programmed errors (recoding). I was able to analyze the kinetics of elongation eukaryotic ribosomes and showed that the initiation of translation at an internal entry site (IRES) slows the ribosome during the first elongation cycle.

La terminaison de la traduction intervient lorsqu'un ribosome rencontre un codon stop. Ce dernier est alors reconnu par le facteur eRF1p qui, en interaction avec eRF3p, provoque l'arrêt de la synthèse protéique. L'efficacité de terminaison de la traduction est déterminée par le contexte nucléotidique du codon stop. Ainsi, le contexte peut reprogrammer le codon stop en permettant aux ribosomes d'incorporer un ARNt avec une forte efficacité, on parle alors de translecture. J'ai démontré que chez S. cerevisiae les six nucléotides en 3' du codon stop sont déterminants dans l'efficacité de translecture, et que le motif général -CA(A/G)N(T/C/G)A- permet d'obtenir les plus fortes efficacités de passage des codons stop. Mon travail met en évidence que la translecture, identifiée jusqu'à présent uniquement dans des gènes viraux, est aussi retrouvée dans des gènes nucléaires. Elle permet de modifier l'expression des protéines concernées, en fonction des conditions environnementales. C'est notamment le cas du gène PDE2, pour lequel j'ai montré que la translecture permet de contrôler la stabilité de la phosphodiestérase de l'AMPc, et module ainsi le niveau d'AMPc intracellulaire. L'augmentation du niveau d'AMPc observée dans une souche [PSI+] pourrait permettre d'expliquer la grande diversité des phénotypes associés au facteur [PSI+]. Durant ce travail d'autre gènes soumis à un mécanisme de translecture ont été identifiés : il s'agit des gènes IMP3 et BSC4. Pour certains des autres candidats identifiés par notre approche "sans apriori", l'efficacité de translecture est indépendante de la concentration en facteur eRF3p. Ce résultat pourrait signifier qu'au niveau de ces codons stop, le mécanisme de terminaison est indépendant du facteur eRF3p. Le crible d'une banque multicopie d'ADNg m'a permis d'identifier de nouveaux candidats intervenant dans la terminaison de la traduction, ces résultats suggèrent une relation fonctionelle importante entre le cytosquelette et la terminaison de la traduction. L'étude des modifications des ARNt à mis en évidence le rôle important de la pseudouridination aux positions 38 et 39 dans les mécanismes de recodage (translecture et décalage du cadre de lecture). Ce travail a donc mis en évidence que la terminaison de la traduction est un point de contrôle de l'expression de certains gènes chez S. cerevisiae.

La sénescence est considérée comme un mécanisme de suppression tumorale puisque les cellules potentiellement dangereuses, activent leurs protéines de sauvegarde pour arrêter leur prolifération. Les protéines de sauvegarde telles que RB et p53 sont activées suite à différents stress comme des dommages à l’ADN, le raccourcissement des télomères ou l’induction oncogénique. Les cellules sénescentes restent métaboliquement actives, subissent des modifications dans leur expression génique, et sécrètent des cytokines et des chimiokines qui ont des effets paracrines pro-oncogéniques, mais peuvent également contribuer à la stabilité de l’arrêt du cycle cellulaire dans la sénescence de façon autocrine. Une des particularités du phénotype sénescent est la dégradation sélective des protéines dépendante de l’ubiquitination et du protéasome. Parmi les cibles de dégradation se trouvent des protéines impliquées dans la biogenèse du ribosome, ainsi que celles d’autres voies cellulaires requises pour la croissance de cellules cancéreuses. Ceci est lié à un stress nucléolaire qui affecte la biogenèse du ribosome, menant à l’accumulation, dans le nucléoplasme ou le nucléole, de protéines ribosomiques. Ce comportement suggère que les ribosomes des cellules sénescentes seraient structurellement différents. Par conséquent, ceci pourrait entrainer des effets sur leurs capacités à réguler l’initiation, l’élongation et/ou la terminaison de la traduction des ARN messagers (ARNm). Par ailleurs, la déplétion de certaines protéines impliquées dans la ribogenèse, ainsi que la surexpression de protéines ribosomiques telles que RPS14/uS11 amènent à la sénescence. Malgré le stress nucléolaire et les défauts de ribogenèse associés à la sénescence, les cellules sénescentes présentent des niveaux de translecture du codon d’arrêt très diminué, suggérant l’existence de défauts de production de protéines allongées en C-terminal. Nous émettons l’hypothèse que les défauts de la ribogenèse affecteraient la fonction des protéines ribosomiques et des ribosomes. Cette perturbation aurait un impact sur le rôle de suppresseur tumoral de la sénescence. Le premier objectif de cette thèse consiste à démontrer le rôle de RPL22/eL22 en tant que régulateur du cycle cellulaire et inducteur de la sénescence. Le deuxième but est de démontrer que, malgré la perturbation nucléolaire, les ribosomes des fibroblastes sénescents reconnaissent les codons d’arrêt de façon plus efficace que les ribosomes des cellules