Le NMD (nonsense-mediated mRNA decay) est un mécanisme qui reconnaît et dégrade les ARNm portant un codon stop prématuré afin d’empêcher la synthèse de protéines tronquées qui pourraient avoir des effets néfastes pour la cellule ou tout simplement être non fonctionnelles. Cependant, dans un certain nombre de cas, selon la position du codon stop prématuré, la protéine tronquée qui serait synthétisée si le NMD n’existait pas, pourrait remplir complètement ou partiellement la fonction de la protéine sauvage. Il faut noter qu’un codon stop prématuré est retrouvé dans le gène responsable d’une pathologie dans un tiers des maladies génétiques et de nombreuses formes de cancer. Dans la plus grande majorité des cas, la maladie se développe non pas parce qu’une protéine tronquée non fonctionnelle ou instable est synthétisée, mais plutôt parce que le gène muté n’est pas exprimé du fait de l’intervention du NMD sur l’ARNm qui en dérive. Une nouvelle approche thérapeutique de ces maladies serait d’inhiber le NMD afin de permettre la synthèse de protéines tronquées fonctionnelles et sauver le phénotype clinique. Nous avons donc décidé de rechercher des inhibiteurs du mécanisme du NMD parmi des petites molécules chimiques. Pour cela, nous avons mis au point un système de criblage en culture cellulaire reliant l’efficacité du NMD dans une cellule avec une activité luciférase mesurable directement sur les cultures cellulaires, au moyen d’un luminomètre. A partir d’un premier criblage d’environ 1500 composés chimiques, nous avons identifié une nouvelle molécule capable d’inhiber efficacement le NMD. De façon intéressante, cette nouvelle molécule est capable également d’induire la synthèse de protéines entières à partir d’un ARNm portant un codon stop prématuré. Nous avons utilisé cet inhibiteur dans des expériences pour déterminer son potentiel thérapeutique sur des modèles cellulaires de maladies génétiques tels que la dystrophie musculaire de Duchenne, la mucoviscidose et le cancer. Nos résultats démontrent que l’inhibition du NMD peut être en effet envisagée comme une nouvelle approche thérapeutique pour des maladies causées par l’apparition d’une mutation non sens. Nous avons aussi identifié une autre molécule chimique capable d’inhiber le NMD et permettant de faire un lien entre efficacité du NMD et intégrité du cytosquelette. / MRNAs harboring a premature termination codon are rapidly degraded by a mechanism called nonsense-mediated mRNA decay (NMD). NMD is a surveillance pathway that prevents the synthesis of truncated proteins that could be harmful for the cell or simply be non-functional. However in some cases, depending on the position of the premature stop codon, the truncated protein that would be synthesized if there were no NMD would be partially or fully as functional as the wild-type protein. It is noteworthy that premature termination codons are found in approximately one-third of inherited genetic disorders and several forms of cancer. In most of cases the disease arises not because a non-functional or unstable truncated protein is synthesized, but instead because the degradation of the transcript by NMD leads to complete loss of protein production. Therefore, NMD inhibition could be an interesting therapeutic approach in some cases of nonsense-related genetic diseases in which functional truncated proteins can restore the clinical phenotype. We decided to search for NMD inhibitors among thousands of small molecules. We developed a cell-based screening method which couples NMD efficiency into the cell to a luciferase activity that can be measured directly into cells by a luminometer. From a screening of approximately 1500 compounds, we have identified one molecule capable of efficiently inhibit NMD. Interestingly, this compound is also able to induce the synthesis of full-length proteins from an mRNA bearing a premature termination codon. We evaluated the therapeutic potential of this compound in different cellular models of genetic disorders such as Duchenne’s muscular dystrophy, cystic fibrosis and cancer. Our results demonstrate that NMD inhibition in general can be considered as an useful therapeutic approach to rescue PTC consequences in genetic diseases provoked by the apparition of a nonsense mutation. We have also identified another compound that inhibits NMD and uncovers a relationship between the NMD efficiency and the integrity of the cytoskeleton.

Die Regulierung der Genexpression umfasst verschiedene Wege, die Genotyp und Phänotyp miteinander verbinden. RNA spielt dabei eine zentrale Rolle, wobei ihre Synthese und ihr Zerfall die Funktion und Halbwertszeit von Transkripten dynamisch beeinflussen. Die Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung hat unser Verständnis der Zellphysiologie revolutioniert, doch herkömmliche zelluläre Modelle werden der Komplexität von Säugetiergeweben nicht gerecht. Organotypische Ex-vivo-Kulturen (EVOC) spiegeln die Gewebephysiologie besser wider, doch ihre Verwendung für Genexpressionsstudien bleibt begrenzt. In dieser Arbeit wird diese Lücke durch zwei Projekte geschlossen. Erstens haben wir ex vivo SLAM-seq entwickelt, das EVOC mit Hochdurchsatzsequenzierung verbindet, um naszierende RNAs in Gewebeschnitten zu quantifizieren. Wir konnten zeigen, dass erwachsene Mäusegehirnschnitte 4sU in neue RNA einbauen, was die Identifizierung von Genen zur neuronalen Aktivierung ermöglicht. Darüber hinaus haben wir diese Methode für die räumliche Transkriptomik (ST) angepasst, was die kombinierte Analyse von Expressionsdynamik und Gewebearchitektur erleichtert. Ex vivo SLAM-seq wurde auch bei primären kolorektalen Karzinomen und Mausembryonen angewendet. Das zweite Projekt untersuchte den Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfall (NMD) im Mäusegehirn, einen wichtigen Regulationsmechanismus, für den es keine geeigneten Säugetiermodelle gibt. Mithilfe von EVOC hemmten wir NMD ex vivo und führten RNA-seq durch, um potenzielle NMD-Ziele und ihre mögliche Kopplung mit alternativem Spleißen zu identifizieren. ST von erwachsenen Hirnschnitten deutete auf eine regionsspezifische NMD-Regulierung hin, insbesondere im Hippocampus. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass EVOC eine leistungsstarke Plattform für die Untersuchung der Genexpressionsdynamik ist und neue Möglichkeiten zur Untersuchung der RNA-Regulation in komplexen Geweben bietet. / Gene expression regulation encompasses diverse pathways linking genotype and phenotype. RNA plays a central role, with its synthesis and decay dynamically shaping transcript function and half-life. High-throughput RNA-sequencing has revolutionized our understanding of cellular physiology, yet traditional cellular models fail to capture the complexity of mammalian tissues. Ex vivo organotypic cultures (EVOC) better reflect tissue physiology, but their use in gene expression studies remains limited. This thesis addresses this gap through two projects. First, we developed ex vivo SLAM-seq, integrating EVOC with high-throughput sequencing to quantify nascent RNAs in tissue slices. We demonstrated that adult mouse brain slices incorporate 4sU into new RNA, enabling the identification of neuronal activation genes. Additionally, we adapted this method for spatial transcriptomics (ST), facilitating the combined analysis of expression dynamics and tissue architecture. Ex vivo SLAM-seq was also applied to primary colorectal cancers and mouse embryos. The second project explored nonsense-mediated mRNA decay (NMD) in the mouse brain, a key regulatory mechanism lacking suitable mammalian models. Using EVOC, we inhibited NMD ex vivo and performed RNA-seq, identifying potential NMD targets and its possible coupling with alternative splicing. ST of adult brain slices suggested region-specific NMD regulation, particularly in the hippocampus. In summary, this thesis highlights EVOC as a powerful platform for studying gene expression dynamics, providing novel opportunities to investigate RNA regulation in complex tissues.