transformées, ou des cellules normales en prolifération. Nous avons démontré que le phénotype de sénescence peut être induit quand l’expression de RPL22/eL22 est augmentée. RPL22/eL22 s’accumule principalement dans le nucléole, de manière différente de RPS14/uS11, dont l’accumulation est nucléoplasmique. En effectuant des essais kinases in vitro, nous avons montré que RPL22/eL22, tout comme RPS14/uS11, peuvent interagir et inhiber le complexe CDK4-Cycline D1 afin d’activer la voie de RB et établir l’arrêt du cycle cellulaire et la sénescence. Afin de démontrer la fidélité de la terminaison de la traduction dans les cellules sénescentes, nous avons utilisé un système de rapporteurs de luciférases, pour détecter les erreurs de translecture ainsi que pour avoir un contrôle interne du système. L’inactivation de la voie du suppresseur tumoral RB par surexpression de CDK4 ou de l’oncoprotéine virale E7, nous a permis d’observer l’augmentation de la translecture dans les cellules sénescentes. Tandis que l’activation de la voie de suppression tumorale RB, à l’aide du suppresseur de tumeur PML, de la surexpression de RPL22/eL22 et de RPS14/uS11, ainsi que de l’utilisation de Palbociclib (PD-0332991), un inhibiteur des kinases CDK4/6, a montré une réduction des erreurs de translecture. Ces résultats indiquent une nouvelle fonction des protéines du ribosome en tant que suppresseurs de tumeur, permettant d’inhiber les erreurs de translecture du codon d’arrêt de façon dépendante de la voie de RB. Ces travaux suggèrent que de petites molécules ou peptides pourraient simuler les fonctions inhibitrices de ces protéines ribosomiques afin de traiter certains cancers où la voie de RB est activable. / Senescence is considered a mechanism for tumor suppression since potentially dangerous cells activate their protective proteins to stop their proliferation. Safeguard proteins such as RB and p53 are activated as a result of stress such as DNA damage, telomere shortening or oncogenic induction. Senescent cells are metabolically active, they undergo changes in their gene expression and secrete cytokines and chemokines with pro-oncogenic paracrine effects, but which can also contribute to the stability of the senescent cell cycle arrest in an autocrine way. One of the peculiarities of the senescent phenotype is the selective ubiquitination and proteasome dependent-degradation of proteins involved in ribosome biogenesis and other cellular pathways required for cancer cell growth, leading to the accumulation, in the nucleoplasm or nucleolus, of ribosomal proteins. This behavior suggests that the ribosomes of senescent cells are structurally different. Therefore, this could have effects on their ability to regulate the initiation, elongation and/or translation termination of messenger RNAs (mRNAs). Moreover, the depletion of some proteins involved in ribogenesis, as well as the overexpression of ribosomal proteins such as RPS14/uS11 lead to senescence. Despite nucleolar stress and ribogenesis defects associated to senescence, global translation does not seem to be affected in senescence. Strikingly, senescent cells have reduced translational readthrough suggesting that they have defects in the production of C-terminal extended proteins. We hypothesize that defects in ribogenesis would affect the function of ribosomal proteins and ribosomes influencing the tumor suppressor role of senescence. The first aim of this thesis is to demonstrate the role of RPL22/eL22 as a regulator of the cell cycle and senescence inducer. The second aim of this thesis is to demonstrate that, despite the nucleolar disruption, the ribosomes of senescent fibroblasts recognize stop codons more efficiently than ribosomes from transformed cells, but also than ribosomes from proliferating normal cells. We found that the senescent phenotype can be induced by enhancing the expression of RPL22/eL22. RPL22/eL22 accumulates mainly in the nucleolus, unlike RPS14/uS11, whose accumulation is nucleoplasmic. By performing an in vitro kinase assay, we showed that RPL22/eL22, just like RPS14/uS11, can interact and inhibit the CDK4-Cyclin D1 complex in order to activate the RB pathway and establish cellular arrest and senescence. To assess translation termination accuracy in senescent cells, we used a system of luciferase reporters to measure the fidelity of translation termination. Inactivation of the RB tumor suppressor pathway using CDK4 or the viral oncoprotein E7 also increased readthrough in senescent cells while overexpression of PML, a tumor suppressor that activates the RB pathway, overexpression of RPL22/eL22 and RPS14/uS11, as well as the use of Palbociclib (PD-0332991), a CDK4/6 inhibitor, reduce readthrough errors. These results indicate a novel function of ribosomal proteins as tumor suppressors, making it possible to inhibit translational readthrough errors, in a RB-dependent pathway. This work suggests that small molecules or peptides could mimic the inhibitory functions of these ribosomal proteins in order to treat cancers where the RB pathway is activatable.